一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的分子标记C69483及其应用

技术领域

本发明属于DNA分子标记技术领域，具体涉及一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的分子标记C69483及其应用。

背景技术

红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、拟螯虾科，是世界上最名贵的淡水经济虾种之一。红螯螯虾具有个体大，食性杂，生长快，病害少，适应能力强等养殖优势。因红螯螯虾可食用部分比率高、肉味鲜美、营养价值高而广受欧美等国家欢迎，其市场前景较为广阔。在养殖过程中，雄虾因抢夺交配权而打斗激烈，导致死亡率高，如能实现高效的单性养殖将显著提高养殖效益。然而，目前尚没有高效的红螯螯虾性别控制技术。

分子标记是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。分子标记具有显著的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；生物发育不同阶段、不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记检测简单、迅速。目前，尚无有关红螯螯虾性别分子标记的研究或报道，因此，开发与红螯螯虾性别鉴定相关的分子标记，可以实现红螯螯虾的单性育种，提高养殖户的经济收益，对红螯螯虾的养殖和育种具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的分子标记C69483及其应用。本发明通过比较组学和生物信息学分析方法筛选到W特异区段，并进而筛选得到一个新的鉴定红螯螯虾遗传性别分子标记C69483，该分子标记鉴定效率及准确率高，还能够用于全雌或高雌性比红螯螯虾苗种培育，有助于红螯螯虾的养殖发展。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的分子标记C69483，所述分子标记C69483的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了用于检测所述的分子标记C69483的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：

C69483F：TCACTACCAGGCCACTTCAATTTG，

C69483R：CTGGATTTATGTGAACAGGGAAGG。

本发明还提供了所述的分子标记C69483在用于鉴定红螯螯虾遗传性别中的应用。

进一步：所述分子标记C69483鉴定红螯螯虾遗传性别的步骤为：所述分子标记C69483鉴定红螯螯虾遗传性别的步骤为：提取红螯螯虾肌肉组织基因组DNA并以此为模板，使用所述引物对C69483F和C69483R进行PCR扩增反应；对PCR扩增产物进行电泳，若电泳结果显示有条带则红螯螯虾为雌性，若无条带则红螯螯虾为雄性。

进一步：所述PCR扩增的反应条件为94℃，30s；98℃，10s，56℃，30s，72℃，1min，重复30个循环；72℃，2min。

本发明还提供了所述的分子标记C69483在用于全雌或高雌性比红螯螯虾苗育种中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明提供的快速鉴定红螯螯虾遗传性别的分子标记C69483可以不受红螯螯虾组织特异性及环境的影响，性别鉴定简便快捷，对样品的要求低，并且鉴定结果准确性高，不仅能够用于鉴定红螯螯虾遗传性别，还可以促进全雌或高雌性比红螯螯虾苗种培育技术的建立，因此具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：红螯螯虾混合DNA扩增图；其中，M：标准分子量；A和B：混合雄虾；C和D：混合雌虾；

图2：红螯螯虾雌性特异性标记图；其中，M：标准分子量；1-12：雄虾；13-24：雌虾。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1、DNA抽提

解剖取红螯螯虾的肌肉组织，利用TransGen Biotech的DNA提取试剂盒对红螯螯虾基因组DNA进行提取，经琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对所提DNA进行质量检测。选取质量和完整性均较好的DNA备用。

2、DNA混合池构建

将个体DNA等量混合，制备雌雄DNA混合池各2个，浓度为292.8ng/μl～363.3ng/μl，每个混合池中包含15个个体，用于后续实验。

3、引物设计

红螯螯虾为ZW/ZZ性别决定类型，通过比较组学和生物信息学分析方法筛选到的候选的W特异区段，然后从W特异区段中筛选并验证性别标记。利用Primer Premier 5.0软件，对W候选Contig设计引物，筛选到标记DNA序列(如SEQ IDNo.1所示)，并设计该序列的检测引物。引物的设计标准为：

1)PCR产物长度尽量覆盖标记序列，

2)引物退火温度50-60℃，

3)尽量避免引物本身、引物之间形成稳定的二聚体和发夹结构。

本实施例所用引物信息见表1：

表1：引物信息

4、混合模板PCR扩增及电泳

用混合DNA为模板，利用艾科瑞公司的AG酶进行PCR扩增，设置反应程序为：94℃，30s；98℃，10s，56℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，2min。PCR体系如下：

将混合模板PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示，在2个雄性混合DNA池中未扩增出目的条带，而在2个雌性混合池中均扩增出目的条带(图1)。

5、雌雄个体PCR扩增及电泳

提取24个红螯螯虾个体的组织DNA作为模板进行PCR，而PCR引物、PCR体系和PCR扩增反应程序均与上述相同，扩增后，将得到的个体模板PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示(图2)：在检测的所有雄性个体中均未扩增出目的条带，而在检测的所有雌性个体中均扩增出目的条带。

研究结果表明，本发明获得的分子标记C69483能够准确辨别红螯螯虾遗传性别，应用步骤简单来说为：提取红螯螯虾肌肉组织基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用分子标记的扩增引物C69483F和C69483R进行PCR扩增反应；对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果电泳结果显示有条带则为雌性，无条带则为雄性。分子标记C69483还能够用于全雌或高雌性比红螯螯虾苗种培育，有助于红螯螯虾的养殖发展。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的分子标记C69483及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 451

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attatcacta ccaggccact tcaatttgac ttacattcta tgaattattt gagtttgtct 60

tatactccaa tactaaattt ttttcccaat cattctgtaa ggtagtaact gaacatcata 120

ctgtggtcag tatcccaaaa aatagacttg gttcatatca gtttttagct cgctgtgttc 180

catggttgac tttctcatac aagttatagt actgtctgct aaggatgatg cacttctgtg 240

gcttatcccc ctgtttgtca ggtatgtcgg atatggtgat atatcagaca ctatactgat 300

gaacgatggt gacgataata gtggtgacta aactgcagat ccggagcatg tacagagtac 360

cttccctgtt cacataaatc cagtcaagca cctaaattta tgggaaagtt tgaagtctcg 420

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