荧光探针化合物作为可特异性识别细菌的荧光探针的应用

技术领域

本发明涉及荧光探针应用领域，具体涉及一种荧光探针化合物作为可特异性识别细菌的荧光探针的应用。

背景技术

植物细菌性病害是除了真菌性病害之外种类第二多的植物病害，是农业生产中会遭遇到的常见问题。

因此，发展植物细菌病害的检测方法，以用于植物细菌性病害的诊断，监测以及研究对于农作物的保护至关重要。

目前，很多技术可以被用于检测植物病害病原菌，比如聚合酶链式反应技术(PCR)、酶联免疫法、免疫共沉淀技术、色谱质谱联用技术等。

但是，这些方法往往有着繁琐的样品前处理过程，需要昂贵的耗材和仪器并且无法实时可视化的进行检测。

而荧光探针技术往往可以提供超高的时空分辨率，可以实时地对于特定的靶标进行是检测和追踪，并且还具有操作简单，成本低廉等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种将荧光探针化合物作为可特异性识别细菌的荧光探针的新的应用。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种荧光探针化合物作为可特异性识别细菌的荧光探针的应用，所述荧光探针化合物具有式(I)所示的结构：

其中，在式(I)中，

R选自H、C

X选自I、BF

本发明的第二方面提供一种荧光探针试剂，该试剂中含有可特异性识别细菌有效量的活性成分，所述活性成分为前述第一方面所述的应用中的荧光探针化合物，所述活性成分的含量为1-99.99wt％。

本发明的第三方面提供一种荧光探针试剂盒，该试剂盒中含有前述第二方面所述的试剂。

本发明提供的将荧光探针化合物作为可特异性识别细菌的荧光探针的应用，能够实现对于植物致病菌的原位可视化检测，大大提高细菌检测的效率，具有优秀的市场推广和应用价值。

附图说明

图1是本发明中涉及到的小分子荧光探针化合物与不同浓度硝基还原酶反应后的浓度依赖性图；

图2是本发明中涉及到的小分子荧光探针化合物与两种细菌共孵育后的荧光成像图；

图3是本发明中涉及到的小分子荧光探针化合物被用于检测被细菌侵染的植物的荧光成像图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

如前所述，本发明第一方面提供一种荧光探针化合物作为可特异性识别细菌的荧光探针的应用，所述荧光探针化合物具有式(I)所示的结构：

其中，在式(I)中，

R选自H、C

X选自I、BF

本发明所述C

优选地，在式(I)中，R选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基；X选自I、BF

更优选地，在式(I)中，R为H，X为I。

本发明对制备前述化合物的具体方法没有特别的要求，本领域技术人员可以结合本发明的结构式特征和本领域的已知知识确定合适的合成路线以获得前述化合物。但是，为了获得纯度和收率更高的本发明的化合物，本发明提供一种方法制备本发明的化合物。

如前所述，本发明提供了一种制备第一方面中所述的化合物的方法，该方法包括：在溶剂存在下，将式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物进行接触反应，

其中，在式(II)中，R和X的定义与第一方面中所述的定义相同。

优选地，所述接触反应的条件包括：温度为40-120℃，时间为2-24h。更优选地，所述接触反应的条件包括：温度为60-100℃，时间为4-12h。

优选地，所述式(II)所示的化合物与所述式(III)所示的化合物的用量摩尔比为1：1-2。更优选地，所述式(II)所示的化合物与所述式(III)所示的化合物的用量摩尔比为1：1-1.2。

优选地，所述溶剂选自乙醇、乙腈和二氧六环中的至少一种。

本发明的制备方法中还可以包括将反应后得到的产物进行柱层析等精制或者后处理，本发明在此不再赘述，本领域技术人员不应理解为对本发明的限制。

本发明对所述式(II)所示的化合物与所述式(III)所示的化合物的来源没有特别的限制，本领域技术人员可以采用本领域内已知的方法确定合适的合成路线，也可以通过商购获得。本发明的后文中示例性地提供了一种获得方法，本领域技术人员不应理解为对本发明的限制。

根据一种特别优选的具体实施方式，所述式(II)所示的化合物的合成方法包括：在溶剂(优选乙腈)存在下，将物质A与碘代物进行反应；所述物质A的结构式为

优选地，所述细菌为植物致病菌。

优选地，所述细菌选自金黄色葡萄球菌、野油菜黄单胞菌、龟裂链丝菌和解淀粉欧文氏菌中的至少一种。

本发明合成的荧光探针化合物自身荧光猝灭良好，能够很好的避免自身荧光带来的干扰。在体外能够被硝基还原酶催化还原后显示出荧光信号的上升。在活体实验中，能够清晰的点亮侵入植物的细菌，可视化的检测植物细菌性病害。

本发明的第二方面提供一种荧光探针试剂，该试剂中含有可特异性识别细菌有效量的活性成分，所述活性成分为前述第一方面所述的应用中的荧光探针化合物，所述活性成分的含量为1-99.99wt％。

优选地，所述活性成分的含量为20-90wt％。

本发明的第三方面提供一种荧光探针试剂盒，该试剂盒中含有前述第二方面所述的试剂。

因此，本发明的方案能够便捷、快速、实时、可视化地监测植物细菌性病害的发生和发展，具有优秀的市场推广及应用价值。

以下将通过实例对本发明进行详细描述。以下实例中，在没有特别说明的情况下，使用的原料均为普通的市售品。

实施例1：荧光探针化合物NP的合成

1)中间体1的合成：将物质A(10mmol)和1ml碘甲烷加入到10mL乙腈溶液中，回流8h后，过滤反应液，再用乙腈稍微淋洗，所得固体即为中间体1。

2)探针NP的合成：将中间体1(1mmol)和对硝基苯甲醛(1mmol)加入到10ml乙醇中，回流8h；而后，减压蒸馏除去乙醇，利用柱层析法纯化残留物，即得到157mg荧光探针化合物NP。

荧光探针化合物NP：

测试例1

为验证本发明公开合成的荧光探针化合物的靶向能力和在检测植物细菌性病害的能力，应用荧光探针化合物NP进行了一系列实验，具体操作如下：

实验1：荧光探针化合物在PBS缓冲液中与不同浓度的硝基还原酶反应测试

将10μM的荧光探针化合物NP加入到含有500μM还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和不同浓度硝基还原酶(购自sigma，货号为N9284)的PBS缓冲液中，在30℃条件下孵育4min后扫描荧光发射光谱。

图1为荧光探针化合物NP与不同浓度硝基还原酶反应前后的荧光发射光谱。

由图1可以看出，荧光探针化合物NP的荧光被很好的猝灭，与硝基还原酶反应后在495nm光的激发下，在595nm处观察到了明显的荧光信号的上升，并且荧光信号的强度和硝基还原酶的浓度呈现出较好的线性关系。

以上实验说明本发明的荧光探针化合物能够被硝基还原酶开启，产生荧光信号。

实验2：荧光探针化合物用于细菌成像

金黄色葡萄球菌和野油菜黄单胞菌在LB培养基中，在37℃(金黄色葡萄球菌)或28℃(野油菜黄单胞菌)条件下培养至OD

结果如图2所示，在未经抑制剂处理的正常组中，可以看到明显的红色荧光并且和明场中的细菌重叠的很好，而抑制剂组的荧光发生显著降低。这证实了本发明的荧光探针化合物被硝基还原酶特异性的开启，并可以用于成像细菌。

实验3：荧光探针化合物被用于细菌侵染植物模型的成像

将油菜种子洒在装有育苗基质土的培养盆中(土壤湿度在65％以上)，用保鲜膜覆盖培养盆。种子萌发后，将油菜置于25℃、空气湿度50％、光照强度150μmol/m

结果如图3中所示，相较于未接种细菌的对照组，接种细菌的实验组出现了明显的荧光信号，并且荧光信号与菌斑位置高度重合，展现出良好的空间分辨率。

综上结果表明，本发明所提供的荧光探针化合物能够可视化的成像侵染植物的细菌，具备早期诊断植物细菌性病害和监测植物细菌性病害的发展的潜力。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。