与豇豆荚长主效QTL Qpl-5.1紧密连锁的KASP标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种与豇豆荚长主效QTL Qpl-5.1紧密连锁的KASP标记及其应用。

背景技术

豇豆(Vigna unguiculata(L.)Walp.)(2n＝2x＝22)隶属豆科(Fabaceae)菜豆族(Trib.Phasoleae DC.)豇豆属(Vigna Savi)，是重要的一年生豆类植物。豇豆为自花授粉二倍体，基因组大小约620Mb。原产非洲，主要分布在热带和亚热带地区，有长豇豆(V.unguiculata ssp.sesquipedialis)和普通豇豆(V.unguiculata ssp.unguiculata)两个栽培亚种。首先野生豇豆在西非或东非被驯化成普通豇豆，随后向东传播，在东南亚或南亚地区进一步驯化出长豇豆。中国是豇豆的次生起源中心之一，早在明代《本草纲目》中就有记载，说明在明代豇豆就在我国被广泛栽培。而豇豆作为我国六大食用豆类作物之一，在我国种植面积超过800万亩，栽培面积和产量约占世界的五分之一。

长豇豆是我国重要的豆类蔬菜作物之一，全国除高寒地区外均有种植。嫩荚是长豇豆最主要的商品食用器官，荚长是其最重要的农艺性状之一。豇豆不同品种之间荚长变异范围非常大(10-120cm)，市场上一般要求商品种的荚长超过60cm。培育长荚豇豆优良品种是育种上至关重要的目标，但目前世界范围内对豇豆荚长的遗传基础了解不多，严重制约了豇豆荚长的分子育种。传统育种依据表型来进行荚长的选育，但荚长性状属于数量性状，受环境因素影响较大，因此单纯的依靠表型进行选择不仅准确率较低，且耗时费力，育种效率低。分子标记辅助育种技术则是通过基因型来选择，能有效提高选择效率，减轻田间工作量，缩短育种进程。

随着分子标记技术的发展，分子标记辅助育种为传统育种提供了快速、准确筛选复杂性状目标基因的新方法。在当前使用的分子标记中，SNP在基因组上分布广泛，因其数量多、多态性丰富而逐步成为遗传育种中较理想的标记类型。SNP标记可以通过重测序、芯片等方法获取基因型，其中竞争性等位基因特异性PCR分型法(Kompetitive AlleleSpecific PCR，KASP)，由于其分型快速、准确、高通量等优点越来越成为SNP基因分型的重要方法。目前，KASP标记在水稻、玉米、菜豆等作物上已经广泛用于遗传多样性分析、基因定位和分子标记辅助选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与豇豆荚长主效QTL Qpl-5.1紧密连锁的KASP标记及其应用，利用本发明提供的分子标记及其引物可实现对豇豆荚长QTL的辅助筛选，在短时间内进行高通量检测，与传统的基于表型选择相比，结果更为准确。通过KASP分子标记辅助育种，能大幅度提升育种效率，加快豇豆育种进程，便于快速筛选出长豆荚的豇豆优良品种。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种与豇豆荚长主效QTL Qpl-5.1紧密连锁的KASP标记，所述KASP标记包括2_04161KASP和2_46988KASP；

2_04161KASP的SNP位点呈A/C多态性，其核苷酸序列为：

CCAAATAAATTGAGGCCCATTACCAAGCAAACTAGCCCAAGATGCTGAAGAACAAGCCC A[A/C]CCCAACGCTAACAACACCCATAGCGACACCAACCGAACCCCTAAACCTCATAGA GCCCGA(SEQ ID No.1、SEQID No.2)；

2_46988KASP的SNP位点呈A/T多态性，其核苷酸序列为：

TTTTTTTTTATAGCTTATAAAAAAAATATTGATCTCATCGTTTCTTATGTATGTTACGAA[A/T]AGATGTTTTCCTTGATATTTTGGTGTGATATGAGTTTGACCGAAAGAAAATGAATATAA T(SEQ ID No.3、SEQ ID No.4)。

2_04161KASP的SNP位点呈A/C多态性即SNP位点为A或C。2_46988KASP的SNP位点呈A/T多态性即SNP位点为A或T。

本发明提供了与豇豆荚长主效QTL Qpl-5.1紧密连锁的SNP位点2_04161、2_46988，分别位于豇豆参考基因组品种G98基因组上5号染色体47603640bp处和48001410bp处。

将SNP转化为KASP标记进行验证，并利用该标记扩增需要鉴定的材料，根据其基因型判断样本荚长的有利等位变异，从而为豇豆荚长性状的遗传改良提供新的技术支撑。

一种检测所述KASP标记的引物，包括2_04161KASP引物和2_46988KASP引物，2_04161KASP引物为：

2_04161Primer1(上游分型引物1)：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAAGATGCTGAAGAACAAGCCCAA-3’(SEQ IDNo.5)；

2_04161Primer2(上游分型引物2)：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGATGCTGAAGAACAAGCCCAC-3’(SEQ IDNo.6)；

2_04161Primer1和2_04161Primer2为2条特异性引物，分别连接不同的荧光基团；

2_04161Primer_Common(下游引物)：

5’-TGTCGCTATGGGTGTTGTTAGCGTT-3’(SEQ ID No.7)；

2_46988KASP引物为：

2_46988Primer1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATCTCATCGTTTCTTATGTATGTTACGAAA-3’(SEQ ID No.8)；

2_46988Primer2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTCATCGTTTCTTATGTATGTTACGAAT-3’(SEQ ID No.9)；

2_46988Primer1和2_46988Primer2为2条特异性引物，分别连接不同的荧光基团；

2_46988Primer_Common：5’-CTCATATCACACCAAAATATCAAGGAAAACAT-3’(SEQ IDNo.10)。

作为优选，连接的荧光基团具体为：2_04161Primer1连接FAM基团，2_04161Primer2连接HEX基团；2_46988Primer1连接FAM基团，2_46988Primer2连接HEX基团。

一种检测豇豆荚长主效QTL的试剂盒，包括所述的2_04161KASP引物和2_46988KASP引物。

一种通过检测与豇豆荚长主效QTL Qpl-5.1紧密连锁的KASP标记进行选育不同豇豆荚长品种的方法，包括以下步骤：

S1：提取豇豆植株样本基因组DNA；

S2：以豇豆植株样本基因组DNA为模板，利用2_04161KASP引物、2_46988KASP引物进行KASP标记鉴定；

S3：读取KASP反应检测的荧光信号，若豇豆植株样本基因组DNA显示2_04161Primer1所带荧光基团信号A，2_46988Primer2所带荧光基团信号T，则该样本携带短荚性状基因型；若豇豆植株样本基因组DNA显示2_04161Primer2所带荧光基团信号C，2_46988Primer1所带荧光基团信号A，则该样本携带长荚性状基因型。

本发明首先对长荚豇豆和短荚豇豆两个亲本进行重测序，根据二者基因组序列鉴定SNP，将在两个亲本之间有多态的SNP标记转化为KASP标记，根据基因组位置随机均匀挑选标记合成引物，鉴定双亲F

作为优选，KASP反应检测的PCR反应程序为：94℃预变性15分钟，94℃变性20秒，61～55℃梯度复性60秒，每个循环复性温度降低0.6℃，55℃延伸60秒，循环10次；再94℃变性20秒，55℃复性60秒，延伸60秒，循环26次。

本发明的有益效果是：

本发明提供了与豇豆荚长主效QTL Qpl-5.1紧密连锁的SNP位点2_04161、2_46988，将SNP转化为KASP标记进行验证，并利用该标记扩增需要鉴定的材料，根据其基因型判断样本荚长的有利等位变异，从而为豇豆荚长性状的遗传改良提供新的技术支撑。

利用本发明提供的KASP分子标记及其引物进行不同荚长性状的辅助筛选，可以在短时间内进行高通量检测，大大节省人力物力，为豇豆遗传多样性分析、基因定位及未来的分子育种提供充足的标记资源。与传统基于表型选择相比，选择结果更准确，便于快速筛选出具有长荚性状的豇豆品种或品系，提高豇豆产量。结合KASP的选育方法也大大提高育种效率，从而加快豇豆育种进程。

附图说明

图1是2_04161、2_46988标记位点相关基因KASP标记分型图；

图2是2_04161、2_46988标记位点荚长等位变异差异图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明首先通过来自浙江省农业科学院蔬菜研究所的长荚豇豆‘G98’与短荚豇豆‘G323’构建其F

实施例1：

使用材料为浙江省农业科学院蔬菜研究所提供的220份浙江省豇豆地方品种。

于2022年在浙江海宁对该220份种质进行表型鉴定，田间试验采用完全随机区组设计。起垄种植，畦宽连沟1.5m，畦长40m。每畦种植2行，株距40cm，行距75cm，每份材料种植40株，田间肥水管理和生产上保持一致。参照《豇豆种质资源描述规范和数据标准》，每个株系随机挑选10个商品成熟期鲜荚，利用尺子精确测量嫩荚长，取平均值作为鉴定结果，最终得到嫩荚长的表型数据。

取各株系生长两周的幼苗叶片，采用CTAB方法提取基因组DNA，使用IntelliQube基因分型平台，利用2_04161、2_46988标记扩增上述群体的基因组DNA。PCR反应体系，包含模板DNA 0.8μl，2x KASP Master mix(LGC Genomics Ltd.,Hoddesdon,UK)0.75μl，Primermix 0.05μl(Primer1、Primer 2、Primer_Common引物先分别稀释至100μM，然后按照12％、12％和30％的比例混合在一起，其中ddH

利用IntelliQube机器进行荧光数据读取和分析，当豇豆样本基因组2_04161标记处DNA显示HEX信号(蓝色)，2_46988标记处DNA显示FAM信号(红色)，则即可判断该样本携带长荚性状等位变异CA(HapI)；若豇豆样本基因组2_04161标记处DNA显示FAM信号(红色)，2_46988标记处DNA显示HEX信号(蓝色)，则即可判断该样本携带短荚性状等位变异AT(HapII)。结合其荚长表型发现，携带CA(HapI)基因型的株系在2022年平均荚长分别为38.47cm，而携带AT(HapII)基因型的株系在2022年平均荚长分别为21.07cm，CA基因型可以增加荚长17.4cm，两种基因型株系的荚长之间达到显著水平(p＝1.55267E-06)；说明这两个标记可以指示荚长QTL Qpl-5.1。图1为2_04161、2_46988标记分型图，图2为携带2_04161、2_46988不同等位变异株系的荚长比较图。

表1部分220份豇豆地方种质的基因型及表型数据

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以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。