一种用于防治骨肉瘤切除后复发和/或转移的黄芪多糖-海藻酸盐-Ca2+交联凝胶及其制备方法
文献发布时间:2024-04-18 20:02:40
技术领域
本发明涉及医药技术领域,尤其涉及一种用于防治骨肉瘤切除后复发和/或转移的黄芪多糖-海藻酸盐-Ca
背景技术
黄芪多糖(Astragalus Polysaccharide,APS)是一类提取自黄芪植物的多糖类化合物,是一种水溶性多糖,是由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖等重复单元连接而成的杂多糖,相对分子质量在10000Da~50000Da左右。黄芪多糖具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护心脑血管、调节血糖等作用。
目前黄芪多糖已上市制剂仅有胶囊、颗粒等口服类制剂,如申请号为201110241423.9的发明专利,但是口服类制剂远远不能满足临床需要。
骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是一种来源于间充质干细胞的原发恶性肿瘤,多发于儿童和青少年。骨肉瘤临床上突出症状表现为肿瘤部位的疼痛,慢慢出现肿块进而引发跛行,还会引发一系列全身问题,如发热、贫血、肺转移引发的肺部症状和病理性骨折,骨肉瘤带来的诸多问题严重威胁人们的生命健康,所以如何治疗骨肉瘤成为急需解决的问题。
目前骨肉瘤的治疗方案主要是由术前化疗、手术切除病灶和术后化疗三部分组成,其中,手术治疗仍是骨肉瘤治疗的主要方式,但是手术部位局部残留的肿瘤细胞难以完全清除及易产生免疫抑制,从而导致肿瘤患者术后易发生肿瘤的复发和转移,所以需辅助术后化疗,但是化疗给患者的身体伤害也非常大,因此,研究并开发安全有效的治疗策略是预防肿瘤术后复发和转移亟待解决的关键问题。
发明内容
本发明提供了一种用于防治骨肉瘤切除后复发和/或转移的黄芪多糖-海藻酸盐-Ca
所述的用于防治骨肉瘤切除后复发和/或转移的黄芪多糖-海藻酸盐-Ca
所述的用于防治骨肉瘤切除后复发和/或转移的黄芪多糖-海藻酸盐-Ca
S1、将黄芪多糖和海藻酸盐按照一定的质量比溶解于一定质量的水中,在搅拌的作用下形成均匀的水溶液;
S2、将步骤S1中处理后的水溶液进行冷冻干燥处理,制得黄芪多糖-海藻酸盐冻干凝胶;
S3、将步骤S2中制备的黄芪多糖-海藻酸盐冻干凝胶完全浸没在CaCl
优选的,步骤S1中,所述的黄芪多糖的纯度≥90.0%。
优选的,步骤S1中,所述的海藻酸盐包括海藻酸钠、海藻酸钾和海藻酸铵。
优选的,步骤S1中,所述的黄芪多糖和海藻酸盐的质量比为0.25~4:1。
进一步优选,步骤S1中,所述的黄芪多糖和海藻酸盐的质量比为0.5~2:1。
黄芪多糖含量过低,则对骨肉瘤细胞的抑制作用不够显著;黄芪多糖含量过高,会因过多量的黄芪多糖沉积聚集,对海藻酸盐-Ca
优选的,步骤S1中,所述的水的质量与海藻酸盐的质量比为12.5~100:1。
优选的,步骤S1中,所述的搅拌的转速为300~500 rpm,搅拌时长为4~8 h。
优选的,在步骤S2进行冷冻干燥之前,先将步骤S1中制得的水溶液进行超声震荡,以排除水溶液中的气泡。
进一步优选,所述的超声震荡的时长为5~15 min。
优选的,步骤S2中,所述的冷冻干燥处理,具体包括:先进行冷冻处理,再进行冻干处理。
进一步优选,所述的冷冻处理为在-70~-90 ℃的温度条件下冷冻6~10 h。
进一步优选,所述的冻干处理为在-70~-90 ℃的温度条件下冻干10~15 h。
优选的,步骤S2中,所述的黄芪多糖-海藻酸盐冻干凝胶密封保存。
优选的,步骤S3中,所述的CaCl
优选的,步骤S3中,所述的交联时长为20~40 min。
优选的,步骤S3中,所述的清洗为清洗1~5 遍。
优选的,步骤S1和步骤S3中,所述的水为蒸馏水。
所述的用于防治骨肉瘤切除后复发和/或转移的黄芪多糖-海藻酸盐-Ca
所述药物的给药方式为:在骨肉瘤病灶切除位置进行填充或者伤口位置进行贴敷。
相对于现有技术,本发明的有益效果在于:
1. 本发明首次提出了黄芪多糖是治疗骨肉瘤方面的应用,为骨肉瘤的治疗方案提供了新思路。
2. 本发明首次提出了在骨肉瘤术后,通过将治疗骨肉瘤的药物填充在被切除的病灶位置或贴敷在伤口位置,以防治骨肉瘤切除后的复发和转移。
3. 本发明提供的黄芪多糖-海藻酸盐-Ca
附图说明
图1为实施例1制备的黄芪多糖-海藻酸钠冻干凝胶;
图2为实施例1制备的黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
图3为黄芪多糖对HOS细胞的杀伤作用图;
图4为黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
图5为黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
图6为实施例1制备的2%w/v黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
图7为黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
具体实施方式
下面通过实施例,对本发明的技术方案作进一步描述说明。实施例中所用原料均可市购或采用常规方法制备。
实施例1
2%w/v黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
S1、称取黄芪多糖400 mg,海藻酸钠400 mg,共同溶解于20 mL蒸馏水中,以500rpm的转速搅拌8 h形成均匀的水溶液;
S2、将步骤S1中制备的水溶液进行超声震荡15 min,完全排除所述水溶液中气泡;
S3、步骤S2中排完气泡的水溶液以每孔400 μL的体积注入48孔板中,将所述48孔板进行冷冻干燥处理,具体为先于-80 ℃的温度条件下冷冻8 h,再于-80 ℃的温度条件下冻干12 h,冷冻干燥结束后取出黄芪多糖-海藻酸钠冻干凝胶并密封保存,所述黄芪多糖-海藻酸钠冻干凝胶的外观如图1所示;
S4、将步骤S3中得到的400 μL黄芪多糖-海藻酸钠冻干凝胶完全浸没在400 μL的5%w/vCaCl
实施例2
1%w/v黄芪多糖-海藻酸-Ca
S1、称取黄芪多糖200 mg,海藻酸钠400 mg,共同溶解于20 g蒸馏水中,以400 rpm的转速搅拌6 h形成均匀的水溶液;
S2、将步骤S1中制备的水溶液进行超声震荡10 min,以完全排除所述水溶液中的气泡;
S3、步骤S2中排完气泡的水溶液以每孔400 μL的体积加入48孔板中,将所述48孔板进行冷冻干燥处理,具体为先于-80 ℃的温度条件下冷冻8 h,再于-80 ℃的温度条件下冻干12 h,冷冻干燥结束后取出黄芪多糖-海藻酸钠冻干凝胶并密封保存;
S4、将步骤S3中得到的400 μL黄芪多糖-海藻酸钠冻干凝胶完全浸没在400 μL的2%w/vCaCl
实施例3
0.5%w/v黄芪多糖-海藻酸-Ca
S1、称取黄芪多糖100 mg,海藻酸钠400 mg,共同溶解于20 g蒸馏水中,以400 rpm的转速搅拌6 h形成均匀的水溶液;
S2、将步骤S1中制备的水溶液进行超声震荡5 min,以完全排除所述水溶液中的气泡
S3、步骤S2中排完气泡的水溶液以每孔400 μL的体积加入48孔板中,将所述48孔板进行冷冻干燥处理,具体为先于-80 ℃的温度条件下冷冻8 h,再于-80 ℃的温度条件下冻干12 h,冷冻干燥结束后取出黄芪多糖-海藻酸钠冻干凝胶并密封保存;
S4、将步骤S3中得到的400 μL黄芪多糖-海藻酸钠冻干凝胶完全浸没在400 μL的2%w/vCaCl
测试分析
1. 黄芪多糖抑制骨肉瘤细胞HOS的增殖效果试验
称取5 mg黄芪多糖溶于适量完全MEM培养基至浓度40 mg/mL,梯度稀释至浓度10mg/mL、2500 μg/mL、625 μg/mL、156.25 μg/mL、39.06 μg/mL、9.76 μg/mL、2.44 μg/mL、0.61 μg/mL以备用。骨肉瘤HOS细胞培养在完全培养基中(MEM空白培养基含10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素),消化收集后,96孔板中每孔接种约5000个细胞;24 h后,更换培养基,使细胞分别接触含有不同黄芪多糖浓度的完全MEM培养基,对照组换不含黄芪多糖的新鲜完全MEM培养基,培养48 h后每孔加10 μL(5 mg/mL in PBS)的MTT(3 (4,5二甲基噻唑2)2,5二苯基四氮唑溴盐),继续培养4 h后除去完全MEM培养基并加100 μL的DMSO充分溶解沉淀后,酶标仪检测570 nm和630 nm处吸光度。
使用Graphpad Prism 8软件处理所得数据,图3所示,黄芪多糖在溶液中对骨肉瘤细胞HOS呈现出浓度依赖性的抑制作用,当黄芪多糖不低于10000 μg/mL时,HOS细胞几乎无活性。
2. 微观形貌表征
使用环境扫描电子显微镜拍摄实施例1制备的黄芪多糖-海藻酸盐冻干凝胶和黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
分别将黄芪多糖-海藻酸钠冻干凝胶和黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
结果如图4所示,黄芪多糖-海藻酸钠冻干凝胶(APS/ALG)呈多空疏松海绵状,黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
3. 实施例1制备的黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
称取黄芪多糖溶解于蒸馏水中,配制10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625mg/mL的标准溶液,将可溶糖含量检测试剂盒中试剂1和溶液2按比例混合得到工作液,取30 μL标准溶液与50 μL工作液混匀,缓慢加入浓硫酸200 μL,95 ℃水浴15 min,检测620 nm吸光度,绘制标准曲线。
取实施例1制备的2%w/v黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
从所述的100 μL待测样品中取30 μL,与50 μL工作液混匀,缓慢加入浓硫酸200 μL,95 ℃水浴15 min,检测620 nm吸光度,根据绘制的标准曲线计算待测样品含量。
使用Graphpad Prism 8软件处理所得数据,根据黄芪多糖的累计释放量与初始黄芪多糖总含量比值绘制黄芪多糖的释放曲线,结果如图6所示,2%w/v黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
4. 黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
将实施例1、实施例2和实施例3制备的黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
HOS细胞培养在完全培养基 (MEM空白培养基含10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素) 中,消化收集后,24孔transwell板中每孔接种约10000个细胞24 h后,更换培养基。阴性对照组加入2 mL空白的完全培养基;实验组在transwell小室中放入杀菌后的实施例1、实施例2、实施例3制备的黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
使用Graphpad Prism 8软件处理所得数据,如图7所示:与阴性对照组和阳性对照组相比,黄芪多糖-海藻酸钠-Ca
应理解,以上实施例仅用于说明本发明内容而不用于限制本发明的保护范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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