植物叶片叶肉细胞特异性表达的启动子PΔOsVSP1及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及植物叶片叶肉细胞特异性表达的启动子PΔOsVSP1及其应用。

背景技术

高等植物的生长发育是不同基因在不同时空有序表达和协同作用的结果。启动子是重要的顺式作用元件，通过与转录因子的结合进而决定了基因的表达模式与表达强度。根据启动子调控基因转录的模式不同将其分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三类。

组织特异性启动子是具有器官和/或组织特异性启动目的基因转录的启动子，在这类启动子的驱动下，基因的表达往往只限定某些特定的器官和/或组织部位，并表现出发育调节等特性。组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，采用组织特异性表达启动子来驱动目的基因表达可有效地避免由组成型表达启动子所带来的一些诸如代谢负担之类的负面效应。但是目前调控机理清楚且可用于作物遗传改良的组织特异性表达的启动子仍然较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有叶片叶肉细胞特异性启动子功能的DNA分子。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明所提供的了一种DNA分子，为如下1)或2)或3)：

1)SEQ ID No.1所示DNA片段；

2)与1)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

其中，SEQ ID No.1共由1954个核苷酸组成。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本发明还提供了如下生物材料：

B1)含有SEQ ID No.1限定的核酸分子的表达盒；

B2)含有SEQ ID No.1限定的核酸分子的重组载体；

B3)含有SEQ ID No.1限定的核酸分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B4)含有SEQ ID No.1限定的核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。上文中所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

上述生物材料中所述重组载体为在植物表达载体的多克隆位点或重组位点插入前述DNA分子得到重组质粒。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为将SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pCAMBIA1391Z载体的PstI和EcoRI酶切识别位点之间，且保持pCAMBIA1391Z载体的其他序列不变得到的载体。

进一步的，上述生物材料中所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因(来源于所述pCAMBIA1391Z载体)；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子(来源于所述pCAMBIA1391Z载体)。

本发明还提供了一种培育转基因植物的方法，是在出发植物中用前述DNA分子启动目的基因的表达，得到表达所述目的基因的转基因植物。

具体而言，所述表达所述目的基因为在叶片叶肉细胞中特异性表达所述目的基因。本发明与现有技术相比，具有如下优点：

(1)本发明的水稻叶片叶肉细胞特异性表达启动子为PΔOsVSP1来源于背景为水稻粳稻品种日本晴的突变体vsp1，该突变体启动子序列POsVSP1缺失8bp后产生了PΔOsVSP1，该启动子片段大小为1954bp，所述PΔOsVSP1启动子具有以下特点：a)位于OsVSP1基因的5’端及其上游；b)碱基长度为1954bp；c)具有引发转录的必要位点及转录起始点；d)在水稻叶片叶肉细胞中特异性表达。本发明提供启动子能够有效控制目的基因特异表达于叶片叶肉细胞，可避免外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响，诸如转基因漂移和花粉逃逸所带来的生物安全问题。

(2)本发明的含有叶片叶肉细胞特异表达启动子PΔOsVSP1的重组表达载体，转入了叶片叶肉细胞特异性表达的启动子，在重组表达载体的叶片叶肉细胞特异表达启动子PΔOsVSP1调控下，使下游基因定位于叶片叶肉细胞表达，为植物基因工程领域研究基因在叶片叶肉细胞特异表达提供了工具，具有广泛的应用前景。

通过实验证明：本发明提供启动子PΔOsVSP1可有效启动目的基因在水稻叶片叶肉细胞中的特异性表达，可避免目的基因在植物叶片其他细胞中持续表达所带来的不利影响，还可以用于植物叶片叶肉细胞生长发育相关基因的功能分析和鉴定。不仅为转基因水稻育种服务，也为长远的启动子改造和设计储备资源。

附图说明

图1为PΔOsVSP1启动子分子检测结果图。A为PCR结果；B为双酶切结果。M1和M2：DL-5000，1：条带大小为1954bp；2：BamHI和NcoI双酶切条带。

图2为表达载体pCAMBIA1391Z的T-DNA区图谱。其中，A为pCAMBIA1391Z载体，LB和RB分别表示为T-DNA的左边界和右边界；Hyg表示潮霉素抗性基因；MCS表示多克隆位点；NOS表示基因的终止子；B为pCAMBIA1391Z多克隆位点图

图3为GUS基因的组织化学染色结果图。其中，A代表叶片；B代表叶片横切图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pCAMBIA1391Z载体：记载于“Xuean Cui,Zhiguo Zhang,Yanwei Wang,Jinxia Wu,Xiao Han,Xiaofeng Gu,Tiegang Lu.TWI1 regulates cell-to-cell movement ofOSH15to control leafcell fate.New Phytol.2019Jan；221(1):326-340.”，公众可从中国农业科学院生物技术研究所处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

农杆菌AGL1：购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司，货号ZK296。GUS染色液(pH7.0)：溶质由100mM亚铁氰化钾、100mM铁氰化钾、0.5mM EDTA(pH8.0)、10mg/ml X-Gluc和0.1％(体积比)吐温20组成，溶剂为200mM PBS缓冲液。

下述实施例中所用引物均由深圳华大生物工程有限公司合成，上海生物工程有限公司测序。pTEAY-T1 Cloning Kit、Taq酶、Trans5α感受态及相关的试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶BamHI和NcoI、T

实施例1、水稻叶片叶肉细胞特异性启动子PΔOsVSP1的克隆

1、引物的设计

利用引物1和引物2作为扩增PΔOsVSP1启动子的引物，引物1加上BamHI的酶切识别位点序列GGATCC，下游引物加NcoI的酶切识别位点序列CCATGG。

引物序列如下：

引物1(上游引物)：5’-GGATCCCTGCATCCCAAATAAGAAGGAACT-3’；

引物2(下游引物)：5’-CCATGGGTCGACTCGGTCTCAGTGTCGCT-3’。

2、PCR扩增

以天根公司高效植物基因组DNA提取试剂盒提取的水稻vsp1突变体基因组DNA为模板，用步骤1中设计的上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物。

PCR反应条件如下：预变性：98℃10min；变性：98℃10s；退火：60℃5s；延伸：72℃2min30s，36个循环；总延伸：72℃10min。

3、PCR产物检测

PCR反应结束后，用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，检测结果如图1中A所示。

4、pEASYT1Cloning Vector-PΔOsVSP1载体构建

回收并纯化前述PCR产物，得到目的片段，再将目的片段与pEASY T1CloningVector连接，得到重组载体pEASY-PΔOsVSP1，最后将重组载体pEASY-PΔOsVSP1转化到大肠杆菌感受态Trans5α细胞中；经PCR和酶切检测筛选阳性克隆并进行测序验证，测序结果表明pEASY-PΔOsVSP1含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子，将该DNA分子命名为PΔOsVSP1启动子(共1954bp)。

SEQ ID No.1

CTGCATCCCAAATAAGAAGGAACTAGGAGATGACCAGAACAATGAGGGCGCCGCGGATATCACTAACCCAGGAATTGTTTGCGACGCCAGAACCAATTGTGCGTGAACCCCGGAGACGCGAGGGCACGACGACGAGGAGGTCTTGAGCCAAGGAGGCCACCAGGCGACCGTCGATCCACTGGTCAGTCCAGAAGAGAGTTGATTCACCATCTCTTGACACGAAGAATGTGACGCAGCAAACATGTCGGAGACACTCCGCTCAACGGGGGCCTTAAGGCCAGCCCAGTAGGGATGCAATGAGCACTGAAGCCAAAGCCAGCGAACTCGCAGGGCGAACCCACTAGTTTTAAAAAAACTAGATAATTTTACTTTTCTAGCTCTTTTGGACAGCTATATGCTCTTTTATCTATCTACATTCAATTTATTGTACACACAACCATGTGAGTTCATTGCCAAGTAAAAACCGAAATACTTAAGATCATTCATATACTTAAGAAAATGGCAAATTTTGCTATAGGACACCTAAAATTTGTGTAATTTGCTTATAGAAATTGTAAAAGCATGTCACGATTGAAAGCCATCCTAAAAGACTAATAATTTGCTAGAGGACACTTGCGACTCAATTGTAAAGATAAATTCTTAGGAAAAAAGATAATGCCCCTAGGAACACATGCTTCAAACATAGTGATAGAGTGAAGACTTAGAAATTATGCAATTCTAAATTAGCCATCACCCCAAATAGATCACTAGTATACATCGTATTCCATCTTCACTCAAGCCTTAGCTCAAAAGCTTTTCACCCTAGAGTCATTCTCATTCTTTTGAAGAATTTATTGTTCCAATTGAGTCGAAATTGTCCTCCAGCAAATTATCAGTTTTAGAGATGTCTTTTAGCCGTGAGATGTTTTTGCGATGTATATCAGCAAATTGTACAAATTTTGTGTGCCTTGTAGCAAAATTTGCCTTAAAAAAAAGAGTCAGCGTGATTCGATATAATAAAAATAAGAGTAGCGTGATTCAAGATATAATAAAAATAAGATTACCTGGTTCAAGGTGTACTTGTTTTTAAAACCACCCGTCATTTGATCGTTGCTTTTACCAGCCGTAGTCAAAATTTAAATCTTACTACTAAATTTAATTTTAAGGTTTTTTATCATAGTTTTTTTGGCATTAACATTTAAATCACTAACAACACAATATAAAAGTTCTCCTCTTCATTTATTCTTTCTCTCTTTATTATAAGAGCTATATAGCAAATTGTTTCAACATATATTTGTCGTGTGTTTTAGGCCCCATCGTTTAACCAAATATGGATAACACATTTATGTGTGTATTCTTAGCGATTTAAATACCAATGTTGAAAAATAAATTTTGATAAAAAAAACTTGAAAATCAAAATTTTAGAATTTAAATTTTAACAACTACCGATATTGTAGAGAAAAAGAGAAGATCTTATTTCATAAAGGGAGACTACGTAACGGTATTATCGTTTCGACGGAATAACTCACATCGGCATGAATCCTATAGGTATTAGATCTAATACATTCGATACCAAACATGATACCCCGTACGTATCATATCTGATATCATACTGACGTCAATATGATACTATACGTATCAGATCTGGTACCTACAATGCTAGATATGAACCCCATAAGAATTAGATCTGGCATCTAAATACCATGTTCACGTCATCATGTTACCATGATACCTCGTGCTATTCGGTTGAAACAGTATAACATTCTACGGTATTTCTGTATTTTAGATTGATATACAATCTTTTGTGGTGTTAGCACTAGCAGTCAAAGGAGTGGCCGAAGTGGGGACCATCTTCCTCCAGATTAAACCTTTTTTTTTCCCGGACTCGCACCGGACTTGCCGTCCGCCGCCATTGCGCGTCTCCGCCCAAACCCAAATGTTCGCCGACGGCGAGCGACACTGAGACCGAGTCGAC

实施例2、PΔOsVSP1启动子的功能验证

一、转基因株系的获得

1、表达载体的构建

用限制性内切酶BamHI和NcoI双酶切实施例1步骤4中的重组载体pEASY-PΔOsVSP1，得到PΔOsVSP1片段，如图1中B所示；用限制性内切酶BamHI和NcoI双酶切pCAMBIA1391Z载体(图谱如图2所示)，得到pCAMBIA1391Z载体骨架片段；将PΔOsVSP1片段与pCAMBIA1391Z载体骨架片段进行连接，获得重组质粒PΔOsVSP1-pCAMBIA1391Z。

重组质粒PΔOsVSP1-pCAMBIA1391Z为用SEQ ID No.1所示的PΔOsVSP1启动子序列替代pCAMBIA1391Z载体的BamHI和NcoI酶切识别位点之间的序列，且保持pCAMBIA1391Z载体的其他序列不变得到的重组质粒。其中，PΔOsVSP1启动子用于启动GUS基因的表达。

2、将重组质粒PΔOsVSP1-pCAMBIA1391Z导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌AGL1/PΔOsVSP1-pCAMBIA1391Z。

3、取步骤2制备的重组农杆菌AGL1/PΔOsVSP1-pCAMBIA1391Z悬于YEP液体培养基中培养，得到带有PΔOsVSP1-pCAMBIA1391Z的农杆菌的菌液置于-80℃保存待用。

YEP液体培养基：称取酵母浸粉10.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，溶于1L蒸馏水或去离子水中，121℃高压灭菌15分钟，冷却备用，pH7.0±0.2(25℃)。

实施例3、农杆菌介导的水稻“日本晴”的遗传转化及转基因植株的检测

S1.水稻愈伤组织诱导

水稻品种“日本晴”，由中国农业科学院生物技术研究所光合作用提升与C4水稻创制联合实验室保存。抗性愈伤组织筛选所需最适的潮霉素浓度为50mg/L。

将成熟的水“日本晴”种子去壳，然后依次用75％的乙醇处理1min，20％次氯酸钠给种子表面消毒15min；用灭菌水洗种子5次；将种子放在愈伤组织诱导培养基上，其中诱导培养基是在N6培养基基础上添加2.5mg/L 2，4-D，0.8g/L水解酪蛋白，0.3g/L脯氨酸，30g/L蔗糖和3g/Lphytagel；将接种后的种子置于黑暗处培养4周，培养温度为28±1℃.

S2.愈伤组织继代培养

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于继代培养基(营养成分与诱导培养基相同)，黑暗下培养3周，培养温度为温度28±1℃。

S3.准备农杆菌培养液

农杆菌培养在含有50mg/L卡那霉素的LA培养基(10g/L Tryptone,5g/L Yeastextract,10g/LNaCl,15g/L琼脂粉,pH 7.0)预培养农杆菌2d，温度为28±1℃；将农杆菌转移至悬浮培养基(N6培养基大量元素成分、N6培养基微量元素成分、N6培养基铁盐成分和N6培养基维生素成分基础上添加2.5mg/L 2,4-D，0.8g/L水解酪蛋白，0.3g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖和100μM乙酰丁香酮)，在摇床上以28℃，200rpm的条件培养2h。

S4.农杆菌侵染

将愈伤组织转移至灭好菌的三角瓶内；调节农杆菌的悬浮液至OD

S5.愈伤组织筛选培养

共培养后的愈伤组织用灭菌水洗涤10次；然后将愈伤组织浸泡在含200mg/L的特美汀的灭菌水中30min；转移愈伤组织至灭好菌的滤纸上吸干；再转移愈伤组织至选择培养基(N6培养基基础上添加2.5mg/L 2，4-D，0.3g/L脯氨酸，50mg/L潮霉素，200mg/L的特美汀，30g/L蔗糖和8g/L琼脂粉)上选择培养2次，每次培养2周。

S5.愈伤组织分化培养

将抗性愈伤组织转移至分化培养基上(MS培养基基础上添加2mg/L KT，0.2mg/LNAA，2mg/L 6-BA，0.2mg/L IAA，0.8g/L水解酪蛋白，0.3g/L脯氨酸，30g/L蔗糖和3g/Lphytagel)，光照(2000Lux)下培养(温度28±1℃)。

S6.生根培养

生根剪掉分化时产生的根，然后将其转移至生根培养基(1/2MS培养基基础上添加20g/L蔗糖和3g/Lphytagel)中，2000Lux光照培养3周(温度28±1℃)。

S7.组培苗移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持土壤湿润，获得的再生小苗即为T0代转基因植株。

S8.转基因植株的鉴定

提取步骤4获得的11株T0代转基因植株的DNA，利用引物3和引物4进行PCR扩增，其中引物3来自PΔOsVSP1启动子，引物4来自载体骨架。PCR程序同上。若PCR扩增得到大小为1954bp的DNA片段，表明T

引物3(上游引物)：5’-CTGCATCCCAAATAAGAAGGAACT-3’；

引物4(下游引物)：5’-GTCGACTCGGTCTCAGTGTCGCT-3’。

S9.转PΔOsVSP1启动子植株的GUS染色鉴定

收集S8中鉴定出的10株阳性转PΔOsVSP1启动子植株的幼根、茎、幼叶和颖壳，并将前述样品移入试管中；然后加入适量的GUS缓冲液浸没组织块，再加入GUS染色液，混匀后37℃下保存4-12h；染色结束后，将染色组织先置于75％乙醇漂洗脱色，再用50％和20％乙醇各浸泡20min以上，直到材料呈白色；最后在显微镜下观察，组织上蓝色即为GUS表达部位。

染色结果如图3所示。其中，A代表叶片；B代表叶片横切图。由此可见GUS基因只在转PΔOsVSP1启动子植株的所有叶片叶肉细胞中特异性表达(画框或箭头所示部分为蓝色部分)。由此可见，本发明的启动子PΔOsVSP1在水稻所有叶片叶肉细胞中均特异性表达，可用于启动目的基因在叶片叶肉细胞中特异性表达。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。