一种检测水稻抗白叶枯病基因Xa1的SNP分子标记和检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学及水稻遗传育种领域，尤其涉及一种检测水稻抗白叶枯病基因Xa1的SNP分子标记和检测方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球有超过一半的人口而我国有三分之二的人口以稻米为主食，因此水稻的高产，稳产对我国粮食安全起着重要的保障作用。然而，水稻在其整个生育期中却经常受到病虫害的侵袭，威胁着水稻的产量和品质，给粮食生产带来巨大损失。其中，白叶枯病是水稻最主要的灾害性病害之一，是一种由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻变种引起的细菌病害，广泛分布于世界水稻产区，具有传播速度快、发生范围广、突变性强等特点。近年来，随着秸秆还田和高密度种植等栽培管理技术的推广，田间白叶枯病菌基数不断富集，造成其发生与危害日趋严重。

白叶枯病的防治主要靠化学试剂抑制病菌侵染，但防治效果较差，并且容易造成环境污染，破坏生态平衡。由于白叶枯病害的发生受多种因素的影响，化学试剂防治很难控制其传播。因此，挖掘水稻中抗白叶枯病基因并在育种中加以利用，是控制其病害和危害最经济有效的措施。目前，已鉴定的抗白叶枯病基因有38个，多数为显性基因，其中已克隆的基因有8个，分别为Xa1、Xa5、Xa27、Xa13、Xa3/Xa26、Xa4、Xa21和Xa23。

Xa1是比较早克隆的水稻白叶枯病抗性基因，是一个能对日本白叶枯病优势小种产生专化抗性的R基因，曾被广泛应用于水稻的抗性育种研究。Xa1编码的胞质蛋白由1802个氨基酸组成，含有NBS-LRR功能域，但没有明显的跨膜结构域，是诱导型的抗病基因，能够被创伤或病原菌胁迫所诱导，其表达量的增加可提高Xa1与无毒基因互作的效率，提高水稻对白叶枯病的抗性。随着分子生物技术的发展，分子标记种类和检测手段日趋完善，各种分子标记已经广泛应用于水稻育种研究中。常用的辅助育种分子标记一般为RFLP、RAPD、SSR、AFLP、CAPS或dCAPS，这些标记都需要凝胶电泳检测，非自动化、步骤繁多，耗时耗力，定性也不准确，且目前没有可用于快速鉴定Xa1基因的分子标记，这就需要更灵敏有效的检测方法。

KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，可用于检测SNP位点和InDel位点。本发明通过开发与Xa1紧密连锁的SNP分子标记，结合KASP检测技术，无需凝胶电泳检测，可以低成本、高通量、快速、精确的鉴定水稻育种群体中携带Xa1基因的株系，提高抗白叶枯病水稻新品种的选育效率。

发明内容

本发明的目的是开发一个检测水稻中抗白叶枯病基因Xa1的存在的SNP分子标记并应用于分子标记辅助选择育种，提高对大量水稻样本Xa1基因的筛选效率，从而提高抗白叶枯病水稻新品种的选育速率。

为实现本发明目的，本发明提供了一种检测水稻中抗白叶枯病基因Xa1的存在的SNP分子标记，所述SNP分子标记对应于日本晴的4号染色体物理位置第31637675位，此处碱基具有T或C多态性。

进一步地，抗白叶枯病基因Xa1的基因序列是位于日本晴的4号染色体物理位置第31638099-31644795位区间的序列。本发明已确定日本晴的4号染色体物理位置第31637675位碱基的突变(即T或C多态性)与该基因紧密连锁，因此可以用作检测水稻中抗白叶枯病基因Xa1的存在的SNP分子标记。

进一步地，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO：1所示序列的第138位的位置。所述SEQ ID NO：1所示的序列对应于日本晴的4号染色体物理位置第31637538-31637718位区间的序列。

本发明进一步提供了如本文所述的SNP分子标记在检测水稻中抗白叶枯病基因Xa1的存在中的应用。

本发明进一步提供了如本文所述的SNP分子标记在水稻育种中的应用。

本发明进一步提供了检测如本文所述的SNP分子标记的试剂在检测水稻中抗白叶枯病基因Xa1的存在中的应用。

本发明进一步提供了检测如本文所述的SNP分子标记的试剂在水稻育种中的应用。

本发明进一步提供了一种用于检测如本文所述的SNP分子标记的引物组，所述引物组包括对所述SNP分子标记的T碱基多态性特异的第一反向引物、对所述SNP分子标记的C碱基多态性特异的第二反向引物和通用正向引物，所述第一和第二反向引物的5′端各自连接有不同的荧光标记。

进一步地，所述不同的荧光标记可以选自FAM荧光标记或HEX荧光标记。

进一步地，所述第一、第二反向引物和通用正向引物的长度可以是10nt-50nt(例如，10-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt)。

进一步地，所述第一和第二反向引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO：2和3所示的序列，所述通用正向引物的核苷酸序列为如SEQ ID NO：4所示的序列，其中SEQ ID NO：2的序列的5′端连接有FAM荧光标记，SEQ ID NO：3的序列的5′端连接有HEX荧光标记。

本发明还提供了一种用于检测如本文所述的SNP分子标记的试剂盒，其包含如本文所述的引物组。

进一步地，所述试剂盒还包括用于进行PCR扩增的其他试剂，包括但不限于酶、dNTP、缓冲液等。

本发明还提供了一种检测水稻中抗白叶枯病基因Xa1的存在的方法，其包括以下步骤：

(1)从水稻叶片中提取待测样本的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，利用如本文所述的引物组或试剂盒对待测样本的基因组DNA中的目标序列进行PCR扩增；

(3)对扩增后的样品采用荧光检测平台进行检测，根据所得荧光信号所反应的SNP分子标记的多态性判断待测水稻中是否存在Xa1基因。

进一步地，在所述方法中，如果只检测到第一反向引物所对应的荧光信号，则判定测试的水稻样品中不存在抗白叶枯病基因Xa1；如果只检测到第二反向引物所对应的荧光信号，则判定测试的水稻样品中存在抗白叶枯病基因Xa1；如果同时检测到第一和第二反向引物所对应的荧光信号，则判定测试的水稻样品为Xa1杂合基因型。

进一步地，所述荧光检测平台可以是荧光定量PCR仪。

进一步地，在步骤(1)中，水稻叶片中提取基因组DNA采用可以简化的TPS方法。

进一步地，在步骤(2)中，采用KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术对目标序列(即SNP分子标记)进行检测。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“SNP(单核苷酸多态性)”或“SNP分子标记”是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的核酸序列多态性。基因组中具有单核苷酸多态性的位点即称为“SNP位点”或“SNP分子标记位点”。本文以水稻品种日本晴为参考对象描述SNP位点，但应理解，该SNP位点同样可位于任何其他水稻品种的相应位置上。

如本文中所使用的，“SNP分子标记对应于日本晴的4号染色体物理位置第31637675位”意指该SNP分子标记位于日本晴的4号染色体物理位置第31637675位，但应理解，该SNP分子标记的应用不限于检测日本晴中抗白叶枯病基因Xa1的存在，而是可以应用于任何其他水稻品种。

如本文中所使用的，“对SNP分子标记的T碱基多态性特异的第一反向引物”意指所述第一反向引物的序列与在所述SNP位点上包含碱基T的靶基因序列互补。

如本文中所使用的，“对SNP分子标记的C碱基多态性特异的第二反向引物”意指所述第二反向引物的序列与在所述SNP位点上包含碱基C的靶基因序列互补。

如本文中所使用的，“通用正向引物”意指与靶基因中除SNP位点以外的序列互补的引物。

如本文中所使用的，“靶基因”意指与抗白叶枯病基因Xa1紧密连锁的全部或部分序列。进一步地，抗白叶枯病基因Xa1的序列是位于日本晴的4号染色体物理位置第31638099-31644795位区间的序列。更进一步地，靶基因的序列是位于日本晴的4号染色体物理位置第31637538-31637718位区间的序列。更进一步地，靶基因的序列是SEQ ID NO：1所示的序列。

如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston-Crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本申请中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。相应地，术语“不互补”意指，两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火，无法形成双链体。如本文中所使用的，“不能完全互补”意指，一条核酸序列中的碱基不能够与另一条核酸链中的碱基完全配对，至少存在一个错配或缺口。

如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。

如本文中所使用的，并且如本领域技术人员通常理解的，术语“正向”和“反向”仅仅是为了便于描述和区分一个引物对中的两条引物；它们是相对而言的，并不具有特别的含义。

本发明的有益效果

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明已发现一个新的与Xa1紧密连锁、共分离的SNP位点。并且本发明已证实通过检测该SNP位点可以用来鉴定水稻中Xa1基因的存在与否。此SNP位点在现有技术未曾被报道过。

因此，本发明利用与Xa1共分离的特异性SNP位点，通过PCR技术使用荧光探针特异性识别基因位点(例如KASP检测技术)，对水稻材料中Xa1基因进行检测，可以快速准确的检测水稻中是否含有抗白叶枯病基因Xa1。解决了传统分子标记辅助选择PCR扩增后的酶切、电泳，该方法简单易行，其结果也准确可靠，在减少时间和人工成本的同时又可以高通量检测多个样品，大大提高了检测效率，加快了品种选育进程，对水稻抗白叶枯病的品种改良具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例中的分子标记开发流程图；

图2为本发明实施例中的在已知基因型的水稻品种中验证Xa1抗性基因的基于SNP分子标记的分型图；

图3和图4为本发明实施例中的对自然群体共77个单株进行Xa1抗性基因的基于SNP分子标记的分型图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例

本实施例鉴定了一种用于检测水稻中抗白叶枯病基因Xa1的存在的SNP分子标记。该分子标记的设计过程如图1所示。简言之，通过已克隆的目标基因Xa1确定物理位置，通过序列对比分析得到SNP位点，提取SNP位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行筛选测试，具体如下：

1、引物设计

根据已发表文献中信息，Xa1基因序列位于日本晴的4号染色体31638099-31644795区间序列，利用Xa1供体材料和非供体材料的重测序数据进行SNP位点挖掘。本发明确定了日本晴的4号染色体第31637675位碱基发生突变与该基因紧密连锁，提取该SNP位点所在的31637538-31637718区间序列(SEQ ID NO：1)，利用Batch Primer3对其进行引物设计。检测标记的引物组由3条引物组成，其中2条特异性引物的5′端分别连接FAM和HEX荧光接头序列，另外1条为通用引物，引物委托擎科公司合成。

表1：引物信息

2、样品检测

(1)水稻材料：本研究使用的材料包括携带Xa1等位基因的近等基因系材料中9A、沪科1A、荃9311A和GLA4；不携带Xa1等位基因的近等基因系材料五山丝苗、华占、硕恢70、卓20和C84；模拟杂合(卓20/中9A、硕恢70/沪科1A的混合DNA)；以及77份多样性亲本材料(包括已知含纯合Xa1基因的品种、含有其他抗白叶枯供体、普感材料、常见杂交稻、核心水稻育种材料)。供试材料种植于上海市金山实验基地，常规水肥管理。

(2)DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化TPS法，包括以下步骤：取4cm长的水稻叶片放在96孔板中，每个孔加入事先清洗烘干的钢珠2粒；每孔加入400ul的TPS，用盖子将96孔板盖严，于磨碎仪上功率70Hz震荡1min，将叶片甩下去，于65℃烘箱中烘20min；烘好后4000r/min离心30min，吸上清液200μL，把上清液加入到新的已加入200μL4℃预冷的异丙醇；4000r/min离心20min，倒掉异丙醇；沉淀加入质量分数75％的乙醇400μL，4000r/min离心15min，洗2次，倒去乙醇，超净台中倒扣晾干DNA；加入200μL灭菌超纯水溶解沉淀，灭菌超纯水中预先加入RNase，使其浓度为20μg/mL，DNA完全溶解后4℃保存备用。

(3)SNP分子标记扩增及反应体系：PCR扩增反应使用的扩增体系为10uL，包括2×PARMS Mix 5uL，40-60ng/uL的模板DNA 2uL，100uM两条特异性引物各0.015uL，100uM通用引物0.04uL，ddH

(4)SNP分子标记Xa1的基因分型：利用基于KASP反应原理及抗感材料的单碱基差异设计的分子标记引物，可高通量的对水稻材料进行Xa1抗性基因检测。反应完成后，在荧光定量PCR仪上进行读板，然后采用QuantStudio

(5)标记分型数据分析：为了验证Xa1位点的可靠性，根据上述检测方法，对含有Xa1基因的水稻材料和不含Xa1基因的水稻材料进行KASP反应验证，结果见表2。4份材料在测试位点检测结果为碱基C，为Xa1基因纯合供体；2份材料在测试位点检测结果为碱基T：C，为Xa1基因杂合供体；5份不含Xa1基因的材料在测试位点检测结果为碱基T，和已知结果一致，分型图如图2所示。

证明了本发明对Xa1分子标记能正常准确分型，可用于水稻抗白叶枯病基因Xa1的分子标记辅助选择育种。

表2：11份测试水稻标记分型数据

(6)分子标记的特异性和实用性检测

为检测本发明中标记的特异性及实用性，利用77份多样性亲本材料对标记的Xa1基因进行自然群体验证(材料名称和检测结果见表3)。在77份多样性亲本材料中，包括已知含纯合Xa1基因的品种、含有其他抗白叶枯供体、普感材料、常见杂交稻、核心水稻育种材料、分离群体材料。标记分型结果如图3和图4所示，23份材料在测试位点检测结果为碱基C，为Xa1基因纯合供体(分型图中标为红色)；3份材料在测试位点检测结果为碱基T：C，为Xa1基因杂合供体(分型图中标为绿色)；剩余51份材料在测试位点检测结果为碱基T，为不含Xa1基因的材料(分型图中标为蓝色)。结果表明分子标记Xa102在检测Xa1基因位点时具有高特异性，可准确并高效的鉴别水稻材料中是否含有Xa1基因。

表3：多样性亲本材料分型结果

需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。