替卡格雷及其载药复合胶原支架的制备和在制备治疗脊髓损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种脊髓损伤药物治疗领域。

背景技术

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是中枢神经系统的一种衰弱性疾病，会导致损伤区段以下的运动和感觉功能严重受损，包括完全性脊髓损伤与不完全性脊髓损伤。在过去二十年里，完全性脊髓损伤已成为中枢神经系统疾病领域的一个突出研究领域。

然而，事实证明，寻找有效的SCI治疗方法同样具有挑战性。其中一个主要障碍是，成人一旦失去成熟的神经元，神经元的再生和建立功能连接就会面临挑战，并且，脊髓损伤后，大量炎症细胞涌入损伤部位，加剧了周围区域剩余神经元的丧失，此外，瘢痕组织的形成也阻碍了神经轴突的再生。因此，与之相对应的一种治疗方法是旨在调节SCI后病变部位及其周围的微环境，其目的是减轻神经炎症反应，缓解胶质瘢痕的形成，并营造有利于内源性神经发生的环境。

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，在其横向静息状态下发挥着关键的监控作用，保护着中枢神经系统。SCI发生后，小胶质细胞通过延长其进程对损伤迅速做出反应，这些细胞迅速转变为活化表型，形态转变为变形虫状，并向病变部位聚集，活化的小胶质细胞通过吞噬细胞碎片和髓鞘碎片，并分泌趋化因子来招募外周免疫细胞，从而参与神经炎症反应。

活化的小胶质细胞通常被分为两种不同的表型：M1(促炎)和M2(神经保护)，其中，M1小胶质细胞在损伤初期占主导地位，可协调促炎反应并加剧组织损伤，它通过分泌细胞因子(包括TNF-α、IL-1β和其他促炎介质)动员炎症细胞，扩大炎症级联反应并导致组织变性；相反，M2小胶质细胞表现出修复表型，协调组织修复并启动抗炎过程，它通过分泌营养因子，包括IL-4、IL-10和TGF-β，促进神经元的分化和增殖。

可见，在脊髓损伤后，小胶质细胞的激活可以具有双刃剑的效应，但是当前的技术方案尚未充分解决如何调控这些激活的小胶质细胞，以将它们导向对轴突再生有益的表型(M2表型)，从而提高SCI患者的治疗效果。

针对脊髓损伤的治疗，现有技术也报道了一些技术，如公开号为CN117224470A的中国专利文献报道了一种包封过表达miR-216a-5p的人间充质干细胞的水凝胶的技术，CN117222409A公开了一种治疗活性分子。综上，虽然现有技术报道了各种各样的治疗方案，但仍没有涉及将抗血小板替卡格雷用于治疗脊髓损伤的相关技术报道。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种替卡格雷在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

本发明第二目的在于，提供一种包含所述替卡格雷的复合胶原支架(也称为胶原支架递送系统)及其制备方法和在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

本发明第三目的在于，提供一种缓解脊髓损伤药物。

一种替卡格雷在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

替卡格雷常用于抗血小板的治疗，本发明开发了其全新的用于治疗脊髓损伤的适应症用途。

本发明所述的应用，将所述的替卡格雷制备能够将脊髓损伤中的小胶质细胞从炎性M1表型转化为M2表型的治疗脊髓损伤药物。

本发明研究表明，所述的替卡格雷能够意外地诱导脊髓损伤疾病类型中的M1小胶质细胞向M2小胶质细胞转化活化，进而能够有效改善脊髓损伤修复效果。

本发明中，所述的替卡格雷包括其游离化合物或药学上可接受的衍生物。所述的衍生物可以是替卡格雷的酯化物、单晶、溶剂化物、共晶、衍生的盐等。

本发明所述的应用，将所述的替卡格雷和辅料联合制备药学上可接受的给药制剂；

本发明一种可列举的实施方式，将所述的替卡格雷和给药载体复合制备缓释给药制剂。进一步地，所述的给药载体为胶原支架。

本发明还提供了一种治疗脊髓损伤的负载有替卡格雷的复合胶原支架，包括胶原支架以及负载在其中的替卡格雷。

本发明所述的复合胶原支架，替卡格雷的负载量没有特别要求，例如可以为10μmol/L以上，进一步可以为50～500μmol/L。

本发明还提供了所述的治疗脊髓损伤的负载有替卡格雷的复合胶原支架的制备方法，获得胶原支架，并将其和替卡格雷复合，即得。

本发明研究表明，创新地将替卡格雷复合在胶原支架中，能够意外地实现协同，可以在实现缓释的前提下，还能够有效改善药效，降低治疗副作用。

本发明中，所述的胶原支架可以基于已知的方法获得，或者可以采购至商用掺。

本发明一种优选的胶原支架的制备步骤包括：

步骤(1)：

将胶原蛋白膜浸泡于乙酸溶液中，搅拌以获得均匀的胶原蛋白溶液，然后用碱(如NaOH)中和，于去离子水中透析，冻干后获得多孔胶原，将获得的多孔胶原切割成固体小颗粒，并浸入含有交联剂的溶液中进行交联，获得交联胶原，再次冻干，灭菌，保存待用；

步骤(2)：

先采用戊二醛溶液对步骤(1)中冻干后的交联胶原进行固定，然后用体积分数为30～100％的乙醇对其进行脱水，再经乙醇和乙酸戊酯的混合液进行萃取，乙酸戊酯储存，超临界二氧化碳萃取法干燥，溅射法镀金，即制成所述的胶原支架；

优选地，步骤(1)中，将胶原蛋白膜浸泡于0.1～0.5M的乙酸溶液中6～8h，并于0～20℃下搅拌15～20min；

优选地，步骤(1)中，所述的交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的混合液，其中，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的浓度为0.5～1mg/mL，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的浓度为0.5～1mg/mL；

优选地，步骤(2)中，将固定后的胶原先后于体积分数为30～95％的乙醇中脱水5～15min，再于乙醇中脱水；

优选地，步骤(2)中，脱水后的胶原依次在体积比为1～3:1～3的乙醇和乙酸戊酯混合液中萃取20～30min。

本发明还提供了一种治疗脊髓损伤药物，其包含药学有效量的替卡格雷。

优选的治疗脊髓损伤药物，其包含所述的负载有替卡格雷的复合胶原支架。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明开发了替卡格雷用于治疗脊髓损伤的全新制药用途。

本发明研究表明，替卡格雷能够将常驻免疫细胞小胶质细胞从炎性M1表型转化为神经保护性的M2表型，从而促进脊髓损伤后的轴突再生和康复，恢复脊髓损伤患者的神经功能。

(2)本发明创新地将替卡格雷负载在胶原支架上，如此能够意外地实现协同，可以在获得缓释的前提下，还能协同增效。

本发明的研究还表明，负载了替卡格雷的胶原支架递送系统，其能够下调12个与小胶质细胞活化相关的基因表达，上调20个与轴突导向相关的基因表达，并且替卡格雷组对于与GABA受体活性、神经元细胞体膜、神经元突起膜和脊髓背侧发育相关的通路也出现上调，这种对神经环境的微调改变促进了神经元向病变部位外围的强力趋化，并促进了轴突再生，最终明显改善了受影响小鼠的后肢运动能力，同时也减少了脊髓损伤治疗时可能造成的全身副作用。

附图说明

图1为实施例2中替卡格雷胶原支架系统在受伤部位的缓释研究；

图2为实施例3中替卡格雷胶原支架递送系统对小胶质细胞表型的调控作用；

图3为实施例4中替卡格雷胶原支架递送系统对脊髓损伤小鼠的各组织部位的小胶质细胞的荧光染色情况；

图4为实施例4中替卡格雷胶原支架递送系统对脊髓损伤小鼠的各组织部位的免疫荧光染色情况。

具体实施方式

为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。

本发明中所采用的替卡格雷购自selleck公司。

本发明研究表明，所述的替卡格雷能够促使脊髓损伤中的常驻免疫细胞小胶质细胞从炎性M1表型转化为神经保护性的M2表型，而对于促进脊髓损伤后的轴突再生和康复、恢复脊髓损伤患者的神经功能至关重要。

本发明还提供了一种将替卡格雷进行负载的方案，具体提供了一种负载了替卡格雷的胶原支架递送系统，其制备过程例如为：

(1)将胶原蛋白膜浸泡于乙酸溶液中，搅拌以获得均匀的胶原蛋白溶液，然后用NaOH中和，于去离子水中透析，冻干后获得多孔胶原，将获得的多孔胶原切割成固体小颗粒，并浸入含有交联剂的溶液中进行交联，获得交联胶原，再次冻干，灭菌，保存待用；

(2)先采用戊二醛溶液对(1)中冻干后的交联胶原进行固定，然后用体积分数为30～100％的乙醇对其进行脱水，再经乙醇和乙酸戊酯的混合液进行萃取，乙酸戊酯储存，超临界二氧化碳萃取法干燥，溅射法镀金，即制成用于负载替卡格雷的胶原支架。

上述的替卡格雷胶原支架递送系统的制备过程中，步骤(1)中将胶原蛋白膜浸泡于0.1～0.5M的乙酸溶液中6～8h，并于0～20℃下搅拌15～20min。

优选的，(1)中将胶原蛋白膜浸泡于0.5M的乙酸溶液中8h，并于4℃下搅拌15min。

优选的，(1)中所述的交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的混合液，其中，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的浓度为0.5～1mg/mL，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的浓度为0.5～1mg/mL。

优选的，(1)中所述的交联剂中，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的浓度为1mg/mL，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的浓度为0.5mg/mL。

优选的，(2)中，将固定后的胶原先后于体积分数为30％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的乙醇中脱水10min，再于体积分数为100％的乙醇中脱水20min。

优选的，(2)中，脱水后胶原依次在体积比为3:1、1:1、1:3的乙醇和乙酸戊酯混合物中萃取20～30min。

相对于采用某一特定浓度的溶剂对胶原进行洗脱的传统制备方法方法而言，本发明采用不同体积分数的乙醇对交联后的胶原进行脱水，可以将待分离的混合物溶解在不同浓度的乙醇溶液中，并通过逐渐提高乙醇浓度，使得溶解物沉淀到不同位置，有利于实现目标胶原的分离和纯化，单一浓度是无法达到这一效果的。

以下为具体的方案：

实施例1

胶原支架系统的制备

将牛肌腱组织来源的胶原蛋白膜浸泡在0.5M乙酸溶液中8h，温度为4℃，然后将溶液在搅拌器中搅拌15min以获得均匀的胶原蛋白溶液，并用4M NaOH中和，然后于去离子水中透析5天，冻干后获得多孔胶原，将得到的多孔胶原切割成0.2×0.5×0.5cm

冻干后的交联胶原先在体积分数为2％的戊二醛中固定40min，温度为4℃，随后，依次于30％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％体积分数的乙醇中脱水10min，再于体积分数的100％的乙醇中脱水20min，脱水后的胶原依次在体积比为3:1、1:1、1:3的乙醇和乙酸戊酯混合物中萃取20min，最后在乙酸戊酯中储存20min，经超临界二氧化碳萃取法干燥，溅射法镀金，即制成用于负载替卡格雷的胶原支架。

图像由HITACHI S-3000N扫描电子显微镜(日本日立公司)拍摄。

实施例2

替卡格雷胶原支架系统在受伤部位的缓释研究见附图1。

具体的试验操作如下：

通过物理吸附的方法将替卡格雷负载于实施例1中制备的胶原支架上，替卡格雷的浓度为200μmol/L，并将移植有该负载了替卡格雷的胶原支架递送系统的小鼠作为胶原支架组；以不添加替卡格雷胶原支架系统的小鼠作为对照组。

在以下的特定时间点分别从胶原支架组和对照组小鼠的病变部位采集组织样本：手术后0h、12h、24h、48h、72h，目的是利用LC/MS(液相色谱/质谱法)测量替卡格雷的剩余量，表1中列出了小鼠进行SCI脊髓损伤全横断造模后各个时间点，损伤区及周边组织中检测到的剩余替卡格雷的比例(％)。

检测过程的色谱条件为AgelaVenusil C18 Plus色谱柱(50×2.1mm，5μm)，流速为0.5mL/min；水相为0.1％甲酸水溶液，有机相为甲醇；色谱柱烘箱温度设定为40℃，自动进样器温度保持在8℃，进样针高度调整为2.00mm，每次进样量为5.00μL。

在高效液相色谱分析过程中，有机相比例设定如下：0min时为20％，2.5min时为98％，3.8min时为98％，4.0min时为20％，5.0min时为20％，替卡格雷的保留时间约为3.11min，使用替卡格雷标准品构建了标准曲线，根据峰面积对每个样品中的替卡格雷含量进行定量。

质谱分析采用正离子扫描电喷雾离子化(ESI)技术，采用选择反应监测(SRM)模式，喷雾电压为4000V(正极性)，毛细管温度为320℃，碰撞气体为高纯度氩气(纯度≥99.999％)，鞘气(50Arb)和辅助气体(15Arb)为氮气(纯度≥99.999％)，数据采集时间设定为5.0min，在正离子模式下检测到替卡格雷，其质量跃迁情况如下：MS1在523.19330，MS2在153.05090。

表1小鼠病变组织中替卡格雷的含量(％)随时间的变化情况

附图1中，图a为替卡格雷释放试验的工艺过程示意图；图b为胶原支架材料的示意图，每块约5×5×0.1mm；图c为本发明所制备的胶原支架的电子显微镜图；图d为替卡格雷的释放曲线；图e为替卡格雷的分子式；图f-g为病变部位组织中的替卡格雷含量的液相色谱图。

从附图1的各图中可以看出：

图a中显示，本实施例的方法是建立一个完整的SCI小鼠模型，以评估替卡格雷治疗对损伤活化小胶质细胞M1/M2表型调节和损伤神经元轴突再生的影响。

鉴于替卡格雷的血脑屏障通透性有限，本发明选择了原位给药，而为了实现替卡格雷的可控和持续释放，本发明采用胶原支架作为给药载体，将替卡格雷负载于所制备的胶原支架上，构成一种药物递送系统(图b、c)。

从图c中可以看出，本发明中所制成的胶原支架呈现出海绵状的多孔结构，由直径在10～30μm之间的界限分明的线性孔组成，孔隙率超过90％，表明它可能适合作为脊髓损伤后桥接病变部位的理想候选材料。此外，它还具有低抗原性、良好的生物相容性和植入后的生物降解性。

在SCI后的不同时间点(0、12、24、48、72h)，从损伤部位及其两侧1mm处分离组织样本，使用液相色谱-质谱法对剩余的替卡格雷含量进行定量，结果见图d～g。

图d中替卡格雷释放曲线显示，与对照组相比，负载了替卡格雷的胶原支架递送系统实验组实现了稳定、持续的替卡格雷释放，72h后仍可检测到20％的替卡格雷；图f～g的替卡格雷液相色谱法显示，病变部位组织中的替卡格雷在3.11min出现峰值，质谱法证实为替卡格雷。

总之，这些研究结果表明，与胶原支架结合物质为替卡格雷，且胶原支架可以在原位持续稳定地释放替卡格雷，为体内研究提供了一种可靠的给药系统。

实施例3

替卡格雷胶原支架递送系统对小胶质细胞表型的调控情况，具体如附图2所示。主要过程为：取单纯脊髓损伤后3天对照组以及替卡格雷治疗组小鼠损伤区以及两侧各1mm的脊髓组织，进行转录组测序，对于影响小胶质细胞迁移，以及轴突再生的基因进行分析。

附图2中，图a为替卡格雷组对小胶质细胞活化相关的基因(Microglia cellactivation)表达下调情况；图b为替卡格雷组对轴突导向(Axon guidance)相关的基因表达上调情况；图c为替卡格雷组与对照组小鼠病变周边部位CD68+、IBA1+细胞的免疫荧光结果；图d为GO分析结果。

上述的各图结果显示，替卡格雷组下调了12个与小胶质细胞活化相关的基因表达，上调了20个与轴突导向相关的基因表达，并且替卡格雷组对于与GABA受体活性(GABAreceptor activity)、神经元细胞体膜(neural cell body membrane)、神经元突起膜(neural projection membrane)和脊髓背侧发育相关(dorsal spinal corddevelopment)的通路也出现上调。

实施例4

替卡格雷胶原支架递送系统对脊髓损伤小鼠下肢功能恢复的促进情况，具体见附图3～4。

为了验证替卡格雷治疗后对于小胶质细胞分型的影响，采用免疫荧光染色检测损伤后3天，7天，2月时对照组、单纯支架组(vehicle)和替卡格雷负载支架组(ticagrelor)小胶质细胞分型，轴突再生以及损伤区瘢痕形成的情况。

附图3中，图a为3天后iNOS+(M1型小胶质细胞标志物)、IBA1+细胞免疫荧光图，标尺代表20μm；图b为3天后病变周边部位CD206+(M2型小胶质细胞标志物)、IBA1+细胞免疫荧光图，标尺代表20μm；图c为3天后病变周边部位P2RY12+、IBA1+细胞免疫荧光图，标尺代表50μm；图e-h为各组iNOS+IBA1+(图e)、CD206+IBA1+(图g,h)细胞与IBA1+细胞之比，各组P2RY12+iNOS+细胞数/mm

其中，图a、c、e、f中可以看出M1型小胶质细胞的数量减少，图b、d、g、h看出M2型小胶质细胞的数量增加。

附图4中，图a中组织免疫荧光染色显示，7天时，Tuj1+细胞(未成熟神经元标志物，用于评估新生神经元)分布于病变部位中心，瘢痕条代表50μm；图b中组织免疫荧光染色显示，Tuj1+纤维分布于病变部位0.5mm，标尺代表20μm；图c为替卡格雷治疗组2mpi时，再生的NF+轴突出现髓鞘化(被MBP+染色信号包裹，即髓磷脂包裹，为成熟神经元功能化的标志)，病变部位的MAP2+神经元(成熟神经元标志物)也被5HT标记(成熟神经元标志物)，病变部位的NeuN+神经元(成熟神经元细胞胞体标志物)可与突触前标记物SYN和突触后标记物PSD95共染；图d显示替卡格雷治疗组的BMS评分(用于评估脊髓损伤后小鼠下肢功能的评分)在42dpi时显著增加，并持续到56dpi；图e为组织免疫荧光染色显示纤连蛋白(FN，损伤区早期瘢痕修复的标志物)在3dpi的分布，标尺代表200μm；图f为组织免疫荧光染色显示CS56(硫酸软骨素，损伤区瘢痕的标志物)在2mpi的分布，标尺代表200μm；图g-h为各组Tuj1+细胞/纤维的数量；图i-j为各组纤连蛋白/CS56的荧光强度；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；ns，无统计学意义。

替卡格雷为一种P2RY12抑制剂，但不同的疾病，P2RY12的抑制会呈现完全不同的小胶质细胞表型诱导方式。本发明研究表明，在脊髓损伤疾病类型中，采用替卡格雷抑制P2RY12可以意外地表现出促使M1小胶质细胞转变为M2小胶质细胞作用，如此可以意外地缓解脊髓损伤。此外，本发明的上述实验结果表明，利用胶原支架将替卡格雷直接送入SCI小鼠的病变周边，从而调节了病变周边区域的小胶质细胞M2表型。重要的是，这种对神经环境的微调改变促进了神经元向病变部位外围的强力趋化，并促进了轴突再生，最终明显改善了受影响小鼠的后肢运动能力。