一种蛹虫草双向发酵液及其制备工艺与应用

技术领域

本发明涉及一种蛹虫草双向发酵液及其制备工艺与应用，属于生物发酵及化妆品应用技术领域。

背景技术

蛹虫草(Cordyceps militaris)又称北冬虫夏草，属麦角菌科虫草属真菌，原产于我国，2009年被国家卫生部批准为新资源食品，是一种具有较高价值的药食两用真菌。蛹虫草富含多糖、虫草素、核苷类、麦角甾醇、虫草酸、虫草多肽和生物碱等多种生物活性物质。

中药双向发酵技术是将药用真菌接种在中药基质上，发酵生产药用真菌的同时，产生的酶可催化中药的化学成分发生转化，提高或降低中药化学成分的含量或产生新的化合物，使发酵得到菌质的生物活性、毒性发生改变，或具备新的活性。如中国专利“CN116731875A一种蛹虫草-贝母发酵菌质及其制备方法”提供了一种蛹虫草 贝母发酵菌质及其制备方法，将蛹虫草菌种接种至所述贝母发酵基质中进行双向发酵，获得具有高抗氧化能力且富含黄酮、多酚的蛹虫草贝母菌质。

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)初载于《神农本草经》，又名粉草、蜜草、美草，是豆科甘草属植物(亦称乌拉尔甘草)。甘草中富含黄酮类300余种，其黄酮类成分在抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等方面有显著作用。

大豆(Glycine max(L.)Merr.)是豆科大豆属的一年生草本植物。绿豆(Vignaradiate(L.)R.Wilczek)属于豆科豇豆属一年生直立草本植物，绿豆性寒、无毒，具有清热解毒、祛暑止咳、利水消炎、益智退热、美肤养颜等功能。二者含有较高含量蛋白质，且氨基酸组成丰富，其侧链官能团如羧基、胺基、羟基等，可以与其他物质发生化学反应，使蛋白质易于被修饰改性，与其他物质交联形成复合基质或共聚物等，发酵蛋白可产生具有多种生物活性的低聚肽。

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)属于兰科石斛属植物，药理作用有增强免疫力、抗氧化、改善胃肠功能等。多糖是铁皮石斛重要的活性物质之一，铁皮石斛多糖能起到抗氧化、调节免疫、抗糖尿病等功能。

人参茎叶为五加科人参属多年生草本植物人参(Panax ginseng C.A.Meyer)的干燥茎和叶，人参具有抗肿瘤、调节神经系统、增强免疫力、治疗心律失常、抗溶血等重要的生物学活性。现代药理学研究证明，人参茎叶皂苷与人参根皂苷基本相同，并且人参茎叶总皂苷具有人参的主要药理活性。

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)是我国名贵药材，为五加科、人参属，多年生宿根草本植物，总皂苷含量约4％～6％，是其主要的活性成分。其根和茎富含皂苷类成分。

在液态发酵中一般通过添加一些外源物质如黄酮、蛋白质、多糖、皂苷等活性物质促进微生物次级代谢产物的产生，还可以保留外源物质的活性、消除抗营养因素、改善生物利用率等。将以上中药应用于蛹虫草的双向发酵，其双向发酵液中有效成分的含量或功效，及其是否可以作为原料进一步应用于化妆品中，仍需要进一步检测与研究。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种蛹虫草双向发酵液及其制备工艺与应用。

本发明的技术方案如下：

一种蛹虫草双向发酵液的制备工艺，是向蛹虫草发酵培养基中添加甘草，经发酵培养后得到的，其中，所述甘草的添加量为1-10g/100mL发酵培养基。

根据本发明优选的，所述发酵培养基每100mL包括组分：葡萄糖1-5g，蛋白胨1-5g，磷酸二氢钾0.01-0.1g，硫酸镁0.10-0.5g。

进一步优选的，所述发酵培养基每100mL包括组分：葡萄糖3g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.15g。

根据本发明优选的，所述甘草的添加量为2-10g/100mL发酵培养基。

根据本发明优选的，所述甘草的添加量为2-5g/100mL发酵培养基。

根据本发明优选的，所述甘草经干燥、粉碎后过40-200目筛；进一步优选为过80目筛。

根据本发明优选的，所述蛹虫草双向发酵液的制备工艺还包括过滤和灭菌处理，以去除发酵液中的固体残留及微生物。

本发明中一种优选的技术方案，一种蛹虫草双向发酵液的制备工艺，具体包括如下步骤：

(1)蛹虫草菌丝体的活化：挑取蛹虫草菌丝体，涂布于PDA培养基斜面上，20-30℃传代培养3-7天，传代数为3-4代，得到活化的蛹虫草菌丝体；

(2)蛹虫草种子液的培养：挑取步骤(1)中活化的蛹虫草菌丝体，将其分散于种子液培养基中，20-30℃、100-200r/min恒温摇床中培养2-4天，得蛹虫草种子液；

(3)蛹虫草液体发酵：吸取步骤(2)中蛹虫草种子液按照接种量为10-30wt％接种到发酵培养基中，20-30℃、100-200r/min恒温摇床培养3-7天，即得蛹虫草液体发酵产物；其中，向发酵培养基中添加甘草，甘草添加量为1-10g/100mL发酵培养基；

(4)将步骤(3)的蛹虫草液体发酵产物用1-8层100-200目纱布进行初滤，初步分离菌丝体与发酵液，然后将初滤过的发酵液灭菌，再经0.22-0.45μm的滤板进行二次过滤，得到精滤过的发酵液，灭菌后得到蛹虫草双向发酵液。

根据本发明优选的，步骤(1)中25℃传代培养7天，传代数为4代。

根据本发明优选的，步骤(2)中25℃、150r/min恒温摇床中培养3天。

根据本发明优选的，步骤(2)中所述种子液培养基每100mL包括组分：蔗糖1-3g，酵母膏1-3g，蛋白胨1-3g。

进一步优选的，步骤(2)中所述种子液培养基每100mL包括组分：蔗糖2g，酵母膏1g，蛋白胨2g。

根据本发明优选的，步骤(3)中所述接种量为10wt％。

根据本发明优选的，步骤(3)中25℃、150r/min恒温摇床培养5天。

根据本发明优选的，步骤(4)中用8层200目纱布进行初滤；经0.45μm的滤板进行二次过滤。

根据本发明优选的，步骤(4)中所述灭菌为121℃灭菌20分钟。

按照上述制备工艺制备得到的蛹虫草双向发酵液。

上述蛹虫草双向发酵液在制备具有抗氧化作用护肤品或化妆品中的应用。

上述蛹虫草双向发酵液在制备具有抗炎作用护肤品或化妆品中的应用。

上述蛹虫草双向发酵液在制备具有抗皱紧致作用护肤品或化妆品中的应用。

上述蛹虫草双向发酵液在制备具有保湿、抗衰老、损伤修复作用护肤品或化妆品中的应用。

根据本发明优选的，以上应用中，所述蛹虫草双向发酵液在护肤品或化妆品中的添加量为1-10wt％。

有益效果：

本发明通过对6种蛹虫草-中药组合双向发酵液的研究，筛选出较优组合及比例，所获得的蛹虫草-甘草发酵液含有较高的多糖和多肽成分，具有显著的抗氧化、抗炎及抗皱紧致作用，且经过鸡胚绒毛尿囊膜实验验证了其在10wt％添加量时的安全性，通过小鼠UV光照实验验证了该蛹虫草-甘草发酵液对于皮肤的保湿、抗衰、修复作用，提高了我国蛹虫草、甘草资源的利用度，并发现了其作为功效化妆品原料在保湿、舒缓、抗衰、修复等功效化妆品中的应用。

附图说明

图1为吸光度-葡萄糖浓度标准曲线。

图2为吸光度-牛血清蛋白浓度标准曲线。

具体实施方式

本发明的技术方案将通过结合具体实施方式进一步说明。但应理解本发明所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。实施例中涉及的试剂及材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例中涉及的培养基的组成与配制：

PDA斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)粉末4g，培养基粉末与超纯水的质量比例为1:20，121℃灭菌20min，灭菌后趁热分装于带塞的试管中，使试管倾斜一定角度，放置冷却，即得。

种子液培养基：蔗糖2g，酵母膏1g，蛋白胨2g，超纯水100mL，121℃灭菌20min。

发酵培养基：葡萄糖3g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.15g，中药成分，超纯水100mL，121℃灭菌20min；其中，中药成分经干燥、粉碎后过80目筛。

实施例中涉及的中药成分包括甘草、大豆、绿豆、铁皮石斛、人参茎叶、三七茎叶，均为普通市售产品。

实施例中涉及的蛹虫草(Cordyceps militaris)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC 14013。

实施例1：

一种蛹虫草双向发酵液的制备工艺，包括如下步骤：

(1)蛹虫草菌丝体的活化：用接种环挑取冷藏保存的蛹虫草菌丝体，均匀地涂布于PDA斜面培养基上，将其置于生化培养箱中25℃传代培养7天，传代数为4代，PDA斜面培养基上布满白色密集菌丝体；

(2)蛹虫草种子液的培养：用接种环挑取步骤(1)中活化的蛹虫草菌丝体，将其分散于种子液培养基中，25℃、150r/min恒温摇床中培养3天，菌丝体呈细密的小米状分布，得蛹虫草种子液；

(3)蛹虫草液体发酵：精密吸取步骤(2)中蛹虫草种子液按照10wt％的接种量接种到发酵培养基中，25℃、150r/min恒温摇床中培养5天，即得蛹虫草液体发酵产物；其中，发酵培养基中的中药成分为2g甘草；

(4)将步骤(3)的蛹虫草液体发酵产物用8层200目纱布进行初滤，初步分离菌丝体与发酵液，然后将初滤过的发酵液121℃灭菌20分钟，经0.45μm的滤板进行二次过滤，得到精滤过的发酵液，然后121℃灭菌20分钟，进行二次灭菌处理，得到蛹虫草双向发酵液。

实施例2：

一种蛹虫草双向发酵液的制备工艺，与实施例1不同的是：发酵培养基中的中药成分为1g甘草；其余步骤均与实施例1相同。

实施例3：

一种蛹虫草双向发酵液的制备工艺，与实施例1不同的是：发酵培养基中的中药成分为5g甘草；其余步骤均与实施例1相同。

实施例4：

一种蛹虫草双向发酵液的制备工艺，与实施例1不同的是：发酵培养基中的中药成分为7g甘草；其余步骤均与实施例1相同。

实施例5：

一种蛹虫草双向发酵液的制备工艺，与实施例1不同的是：发酵培养基中的中药成分为10g甘草；其余步骤均与实施例1相同。

对比例1：

一种蛹虫草发酵液的制备工艺，与实施例1不同的是：发酵培养基中不含有中药成分；其余步骤均与实施例1相同。

对比例2：

一种蛹虫草双向发酵液的制备工艺，与实施例1不同的是：发酵培养基中的中药成分为2g大豆；其余步骤均与实施例1相同。

对比例3：

一种蛹虫草双向发酵液的制备工艺，与实施例1不同的是：发酵培养基中的中药成分为2g绿豆；其余步骤均与实施例1相同。

对比例4：

一种蛹虫草双向发酵液的制备工艺，与实施例1不同的是：发酵培养基中的中药成分为2g铁皮石斛；其余步骤均与实施例1相同。

对比例5：

一种蛹虫草双向发酵液的制备工艺，与实施例1不同的是：发酵培养基中的中药成分为2g人参茎叶；其余步骤均与实施例1相同。

对比例6：

一种蛹虫草双向发酵液的制备工艺，与实施例1不同的是：发酵培养基中的中药成分为2g三七茎叶；其余步骤均与实施例1相同。

实验例1：外观观测

实施例1及对比例1-6得到的蛹虫草双向发酵液，观察其外观颜色，记录如下表：

表1.蛹虫草双向发酵液的外观颜色

由表1可知，实施例1的蛹虫草-甘草发酵液、对比例1的蛹虫草单一发酵液、对比例2的蛹虫草-大豆发酵液、对比例3的蛹虫草-绿豆发酵液、对比例4的蛹虫草-铁皮石斛发酵液均为浅棕色半透明液体，可应用于化妆品中，但是对比例5的蛹虫草-人参茎叶发酵液和对比例6的蛹虫草-三七茎叶发酵液的颜色较深，为深棕色半透明液体，不适合添加到化妆品中，可能会影响化妆品最终的外观呈现。

实验例2：多糖含量检测

实施例1-5及对比例1-4得到的蛹虫草双向发酵液，采用苯酚硫酸法测定上述发酵液中的多糖含量。

(1)试剂配制

5％苯酚溶液：500μL苯酚加去离子水定容于10mL容量瓶中。

(2)标准曲线绘制

精密称取葡萄糖1g，用去离子水定容至10mL容量瓶中，此标准溶液质量浓度为100mg/mL，吸取200μL标准溶液定容至10mL，此标准溶液质量浓度为2mg/mL。

精密吸取2mg/mL葡萄糖标准溶液50μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL于试管中，各加去离子水至1mL，得到质量浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的标准品梯度溶液。

然后依次向标准品梯度溶液中加入0.5mL 5％苯酚溶液，震匀，再加入2.5mL浓硫酸混匀，放入沸水浴中反应60min，反应结束后，放入冷水中冷却至室温，在490nm处用酶标仪测量其吸光度值。

以标准品梯度溶液的葡萄糖浓度为横坐标，以OD

(3)样品测定

吸取稀释后的发酵液样品1.0mL，然后加入0.5mL 5％苯酚溶液，震匀，再加入2.5mL浓硫酸混匀，放入沸水浴中反应60min，反应结束后，放入冷水中冷却至室温，在490nm处用酶标仪测量其吸光度值，根据标准曲线计算其多糖含量。

其中，蛹虫草与不同中药成分的组合发酵液中多糖含量测定结果如表2所示，其中，表2中还包括pH、电导率和固形物含量等理化指标，pH、电导率和固形物含量是发酵过程中的生化反应的综合结果。

表2.蛹虫草与不同中药成分的组合发酵液的理化指标

由上表数据可知，实施例1和对比例1-4发酵液的pH、电导率和固形物含量无明显差异，无过酸过碱或电导率较高情况，但多糖含量表现出了明显差异，其中多糖含量最高为蛹虫草-甘草发酵液，其多糖含量为2.19mg/mL，与蛹虫草单一发酵液相对比，蛹虫草-甘草发酵液多糖含量提高了10.61％；蛹虫草-铁皮石斛发酵液的多糖含量稍低于蛹虫草-甘草发酵液的多糖含量，但是蛹虫草-大豆发酵液和蛹虫草-绿豆发酵液的多糖含量明显较低，甚至低于蛹虫草单一发酵液。

其中，蛹虫草与不同质量甘草的组合发酵液中多糖含量测定结果如表3所示。

表3.蛹虫草与不同质量甘草的组合发酵液的理化指标

由表3中不同质量甘草的发酵液外观颜色可知，当甘草的添加量为0-10g时，蛹虫草-甘草发酵液呈浅棕色半透明状液体，可应用于化妆品中。另外，当甘草的添加量逐渐增加，蛹虫草-甘草发酵液的多糖含量呈递增趋势，当达到2g时，其增长速度最快。

表2和表3中实施例1和对比例1的理化指标数据稍有差异，主要是因为其检测批次不同导致的，但均在可接受的实验误差范围之内，以下实施例中同理。

实验例3：多肽含量检测

实施例1-5及对比例1-4得到的蛹虫草双向发酵液，采用双缩脲试剂法测定上述发酵液中的多肽含量。

(1)试剂配制

双缩脲试剂：试剂A：0.15g CuSO

(2)标准曲线绘制(标曲范围0-5mg/mL)

首先配制10mg/mL牛血清蛋白标准溶液(水为溶剂)，分别取0、50、100、150、200、250μL于ep管中，补水至0.5mL，得到质量浓度分别为0、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL的标准品梯度溶液，加入2mL双缩脲试剂(试剂A、试剂B混匀使用)，室温反应30min，540nm处测其吸光度。以标准品梯度溶液的牛血清蛋白浓度为横坐标，以OD

(3)样品测定

取1mL发酵液样品，加入1.0mL 10％的三氯乙酸溶解，离心，将蛋白沉淀下来，取0.5mL上清，加入2mL双缩脲试剂(试剂A、试剂B混匀使用)，室温反应30min，540nm处测其吸光度，根据标准曲线计算样品多肽含量。

其中，蛹虫草与不同中药成分的组合发酵液中多肽含量测定结果如表4所示。

表4.蛹虫草与不同中药成分的组合发酵液的多肽含量测定结果

由上表数据可知，上述发酵液中，蛹虫草-甘草发酵液的多肽含量最高，其多肽含量达154.6μg/mL，远高于蛹虫草-大豆发酵液、蛹虫草-绿豆发酵液和蛹虫草-铁皮石斛发酵液，与对比例1蛹虫草单一发酵液相对比，蛹虫草-甘草发酵液的多肽含量提高了106.68％。

其中，蛹虫草与不同质量甘草的组合发酵液中多肽含量测定结果如表5所示。

表5.蛹虫草与不同质量甘草的组合发酵液的多肽含量测定结果

由表5中数据可知，当甘草的添加量逐渐增加时，蛹虫草-甘草发酵液的多肽含量呈递增趋势，当达到2g时，其增长速度最快。

实验例4：抗氧化作用

实施例1-5及对比例1-4得到的蛹虫草双向发酵液，测定其DPPH清除率以反映其抗氧化作用。

DPPH工作试液的配制(浓度为0.08mg/mL)：精密称取20mg DPPH粉末，加入无水乙醇溶解，并定容于250mL容量瓶中，0-4℃下避光保存，现配现用。

待测液的配制：将发酵液样品用蒸馏水分别稀释得到样品浓度为1wt％、2wt％、3wt％、5wt％、7wt％、10wt％的待测液。

检测方法，步骤如下：

(1)取1mL的待测液与1mL的0.08mg/mL的DPPH溶液混匀(A管)；

(2)取1mL的无水乙醇与1mL的0.08mg/mL的DPPH溶液混匀(B管)；

(3)取1mL的无水乙醇与1mL的待测液混匀(C管)；

(4)避光反应30min后，将反应后的溶液，在避光条件下，吸取200μL于96孔板，然后于517nm下测A、B、C管吸光度值，按照如下公式计算DPPH清除率：

DPPH清除率(％)＝(OD

其中，蛹虫草与不同中药成分的组合发酵液的DPPH清除率测定结果如表6所示。

表6.蛹虫草与不同中药成分的组合发酵液的DPPH清除率测定结果

由表6数据可知，随着样品浓度的提高，所有发酵液样品的DPPH清除率均有所提高，其中，蛹虫草-甘草发酵液的DPPH清除率最佳，抗氧化作用最强，其次是蛹虫草-绿豆发酵液、蛹虫草-大豆发酵液、蛹虫草-铁皮石斛发酵液，蛹虫草单一发酵液的抗氧化作用最弱。

其中，蛹虫草与不同质量甘草的组合发酵液的DPPH清除率测定结果如表7所示。

表7.蛹虫草与不同质量甘草的组合发酵液的DPPH清除率测定结果

由表7的数据可知，当甘草的添加量为2g，蛹虫草-甘草发酵液的DPPH清除率效果最佳。当进一步增加或减少甘草的添加量，蛹虫草-甘草发酵液的DPPH清除率略有降低，但仍优于无甘草添加时的蛹虫草单一发酵液的DPPH清除率。

实验例5：抗炎作用

COX-2(环氧化酶-2)是一种炎症因子，使用DMSO将实施例1-3及对比例1-4得到的蛹虫草双向发酵液分别稀释至1wt％、2.5wt％和5wt％，根据试剂盒说明书测定其COX-2抑制率以反映其抗炎活性。使用的COX-2抑制剂筛选试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

其中，蛹虫草与不同中药成分的组合发酵液的COX-2抑制率测定结果如表8所示。

表8.蛹虫草与不同中药成分的组合发酵液的COX-2抑制率测定结果

由表8数据可知，随着样品浓度的提高，所有发酵液样品的COX-2抑制率均有所提高，其中，蛹虫草-甘草发酵液的COX-2抑制率最佳，抗炎作用最强，其次是蛹虫草-铁皮石斛发酵液、蛹虫草-大豆发酵液、蛹虫草-绿豆发酵液，蛹虫草单一发酵液的抗炎作用最弱。

其中，蛹虫草与不同质量甘草的组合发酵液的COX-2抑制率测定结果如表9所示。

表9.蛹虫草与不同质量甘草的组合发酵液的COX-2抑制率测定结果

由表9数据可知，随着样品浓度和甘草添加量的提高，所有发酵液样品的COX-2抑制率均有所提高。

实验例6：抗皱紧致作用

实施例1-3及对比例1-4得到的蛹虫草双向发酵液，测定其弹性蛋白酶抑制率以反映其抗皱紧致作用。

人白细胞弹性蛋白酶是多形核白细胞因受炎症刺激而释放出的一种破坏性丝氨酸蛋白酶。作为一种蛋白水解酶，弹性蛋白酶是已知的最有破坏性的酶，它以分解不溶性弹性蛋白为特征，具有广泛的水解特性，不但能降解弹性蛋白，而且能分解酪蛋白、明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质，是一种广谱的肽链内切酶，它的过多表达和过高活性参与多种疾病的病理过程。

N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val对硝基苯胺为人白细胞弹性蛋白酶的底物。采用分光光度法测定被分解出的对硝基苯胺(pNA)在405nm处的吸光度值。加入样品的吸光度水平的降低表明样品可以抑制弹性蛋白酶的活性，从而以评价试验样品的抗皱紧致能力。

缓冲液的配制：取PBS(1×)溶液5mL，用1mol/L和0.1mol/L的HCl溶液调节pH＝6.5，4℃低温保存。

弹性蛋白酶溶液的配制：将1mL缓冲液打入含有20μg弹性蛋白酶的试剂瓶，摇晃均匀，立刻用1.5mL的EP管，以每管100μL分装，放入-20℃冻存。使用时解冻，并加入300μL缓冲液，得到浓度为5μg/mL的弹性蛋白酶溶液，-20℃保存。

底物(N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val对硝基苯胺)溶液的配制：制得0.1mol/L的Tris-HCl溶液，调节pH＝6.5；用0.1mol/L的Tris-HCl溶液配置1mmol/L的底物溶液，-20℃保存。

待测液的配制：取发酵液样品，使用0.1mol/L的Tris-HCl溶液(pH＝6.5)配制得浓度为10wt％的待测液。

检测方法，步骤如下：

在96孔板中加入各试剂：

1)A孔：25μL弹性蛋白酶溶液+50μL待测液+15μL底物溶液+10μL缓冲液，

2)B孔：25μL弹性蛋白酶溶液+50μL待测液+15μL Tris-HCl溶液+10μL缓冲液，

3)C孔：25μL弹性蛋白酶溶液+50μL Tris-HCl溶液+15μL底物溶液+10μL缓冲液，

4)以上各孔中，先加入弹性蛋白酶溶液和待测液(和/或Tris-HCl溶液)孵育10min后，再加入底物溶液和缓冲液孵育60min，在405nm处测定吸光度值。

弹性蛋白酶抑制率计算公式：

其中，蛹虫草与不同中药成分的组合发酵液的弹性蛋白酶抑制率测定结果如表10所示。

表10.蛹虫草与不同中药成分的组合发酵液的弹性蛋白酶抑制率测定结果

由表10数据可知，与蛹虫草单一发酵液相比，所有蛹虫草与不同中药成分的组合发酵液样品的弹性蛋白酶抑制率均有所提高，其中，蛹虫草-甘草发酵液的弹性蛋白酶抑制作用最显著，其次为蛹虫草-铁皮石斛发酵液、蛹虫草-大豆发酵液、蛹虫草-绿豆发酵液。

其中，蛹虫草与不同质量甘草的组合发酵液的弹性蛋白酶抑制率测定结果如表11所示。

表11.蛹虫草与不同质量甘草的组合发酵液的弹性蛋白酶抑制率测定结果

由表11数据可知，随着甘草添加量的提高，发酵液样品的弹性蛋白酶抑制率均有所提高。

实验例7：安全性实验

实施例1得到的蛹虫草双向发酵液，以鸡胚绒毛尿囊膜实验验证该最优工艺下的发酵液的安全性，为其在化妆品中的安全应用提供保证和添加量参考。

检测依照下列方法进行：T/SHRH 011-2018《化妆品眼刺激性测试鸡胚绒毛尿囊膜试验》及SN/T 2329-2009《化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验》

样品测试浓度为10wt％，采用终点评分(ES)，结果见表12。

表12.10wt％浓度样品的终点评分结果

通过上述结果可以看出，在10wt％的样品浓度下，蛹虫草-甘草发酵液无潜在刺激性，可安全应用于化妆品中。

实验例8：保湿、修复、抗衰作用

实施例1得到的蛹虫草双向发酵液，通过建立UV照射模型对照小鼠实验，研究其对皮肤的保湿、修复、抗衰作用。

实验动物：每组包括SPF级2-4周龄Balb/c裸鼠6-8只。

实验条件：裸鼠饲养环境温度为22-24℃，湿度为40％-50％，每日明暗交替各12h，SPF动物房环境所有技术指标均符合GB14925-2010屏障环境技术要求。

空白组：未经UV照射的正常饲养的小鼠，背部不涂抹任何物质。

模型组：经UV照射的背部受损、老化小鼠，背部不涂抹任何物质。

安慰剂组：经UV照射的背部受损、老化小鼠，背部涂抹不添加蛹虫草-甘草发酵液的凝胶组合物。

试验组：经UV照射的背部受损、老化小鼠，背部涂抹添加5％实施例1蛹虫草-甘草发酵液的凝胶组合物。

凝胶组合物原料组成如下表：

表13.凝胶组合物的原料组成

以本领域常规方法制备即可。

照射方式：UVA灯管和UVB灯管并列穿插安装到自制模拟日光箱中，保持裸鼠背部每次照射后涂抹样品。每日上午9:00-11:00间，消毒后照射，每周7次照射，UVA照射剂量约为100J/cm

涂抹量与涂抹方式：使用1mL针孔注射器，按照0.04-0.05mL/cm

结果检测：检测各组裸鼠经皮水分散失量、皮肤角质层水分含量、皮肤弹性R2数值。

实验结果：

表14.试验期间裸鼠的经皮水分散失量(单位：g/h/m

实验结果显示，与安慰剂组相比，蛹虫草-甘草发酵液样品具有显著降低小鼠皮肤受损、衰老模型中经皮水分散失量的作用，具有宏观上的保湿、修复作用。

表15.试验期间裸鼠的皮肤角质层水分含量(a.u.，n＝8)

实验结果显示，与安慰剂组相比，蛹虫草-甘草发酵液样品具有显著保持小鼠皮肤受损、衰老模型中皮肤角质层水分含量的效果，具有宏观上的保湿作用。

表16.试验期间裸鼠的皮肤弹性R2检测数据(n＝8)

实验结果显示，与安慰剂组相比，蛹虫草-甘草发酵液样品具有显著减轻小鼠皮肤受损、衰老模型中皮肤弹性减弱的功效，宏观上表现出减少皱纹产生、减轻皮肤松弛、延缓皮肤衰老的作用。

以上结果表明，通过对6种蛹虫草-中药组合双向发酵液的研究，筛选出较优组合及比例，所获得的蛹虫草-甘草发酵液具有显著的抗氧化、抗炎及抗皱紧致作用，且经过鸡胚绒毛尿囊膜实验验证了其在10wt％添加量时的安全性，通过小鼠UV光照实验验证了该蛹虫草-甘草发酵液对于皮肤的保湿、抗衰、修复作用，提高了我国蛹虫草、甘草资源的利用度，并发现了其作为功效化妆品原料在保湿、舒缓、抗衰、修复等功效化妆品中的应用。