一种检测熊胆粉中兽药残留的方法

技术领域

本发明涉及药材安全检测技术领域，尤其涉及一种检测熊胆粉中兽药残留的方法。

背景技术

熊胆作为传统名贵中药材，在上世纪80年代以前，通过杀熊取内有胆汁的胆囊，经过干燥，胆汁形成结块。自80年代初，通过引进技术不断开展科研，建立了黑熊人工饲养、人工繁殖、活熊取胆、无管引流等一系列技术。其中，通过无管引流技术，大大消除了黑熊的痛苦，促进了黑熊养殖业的发展。由于熊胆粉市场供给不足与市场需求之间矛盾存在，国内养熊企业和制药企业不断通过技术改进提高熊胆粉的产能。

部分养熊企业在黑熊养殖过程中，达到林业部规定可以进行人工引流胆汁的黑熊，首次进行引流胆汁在造瘘伤口全部愈合后进行。黑熊患病期间如需使用药品治疗的，尽可能采用中药医治，黑熊患病期间不进行胆汁采集，待完全健康后进行胆汁引流。

企业在对黑熊进行自体造瘘无管引流手术中需要使用麻醉药、抗生素。手术后使用抗生素饲喂治疗。在黑熊手术期间所使用的药品有麻醉药盐酸塞拉嗪注射液等，抗生素类包括注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素、注射用苄星青霉素、酚磺乙胺注射液、维生素C注射液等，在术后恢复期间所使用的药品包括盐酸左氧氟沙星片等。

黑熊在使用了兽药后，蓄积或储存在动物组织或器官内，这些药物通过代谢途径进入熊胆汁中，经加工后制成中药材熊胆粉，投入药品生产过程中制成中成药。有的兽药具有导致过敏反应、使人体产生抗药性等副作用，因此对熊胆粉中兽药残留的检测对保证药品安全具有重要的意义。

综上所述，本发明提出一种检测熊胆粉中兽药残留的方法来解决此类存在的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测熊胆粉中兽药残留的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测熊胆粉中兽药残留的方法，包括以下步骤：

S1，对照品储备溶液的制备：精密称取各对照品适量，根据溶解性，加适宜溶剂制成每1ml含100μg的溶液，即得100μg/ml的对照品储备溶液；

S2，混合对照品溶液的制备：精密量取对照品储备溶液适量，用15％乙腈制成每ml含1μg的溶液，即得1μg/ml的混合对照品溶液；

S3，基质混合对照品溶液的制备：取空白熊胆粉样品适量，研细，混匀，取约0.1g，精密称定，置于50ml聚苯乙烯具塞离心管中，精密加入混合对照品溶液100μl，同供试品溶液的制备方法处理，即得；

S4，供试品溶液的制备：取熊胆粉样品适量，研细，混匀，取约0.1g，精密称定，置于50ml聚苯乙烯具塞离心管中，加0.1mol/L Na2EDTA-McIlvaine缓冲液并且缓冲液(pH4.0)10ml，摇匀，涡旋使充分浸润。精密加入5％冰醋酸乙腈10ml，涡旋使混匀，置振荡器上剧烈震荡10分钟；以一定的比例加入无水氯化钠:硫酸钠混合粉末5g，再置振荡器上剧烈振荡3分钟，离心5分钟，使分层；吸取上清液6ml，置已预先装有净化材料的分散固相萃取净化管中，涡旋使充分混匀，再置振荡器上剧烈振荡5分钟使净化完全，离心5分钟，精密吸取上清液2ml，置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至干，精密加0.2ml 15％乙腈，涡旋1分钟，超声1分钟，混匀，离心，取上清液，即得；

S5，测定法：分别精密吸取上述基质混合对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱-质谱仪，测定。

优选的，所述S5，液相色谱包括流动相和洗脱方式，所述S5，液相色谱中的流动相是以下(1)至(4)中的任意一种：

(1)流动相A 0.1％甲酸(含0.2mmol/L甲酸铵和0.2mmol氟化铵)溶液-流动相B0.1％甲酸乙腈溶液；

(2)流动相A0.2％甲酸(含0.3mmol/L甲酸铵和0.3mmol氟化铵)溶液-流动相B0.1％甲酸乙腈溶液；

(3)流动相A0.2％甲酸(含0.5mmol/L甲酸铵和0.5mmol氟化铵)溶液-流动相B0.2％甲酸乙腈溶液；

(4)流动相A0.1％甲酸(含0.4mmol/L甲酸铵和0.4mmol氟化铵)溶液-流动相B0.2％甲酸乙腈溶液。

所述S5，液相色谱中洗脱方式采用梯度洗脱，梯度洗脱的流程是以下(1)至(3)中的任意一种：

(1)0～1.5min，体积百分浓度1％流动相B，1.5～2.0min，体积百分浓度1-10％流动相B，2.0～4.5min，体积百分浓度10-18％流动相B，4.5～6min，体积百分浓度18％–22％流动相B，6～9min，体积百分浓度22-30％流动相B，9～12min，体积百分浓度30-35％流动相B；12～20min，体积百分浓度35-80％流动相B，20～26min，体积百分浓度80-100％流动相B；

(2)0～0.5min，体积百分浓度2％流动相B，0.5～1.8min，体积百分浓度2-15％流动相B，1.8～3.5min，体积百分浓度10-15％流动相B，3.5～6min，体积百分浓度15％–25％流动相B，6～7min，体积百分浓度25-30％流动相B，7～11min，体积百分浓度30-35％流动相B；11～16min，体积百分浓度35-100％流动相B，16～26min，体积百分浓度100％流动相B；

(3)0～1.0min，体积百分浓度3％流动相B，0.5～1.8min，体积百分浓度2-15％流动相B，1.8～5min，体积百分浓度10-15％流动相B，5～10min，体积百分浓度15％–20％流动相B，10～15min，体积百分浓度20-30％流动相B，15～20min，体积百分浓度30-35％流动相B；20～30min，体积百分浓度35-100％流动相B，30～35min，体积百分浓度100％流动相B。

所述S5，质谱条件中，仪器采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)模式下多反应监测(MRM)。

优选的，所述S4，0.1mol/L Na2EDTA-McIlvaine缓冲液(pH4.0)配制方法：称取2.9g柠檬酸一水合物、10.9g磷酸氢二钠十二水合物、37.2g乙二胺四乙酸二钠二水合物，加水至900ml，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至4.0，用水定容至1L。

优选的，所述S4，净化材料为硫酸镁300mg，十八烷基硅烷键合硅胶300mg，N-丙基乙二胺(PSA)1800mg。

优选的，所述S4，剧烈振荡的振动频率为500次/分钟。

优选的，所述S4，加入无水氯化钠:硫酸钠的比例为1:4。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明中，通过对熊胆粉中的兽药残留检测提供的方法，能够全面熊胆粉中169种兽药残留进行检查，从而解决了兽药具有导致过敏反应、使人体产生抗药性等副作用的问题，同时本方法简便快捷，可提高工作效率，降低检测成本。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种技术方案：一种检测熊胆粉中兽药残留的方法，包括以下步骤：

S1，对照品储备溶液的制备：精密称取各对照品适量，根据溶解性，加适宜溶剂制成每1ml含100μg的溶液，即得100μg/ml的对照品储备溶液；

S2，混合对照品溶液的制备：精密量取对照品储备溶液适量，用15％乙腈制成每ml含1μg的溶液，即得1μg/ml的混合对照品溶液；

S3，基质混合对照品溶液的制备：取空白熊胆粉样品适量，研细，混匀，取约0.1g，精密称定，置于50ml聚苯乙烯具塞离心管中，精密加入混合对照品溶液100μl，同供试品溶液的制备方法处理，即得；

S4，供试品溶液的制备：取熊胆粉样品适量，研细，混匀，取约0.1g，精密称定，置于50ml聚苯乙烯具塞离心管中，加0.1mol/L Na2EDTA-McIlvaine缓冲液并且缓冲液(pH4.0)10ml，摇匀，涡旋使充分浸润。精密加入5％冰醋酸乙腈10ml，涡旋使混匀，置振荡器上剧烈震荡10分钟；以一定的比例加入无水氯化钠:硫酸钠混合粉末5g，再置振荡器上剧烈振荡3分钟，离心5分钟，使分层；吸取上清液6ml，置已预先装有净化材料的分散固相萃取净化管中，涡旋使充分混匀，再置振荡器上剧烈振荡5分钟使净化完全，离心5分钟，精密吸取上清液2ml，置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至干，精密加0.2ml 15％乙腈，涡旋1分钟，超声1分钟，混匀，离心，取上清液，即得；

S5，测定法：分别精密吸取上述基质混合对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱-质谱仪，测定。

实施例：

1.仪器与试药

以Agilent Zorbax Eclipse plus C18(3.0*150mm，1.8μm)为色谱柱。所用的色谱条件：以0.2％甲酸(含0.5mmol/L甲酸铵和0.5mmol氟化铵)溶液为流动相A，以0.2％甲酸乙腈溶液为流动相B；柱温40℃，流速0.5ml/min。

表1流动相梯度

质谱条件：采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)模式下多反应监测(MRM)，监测离子对见表2。

表2各化合物质谱条件

步骤一：对照品储备溶液(100μg/ml)的制备：精密称取各对照品适量，根据溶解性，加适宜溶剂(见表1)制成每1ml含100μg的溶液，即得。

步骤二：混合对照品溶液(1μg/ml)的制备：精密量取对照品储备溶液(100μg/ml)适量，用15％乙腈制成每ml含1μg的溶液，即得。

步骤三：基质混合对照品溶液的制备：取空白熊胆粉样品(未检出上述169种兽药残留)适量，研细，混匀，取约0.1g，精密称定，置于50ml聚苯乙烯具塞离心管中，精密加入混合对照品溶液(1μg/ml)100μl，同供试品溶液的制备方法处理，即得。

步骤四：供试品溶液的制备：取熊胆粉样品适量，研细，混匀，取约0.1g，精密称定，置于50ml聚苯乙烯具塞离心管中，加0.1mol/L Na2EDTA-McIlvaine缓冲液(pH4.0)10ml，摇匀，涡旋使充分浸润。精密加入5％冰醋酸乙腈10ml，涡旋使混匀，置振荡器上剧烈震荡(500次/分钟)10分钟。加入无水氯化钠:硫酸钠(1:4)混合粉末5g，再置振荡器上剧烈振荡3分钟，离心5分钟，使分层。吸取上清液6ml，置已预先装有净化材料的分散固相萃取净化管[硫酸镁300mg，十八烷基硅烷键合硅胶300mg，N-丙基乙二胺(PSA)1800mg]中，涡旋使充分混匀，再置振荡器上剧烈振荡(500次/分钟)5分钟使净化完全，离心5分钟，精密吸取上清液2ml，置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至干，精密加0.2ml 15％乙腈，涡旋1分钟，超声1分钟，混匀，离心，取上清液，即得。

步骤五：测定法：分别精密吸取上述基质混合对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱-质谱仪，测定。供试品溶液若检出与对照品保留时间相同的色谱峰，且所选择的离子丰度比与相当浓度对照品溶液的离子丰度比符合下表规定，可判定具有该成分。

3、方法学验证

(1)专属性试验：取空白熊胆粉样品适量，研细，混匀，取约0.1g，精密称定，置于50ml聚苯乙烯具塞离心管中，同供试品溶液的制备方法处理，进样测定。结果未检出上述169种兽药残留，表明空白基质对测定无干扰。

(2)检出限试验：取空白熊胆粉样品适量，研细，混匀，取约0.1g，一式七份，精密称定，置于50ml聚苯乙烯具塞离心管中，分别精密加入混合对照品溶液(100ng/ml)1μl、10μl、50μl、100μl、250μl、500μl、1000μl，同供试品溶液的制备方法处理，进样测定。采用目视评价法，以真实最低检出浓度作为检出限。结果上述169种化合物检出限为1～1000μg/kg，具体详见表1。

(3)重复性试验：在加样(1000μg/kg)水平进行重复性试验，一式六份，均检出169种兽药。

表1所选择的169种兽药

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。