一种基于乳铁蛋白和果胶的二氢槲皮素纳米水凝胶及其功能性酸奶

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种基于乳铁蛋白和果胶的二氢槲皮素纳米水凝胶的制备方法和添加二氢槲皮素的功能性酸奶的制备方法。

背景技术

二氢槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，广泛存在于许多植物中，如槲树、槲皮、栀子花等，具有显著的抗氧化、抗炎、抗菌以及抗肿瘤活性，还可以调节血糖和降低血脂，对人体健康具有重要的保健功能。2021年，我国批准二氢槲皮素作为新食品原料，可以应用于饮料(≤20mg/L)、发酵乳和风味发酵乳(≤20mg/kg)、可可制品、巧克力和巧克力制品(≤70mg/kg)。二氢槲皮素作为食品和饮料中的强大抗氧化剂有很多用途，因为它可以改善饮料的颜色稳定性，延长保质期并增强风味。二氢槲皮素不仅被认为是一种有前途的免疫健康成分，它还可以用于抗衰老和防紫外线的化妆品应用中。然而，尽管有这些潜在的功能特性，二氢槲皮素的水溶性差和生物利用度低等问题限制了其在食品中的应用，因此需要提高二氢槲皮素的水溶性及稳定性，目前成功应用于提高二氢槲皮素生物可及性的载体有纳米颗粒、纳米分散体、纳米乳和脂质纳米囊泡等。然而，上述载体在递送二氢槲皮素时均存在不同的缺点。乳液系统很容易受到温度、pH和其他外部条件的影响，这可能导致包埋物的损失；脂质体纳米囊泡的制备方法较为复杂，且其脂肪含量较高，不适合特定人群食用。

乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)，又称“乳运铁蛋白”，是最初从牛乳中分离得到的生物活性物质，它是一种铁结合性糖蛋白，属于铁转运蛋白家族中的成员之一。乳铁蛋白属广谱抑菌剂，既可抑制需铁的革兰氏阴性菌，如大肠菌群、沙门氏菌等，也可抑制革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌。乳铁蛋白还具有一定的抗氧化能力，主要是通过螯合易引起氧化的铁离子，抑制铁诱导脂质过氧化过程中产生的硫代巴比妥酸和丙二酸，阻止氧自由基生成。此外，乳铁蛋白在调整肠道菌群、抗病毒、调节机体免疫反应、刺激肠粘膜细胞再生等方面也具有积极作用。果胶是一类广泛存在于植物细胞壁的初生壁和细胞中间片层中的杂多糖，可作为一种胶凝剂、稳定剂、组织形成剂、乳化剂和增稠剂广泛应用于食品工业中。同时，果胶也是一种水溶性的膳食纤维，具有增强胃肠蠕动，促进营养吸收的功能，对防治腹泻、肠癌、糖尿病、肥胖症等病症有较好的疗效。

酸奶是将鲜牛奶经超高温灭菌后接种乳酸菌发酵而制成的一种乳制品。由于发酵过程中产生了乳酸，牛奶的酸度逐渐下降，当pH达到4.6左右时，牛奶中的酪蛋白就会缓慢地沉降下来，形成细腻的凝冻，体系黏度也有所提高。与鲜牛奶相比，酸奶的营养成分更加趋于完善，内含的乳糖被部分分解为半乳糖和葡萄糖，这有利于乳糖不耐受人群对乳糖的消化吸收。不仅如此，乳酸的发酵过程中会产生一些生理活性物质，比如有机酸、芳香物质、活性酶、乳酸菌增殖因子及乳酸菌等，对机体功能有显著的调节作用，这些物质在维持肠道正常菌群平衡，调节肠道有益菌群达到正常水平、降低胆固醇和预防衰老等方面都有重要的作用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于乳铁蛋白和果胶的纳米水凝胶，并将其作为提高二氢槲皮素水溶性及环境稳定性的载体，并将上述纳米水凝胶添加至牛奶中，经发酵制备出含二氢槲皮素的功能性酸奶。

本发明提供的一种基于乳铁蛋白和果胶的纳米水凝胶，其中成分包括：乳铁蛋白0.25％～0.75％(w/v)、果胶0.25％～0.75％(w/v)、二氢槲皮素0.017～0.025％(w/v)。

所述的乳铁蛋白为牛乳铁蛋白(Bovine lactoferrin,BLF)，分子量80kDa，为含有689个氨基酸残基的单链糖蛋白，等电点约为8.5，高于绝大多数的牛乳蛋白质(等电点约为5)，使其能够在较大范围的pH体系中携带正电荷。所用BLF的灰分含量为0.350％，脂肪含量为0.30％，铁含量为12.91Mg/100gms，纯度为96.93％。

所述的果胶为低酯果胶，其酯化度小于50％。

所述的二氢槲皮素，纯度≥90％。

本发明提供的一种基于乳铁蛋白和果胶的二氢槲皮素纳米水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)乳铁蛋白水溶液的制备。

将一定量的乳铁蛋白粉末溶解于蒸馏水中，制成浓度为1％(w/v)的乳铁蛋白储备液。具体步骤包括：首先向干粉中加入一定量的蒸馏水，使其成为糊状，然后加入剩余蒸馏水，并用磁力搅拌器搅拌，直至粉末全部溶解，而后放入4～8℃冰箱水合8～12h，制成浓度为1％的乳铁蛋白水溶液；将配置好的乳铁蛋白水溶液在80～90℃下加热使乳铁蛋白充分变性，冷却至室温，待用。

(2)果胶水溶液的制备。

将一定量的果胶粉末溶解于蒸馏水中，制成浓度为1％(w/v)的果胶储备液。具体步骤包括：将一定量的蒸馏水放置于磁力搅拌器上，边搅拌边加入果胶粉末，然后将该溶液置于65～75℃水浴锅中加热至少20min，直至果胶完全溶解，制成浓度为1％的果胶水溶液，冷却至室温，待用。

(3)二氢槲皮素无水乙醇溶液的制备。

称取一定量的二氢槲皮素粉末置于棕色离心管中，加入一定量的无水乙醇并涡旋至少10min使之充分溶解，制成浓度为5％(w/v)的二氢槲皮素储备液。

(4)二氢槲皮素纳米水凝胶的制备。

首先将乳铁蛋白溶液和果胶溶液按照浓度比0.25％～0.75％:0.75％～0.25％(w/v)混合，总浓度为1％(w/v)，以制备乳铁蛋白-果胶静电复合物；使用2mol/LNaOH溶液将上述溶液的pH调节至5～7，以制备纳米水凝胶。然后向上述水凝胶体系中加入二氢槲皮素无水乙醇溶液，使其浓度为0.17～0.25mg/mL，样品放置于磁力搅拌器上搅拌至少20min，以确保二氢槲皮素被纳米水凝胶包埋。

本发明制得的基于乳铁蛋白和果胶的二氢槲皮素纳米水凝胶可以应用于酸奶的制备。

本发明还提供一种基于乳铁蛋白和果胶的二氢槲皮素纳米水凝胶的功能性酸奶，制备方法包括：

量取一定量巴氏杀菌鲜牛奶置于烧杯中，加入6％～8％(w/v)白砂糖和5～10mL上述制得的二氢槲皮素纳米水凝胶，将烧杯置于40～45℃水浴锅中，磁力搅拌至少20min使其混合均匀，在无菌操作条件下加入浓度为0.1％～0.3％(w/v)的发酵剂，磁力搅拌至少20min使其混合均匀；将上述混合料液移至35～40℃恒温培养箱内发酵4～8h得到发酵液，将发酵液移入4～8℃冰箱内，经4～6h发酵成熟后，制得含有二氢槲皮素的功能性酸奶制品。

本发明的有益效果：

本发明方法简单易行、节省能源，能够有效地提高二氢槲皮素在水中的溶解度并提高其稳定性；制得的含有功能活性物质二氢槲皮素的新型发酵乳制品，强化了牛奶中的乳铁蛋白含量，果胶亦可作为使物促进乳中益生菌生长繁殖，提高了酸奶的营养价值和感官品质，且不会影响酸奶的黏度；经测试纳米水凝胶中二氢槲皮素的包埋率达到64.37％～88.04％，装载率达到2.99％～3.22％，有效地提高了二氢槲皮素在水中的溶解度并提高其稳定性。

附图说明

图1为本发明实施例对照组和实验组酸奶的黏度对照示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

本发明所述二氢槲皮素纳米水凝胶经离心(12000rpm，10min)除去游离二氢槲皮素，用一定量的无水乙醇提取上清液中的二氢槲皮素，使用紫外分光光度计在275nm波长下测定其吸光度，数值代入标准曲线即可得到上清液中二氢槲皮素的浓度，进而得出纳米水凝胶对二氢槲皮素的包埋率和装载率，具体计算公式如下：

式中，M

将二氢槲皮素纳米水凝胶放置于365nm波长的紫外灯下照射12h，按上述方法测定经紫外光照射后二氢槲皮素的质量，辐照后体系中二氢槲皮素的质量与辐照前质量的比值即为保留率，可表示二氢槲皮素被纳米水凝胶包埋后的光稳定性。

将二氢槲皮素纳米水凝胶放置于85℃水浴锅中加热30min，按上述方法测定经加热后二氢槲皮素的质量，加热后体系中二氢槲皮素的质量与加热前质量的比值即为保留率，可表示二氢槲皮素被纳米水凝胶包埋后的热稳定性。

实施例1：

本实施例提供的一种基于乳铁蛋白和果胶的二氢槲皮素纳米水凝胶，制备方法如下：

(1)乳铁蛋白水溶液的制备

首先向52mg乳铁蛋白干粉中加入一定量的蒸馏水，使其成为糊状，然后加入剩余蒸馏水，蒸馏水总量为10mL，用磁力搅拌器在650转速下磁力搅拌40min，直至粉末全部溶解，而后放入4℃冰箱水合12h，将配置好的乳铁蛋白水溶液在80℃下加热30min，使乳铁蛋白变性，冷却至室温，待用。

(2)果胶水溶液的制备

将一定量的蒸馏水放置于磁力搅拌器上，边搅拌边加入果胶粉末，然后将该溶液置于65℃水浴锅中加热20min，直至果胶完全溶解，制成浓度为1％的果胶水溶液，冷却至室温，待用。

(3)二氢槲皮素无水乙醇溶液的制备

称取一定量的二氢槲皮素粉末置于棕色离心管中，加入一定量的无水乙醇并涡旋10min使之充分溶解，制成浓度为5％的二氢槲皮素储备液。

(4)二氢槲皮素纳米水凝胶的制备

首先将热变性的乳铁蛋白溶液和果胶溶液按照质量浓度比0.5％:0.5％混合，总浓度为1％(w/v)，以制备乳铁蛋白-果胶静电复合物；使用2mol/L NaOH溶液将上述溶液的pH调节至5.5，以制备纳米水凝胶。然后向上述水凝胶体系中加入25μL二氢槲皮素无水乙醇溶液，使其浓度为0.25mg/mL，样品放置于磁力搅拌器上搅拌20min，以确保二氢槲皮素被纳米水凝胶包埋。

经计算，实施例1纳米水凝胶对二氢槲皮素的包埋率为64.37％，装载率为3.22％，二氢槲皮素在水中的溶解度从0.012mg/mL升高到0.161mg/mL。经12h紫外光照射后，二氢槲皮素在水中的保留率为66.34％，在纳米水凝胶中的保留率为79.21％；经85℃水浴加热30min后，二氢槲皮素在水中的保留率为84.37％，在纳米水凝胶中的保留率为86.11％。

实施例2：

本实施例提供的一种基于乳铁蛋白和果胶的二氢槲皮素纳米水凝胶，制备方法如下：

(1)乳铁蛋白水溶液的制备

首先向52mg乳铁蛋白干粉中加入一定量的蒸馏水，使其成为糊状，然后加入剩余蒸馏水，蒸馏水总量为10mL，用磁力搅拌器在700转速下磁力搅拌35min，直至粉末全部溶解，而后放入4℃冰箱水合12h；将配置好的乳铁蛋白水溶液在85℃下加热25min，使乳铁蛋白变性，冷却至室温，待用。

(2)果胶水溶液的制备

将一定量的蒸馏水放置于磁力搅拌器上，边搅拌边加入果胶粉末，然后将该溶液置于65℃水浴锅中加热20min，直至果胶完全溶解，制成浓度为1％的果胶水溶液，冷却至室温，待用。

(3)二氢槲皮素无水乙醇溶液的制备

称取一定量的二氢槲皮素粉末置于棕色离心管中，加入一定量的无水乙醇并涡旋10min使之充分溶解，制成浓度为5％的二氢槲皮素储备液。

(4)二氢槲皮素纳米水凝胶的制备

首先将热变性的乳铁蛋白溶液和果胶溶液按照质量浓度比0.5％:0.5％混合，总浓度为1％(w/v)，以制备乳铁蛋白-果胶静电复合物；使用2mol/L NaOH溶液将上述溶液的pH调节至5.75，以制备纳米水凝胶。然后向上述水凝胶体系中加入20μL二氢槲皮素无水乙醇溶液，使其浓度为0.2mg/mL，样品放置于磁力搅拌器上搅拌20min，以确保二氢槲皮素被纳米水凝胶包埋。

经计算，实施例2纳米水凝胶对二氢槲皮素的包埋率为78.53％，装载率为3.14％，二氢槲皮素在水中的溶解度从0.012mg/mL升高到0.157mg/mL。经12h紫外光照射后，二氢槲皮素在水中的保留率为70.69％，在纳米水凝胶中的保留率为95.46％；经85℃水浴加热30min后，二氢槲皮素在水中的保留率为90％，在纳米水凝胶中的保留率为90.17％。

实施例3：

本实施例提供的一种基于乳铁蛋白和果胶的二氢槲皮素纳米水凝胶，制备方法如下：

(1)乳铁蛋白水溶液的制备

首先向52mg乳铁蛋白干粉中加入一定量的蒸馏水，使其成为糊状，然后加入剩余蒸馏水，蒸馏水总量为10mL，用磁力搅拌器在750转速下磁力搅拌30min，直至粉末全部溶解，而后放入4℃冰箱水合12h；将配置好的乳铁蛋白水溶液在90℃下加热20min，使乳铁蛋白变性，冷却至室温，待用。

(2)果胶水溶液的制备

将一定量的蒸馏水放置于磁力搅拌器上，边搅拌边加入果胶粉末，然后将该溶液置于65℃水浴锅中加热20min，直至果胶完全溶解，制成浓度为1％的果胶水溶液，冷却至室温，待用。

(3)二氢槲皮素无水乙醇溶液的制备

称取一定量的二氢槲皮素粉末置于棕色离心管中，加入一定量的无水乙醇并涡旋10min使之充分溶解，制成浓度为5％的二氢槲皮素储备液。

(4)二氢槲皮素纳米水凝胶的制备

首先将热变性的乳铁蛋白溶液和果胶溶液按照质量浓度比0.5％:0.5％混合，总浓度为1％(w/v)，以制备乳铁蛋白-果胶静电复合物；使用2mol/L NaOH溶液将上述溶液的pH调节至6，以制备纳米水凝胶。然后向上述水凝胶体系中加入16.7μL二氢槲皮素无水乙醇溶液，使其浓度为0.167mg/mL，样品放置于磁力搅拌器上搅拌20min，以确保二氢槲皮素被纳米水凝胶包埋。

经计算，实施例3纳米水凝胶对二氢槲皮素的包埋率为88.04％，装载率为2.99％，二氢槲皮素在水中的溶解度从0.012mg/mL升高到0.147mg/mL。经12h紫外光照射后，二氢槲皮素在水中的保留率为70.04％，在纳米水凝胶中的保留率为95.72％；经85℃水浴加热30min后，二氢槲皮素在水中的保留率为88.69％，在纳米水凝胶中的保留率为99.91％。

实施例4：

本实施例提供的一种基于乳铁蛋白和果胶的二氢槲皮素纳米水凝胶的功能性酸奶，二氢槲皮素纳米水凝胶制备方法同实施例1，其功能性酸奶是经过以下步骤制得的：

量取100mL巴氏杀菌鲜牛奶置于烧杯中，加入6g白砂糖和10mL二氢槲皮素纳米水凝胶，使成品酸奶中二氢槲皮素的浓度为16mg/kg，符合我国对其在发酵乳制品中的添加量规定。将烧杯置于43℃水浴锅中，磁力搅拌20min使其混合均匀，在无菌操作条件下加入0.1g发酵剂，磁力搅拌20min使其混合均匀。将上述混合料液移至37℃恒温培养箱内发酵6h得到发酵液，将其移入4℃冰箱内，经4h发酵成熟后，制得含有二氢槲皮素的功能性酸奶制品。

对照组酸奶制备方法的区别在于将上述纳米水凝胶替换为相同体积的蒸馏水，对实验组和对照组分别测定其质构特性和流变特性，结果如下：

表1质构特性

结果表明，添加二氢槲皮素使得酸奶中总固形物含量增大，因此实验组酸奶的硬度高于对照组；与对照组酸奶相比，实验组酸奶的黏着性略有降低，弹性、内聚力和胶粘性更大，这赋予了酸奶更好的感官品质，且添加二氢槲皮素对于酸奶的黏度无明显影响。