进行单细胞分析的方法及其装置

技术领域

本发明涉及进行单细胞分析的方法及其装置。

背景技术

近年来，逐渐实现在含有各种细胞的各种生物样品中对每一个单细胞的分析。然而，在这种分析中仍然存在包括细胞的有效分离、单细胞的裂解、全基因组的均匀扩增、单细胞扩增基因组(SAG)的质量评估、测序文库制备及测序分析的样品制备流程中的一些技术问题。因此，为了使质量和生产能力最大化，迫切需要能够实现大规模并行分析的新技术。

环境微生物中能够培养的微生物仅占1％，并且地球上的微生物的多样性大部分是未知的。基因组序列信息是用于了解生物的基本信息，而基因组解码可帮助理解有关谱系、进化、疾病、生物地球化学的循环的微生物多样性和功能。因此，全基因组分析对于理解难培养性的功能是必不可少的。作为该难培养性微生物基因组分析的方法，从样品中共同提取各种微生物基因组并进行序列解码的元基因组分析已成为主流。

但是，在元基因组分析法中，可获得混合有各种微生物基因组序列的信息的数据。因此，从中提取感兴趣的微生物的基因组信息并单独对其进行重构并不容易，并且需要大规模的数据获取和计算处理。

另一方面，在单细胞的分析中，首先划分每个细胞之后开始处理。由于仅直接取得来自单细胞的遗传信息，因此，用于重建诸如基因组信息等的计算难度比元基因组分析要容易得多。但是，为了无遗漏地解码细胞内的极少量的基因组序列，要求高精度的细胞处理和核酸反应。

单细胞基因组分析步骤大致可分为：(1)分离微生物的单细胞；(2)微生物的裂解；(3)全基因组扩增以及(4)扩增基因组的序列分析。但是，传统的分子生物学实验中使用的数十微升的反应系统不适合根据上述的流程进行精确处理所谓单细胞的极小样品。具体而言，当通过流式细胞术等分选又小又不定型的各种微生物时，难以分开识别除生物体以外的粒子和微生物并进行回收。在对所分离的微生物样品进行操作时，大容量反应系统中经常发生来自实验环境或样品、实验人员的核酸的污染，得到正常的扩增产物的收率较低，大部分解码的序列源自无关的污染是很常见的。

进而，即使通过信息处理来仅提取正确的序列，基因组解码率也仍保持在约30％。在开放的实验环境中难以完全防止来自气溶胶等的污染，因此需要专用于单细胞基因组分析实验的干净的实验环境。另外，另一个问题是，针对从每一个细胞进行测序的必要性，反应系统的生产能力极低，并且昂贵的点胶机器人等已用于实验操作中。

发明内容

解决技术问题的方案

就本发明的一个方面而言，提供用于扩增细胞中的多核苷酸的方法。该方法可包括：使用包含两个以上细胞或细胞样结构的样品，将细胞或细胞样结构以一个细胞或一个结构单位包封到液滴中的工序；使液滴凝胶化以生成凝胶胶囊的工序；将凝胶胶囊浸入一种以上的裂解用试剂中以裂解所述细胞或细胞样结构的工序，其中，细胞中的多核苷酸洗脱到凝胶胶囊中并以除去与多核苷酸结合的物质的状态保持在凝胶胶囊中；以及使多核苷酸与扩增用试剂相接触以在凝胶胶囊中扩增多核苷酸的工序。就本发明的另一个方面而言，可提供在这种方法中使用的组合物或装置。

本发明的方法、组合物或装置可进一步定义为用于在单细胞水平上确定细胞的基因组序列的方法、组合物或装置。另外，本发明的方法、组合物或装置还可进一步定义为用于制作基因组文库的方法、组合物或装置。

例举以下作为本发明的实施方式示例。

项目A1：一种用于扩增细胞或细胞样结构中的多核苷酸的方法，该方法包括：使用包含两个以上细胞或细胞样结构的样品，将该细胞或细胞样结构以一个细胞或一个结构单位包封到液滴中的工序；使该液滴凝胶化以生成凝胶胶囊的工序；将该凝胶胶囊浸入一种以上的裂解用试剂中以裂解所述细胞或细胞样结构的工序，其中，该细胞中的多核苷酸洗脱到该凝胶胶囊中并以除去与该多核苷酸结合的物质的状态保持在所述凝胶胶囊中；以及使该多核苷酸与扩增用试剂相接触以在凝胶胶囊中扩增该多核苷酸的工序。

项目A2：一种在单细胞水平上确定细胞的基因组序列的方法，该方法包括从通过上述项目所述的方法扩增的多核苷酸确定所述细胞的基因组DNA的整个序列的工序。

项目A3：一种基因组文库的制作方法，该方法包括对通过上述项目的任一项目中所述的方法而所述多核苷酸被扩增的的凝胶胶囊的每一个进行分选并分别收集的工序。

项目A4：在上述项目的任一项目中所述的方法中，所述细胞包含微生物细胞。

项目A5：上述项目的任一项目中所述的方法，其特征在于，在将所述凝胶胶囊浸入所述裂解用试剂中之后，从所述凝胶胶囊除去所述裂解用试剂及夹杂物质。

项目A6：上述项目的任一项目中所述的方法，其特征在于，通过使所述细胞或细胞样结构的悬浮液在微通道中流动并用油剪切所述悬浮液来制作包封所述细胞或细胞样结构的所述液滴。

项目A7：上述项目的任一项目中所述的方法，其特征在于，所述液滴的直径为1～250μm。

项目A8：上述项目的任一项目中所述的方法，其特征在于，所述凝胶胶囊的直径为1～250μm。

项目A9：上述项目的任一项目中所述的方法，其特征在于，所述凝胶胶囊由琼脂糖、丙烯酰胺、光固化树脂、PEG、明胶、海藻酸钠、基质胶或胶原蛋白形成。

项目A10：上述项目的任一项目中所述的方法，其特征在于，所述裂解用试剂为从由溶菌酶、labiase、丝状真菌细胞壁溶解酶(yatalase)、无色肽酶、蛋白酶、核酸酶、酵母裂解酶、壳多糖酶、溶葡球菌酶(lysostaphin)、变溶菌素、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、苯酚、氯仿、盐酸胍、尿素、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、TCEP-HCl、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、辛基葡萄糖苷、辛硫基葡萄糖苷、CHAPS、CHAPSO、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、Nonidet P-40及Zwittergent 3-12组成的组中选择的至少一种。

项目A11：上述项目的任一项目中所述的方法，其特征在于，所述凝胶胶囊为水凝胶胶囊。

项目A12：上述项目的任一项目中所述的方法，其特征在于，所述扩增的工序通过等温链置换扩增反应进行。

项目B1：一种用于扩增细胞中的多核苷酸的装置，其特征在于，包括：液滴制作部，用于将细胞或细胞样结构以一个细胞或一个结构单位包封到液滴中；凝胶胶囊生成部，用于使所述液滴凝胶化以生成凝胶胶囊；裂解用试剂浸入部，用于将所述凝胶胶囊浸入裂解用试剂中；除去部，用于从所述凝胶胶囊除去夹杂物质；以及扩增用试剂浸入部，用于将所述凝胶胶囊浸入扩增用试剂中。

项目B1-1：上述项目中所述的装置，包括上述项目的一个或多个项目中所述的特征。

项目B2：上述项目的任一项目中所述的装置，其特征在于，还包括用于对在扩增用试剂浸入部中扩增的多核苷酸中的核酸序列进行测序的测序部，所述测序部在单细胞水平上确定细胞的基因组序列。

项目B3：上述项目的任一项目中所述的装置，其特征在于，还包括用于分选所述凝胶胶囊并在收容容器中收容所述凝胶胶囊的分选部，所述分选部用于制作基因组文库。

项目B4：上述项目的任一项目中所述的装置，所述液滴制作部具备微通道。

项目C1：一种用于在单细胞水平上扩增细胞中的核酸的组合物，包含凝胶胶囊或其材料。

项目C2：一种用于制作基因组文库的组合物，包含凝胶胶囊或其材料。

项目C3：一种用于在单细胞水平上扩增细胞中的核酸的组合物，包含凝胶胶囊或其材料、及单细胞状态的细胞。

项目C4：一种用于制作基因组文库的组合物，包含凝胶胶囊或其材料、及单细胞状态的细胞。

项目C5：一种用于在单细胞水平上对细胞中的核酸进行测序的组合物，包含凝胶胶囊或其材料、及单细胞状态的细胞。

项目D1：一种包含裂解用试剂的组合物，用于在单细胞水平上扩增细胞中的核酸，该裂解用试剂包含从由溶菌酶、labiase、丝状真菌细胞壁溶解酶、无色肽酶、蛋白酶、核酸酶、酵母裂解酶、壳多糖酶、溶葡球菌酶、变溶菌素、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、苯酚、氯仿、盐酸胍、尿素、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、TCEP-HCl、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、辛基葡萄糖苷、辛硫基葡萄糖苷、CHAPS、CHAPSO、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、Nonidet P-40及Zwittergent 3-12组成的组中选择的至少一种。

项目D1-1：上述项目的任一项目所述的组合物，包括所述项目的一个或多个项目中所述的特征。

项目E1：一种试剂盒，用于在单细胞水平上扩增细胞中的核酸，该试剂盒包含凝胶胶囊的材料以及根据需要来包含的一种以上的试剂。

项目E2：上述项目中所述的试剂盒，所述一种以上的试剂包含裂解用试剂。

项目E3：上述项目的任一项目所述的试剂盒，所述裂解用试剂包含从由溶菌酶、labiase、丝状真菌细胞壁溶解酶、无色肽酶、蛋白酶、核酸酶、酵母裂解酶、壳多糖酶、溶葡球菌酶、变溶菌素、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、苯酚、氯仿、盐酸胍、尿素、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、TCEP-HCl、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、TritonX-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、辛基葡萄糖苷、辛硫基葡萄糖苷、CHAPS、CHAPSO、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、Nonidet P-40及Zwittergent 3-12组成的组中选择的至少一种。

项目E3-1：上述项目的任一目项所述的试剂盒，包括上述项目的一个或多个项目中所述的特征。

在本发明中，除了明确提出的组合之外，还可通过进一步组合来提供上述的一个或多个特征。本领域技术人员只需根据需要阅读并理解以下详细的说明就可理解本发明的其他实施方式及优点。

发明的效果

根据本发明，可容易地分析细胞群中的每个单细胞。尤其，根据本发明，可简单地进行细胞群在单细胞水平上的基因组扩增及其测序。

附图说明

图1为示出本发明的实施例1的微通道的图。

图2为示出本发明的实施例1的在管中收容的微小液滴的图。

图3为示出本发明的实施例1的在管中收容的凝胶胶囊的图。

图4为示出本发明的实施例1的单细胞扩增基因组文库的制作工序的图。

图5为示出本发明的实施例1的用SYBR绿染色的凝胶胶囊内的基因组DNA的图。

图6为示出本发明的实施例1的基因组文库的制作装置的简图。

图7为本发明的实施例1的从1Tb碱基序列数据获得的微生物基因组数的比较图。

具体实施方式

以下，在示出最佳方式的同时描述本发明。在说明书全文中，应理解的是，除非另有说明，单数形式的表示还包括复数形式的概念。因此，应理解的是，除非另有说明，单数形式的冠词(例如，英语中的“a”、“an”、“the”等)包括其复数形式的概念。另外，应理解的是，除非另有说明，本说明书中所使用的术语以本领域中通常使用的含义来使用。因此，除非另有定义，本说明书中使用的所有专业术语及科技术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

定义

以下，对本说明书中特别使用的术语的定义和/或基本的技术内容进行适当说明。

在本说明书中，术语“细胞”是指包含具有遗传信息的分子的粒子，并且是可以复制(无论是否可以单独复制)的任意粒子。作为本说明书中的“细胞”，包括单细胞生物的细胞、细菌、衍生自多细胞生物的细胞、真菌等。

在本说明书中，术语“细胞样结构”是指包含具有遗传信息的分子的任意粒子。作为本说明书中的“细胞样结构”，包括细胞内小器官，例如线粒体、细胞核及叶绿体以及病毒等。

在本说明书中，术语“凝胶”是指在胶体溶液(溶胶)中，高分子物质或胶体粒子通过它们的相互作用来整体上形成网络结构，并且在包含大量作为溶剂或分散介质的液相的情况下失去流动性的状态。在本说明书中，术语“凝胶化”是指将溶液改变为“凝胶”的状态。

在本说明书中，术语“凝胶胶囊”是指能够在其中保持细胞或细胞样结构的凝胶状细粒子状结构。

在本说明书中，术语“基因分析”是指检查生物样品中的核酸(DNA、RNA等)的状态的分析。在一个实施方式中，基因分析可例举使用核酸扩增反应的示例。包括这种分析，作为基因分析的示例，可例举有测序、基因分型/多态性分析(SNP分析、拷贝数多态性、限制酶片段长度多态性、重复数多态性)、表达分析、荧光消光探针(Quenching Probe：Q-Probe)、SYBR green法、熔解曲线分析、实时PCR、定量RT-PCR、数字PCR等。

在本说明书中，术语“单细胞水平”是指以区别于包含在其他细胞或细胞样结构中的遗传信息的状态来处理包含在一个细胞或细胞样结构中的遗传信息。例如，当扩增“单细胞水平”中的多核苷酸时，特定细胞中的多核苷酸和其他细胞中的多核苷酸以能够区別的状态来分别进行扩增。

在本说明书中，术语“单细胞分析”是指以区别包含在一个细胞或细胞样结构中的遗传信息与包含在其他细胞或细胞样结构中的遗传信息的状态进行分析。

优选实施方式的说明

以下，描述优选实施方式的说明，但应理解的是，该实施方式为本发明的示例，本发明的范围不限定于这些优选实施方式。还应理解，本领域技术人员可参考如下所述的优选实施例来在本发明范围内容易地进行修改、变更等。对于这些实施方式，本领域技术人员可适当地组合任意实施方式。

细胞中的多核苷酸扩增方法

在一个方面，本发明提供用于扩增细胞中的多核苷酸的方法。该扩增方法包括：使用包含两个以上细胞或细胞样结构(例如，包含病毒、小器官(Mt、Nuc)等)的样品，将该将细胞或细胞样结构以一个细胞或一个结构单位包封到液滴中的工序；使该液滴凝胶化以生成凝胶胶囊的工序；将该凝胶胶囊浸入一种以上的裂解用试剂中以裂解所述细胞或细胞样结构的工序，其中，该细胞中的多核苷酸洗脱到该凝胶胶囊中并以除去与该多核苷酸结合的物质的状态保持在所述凝胶胶囊中；以及使该多核苷酸与扩增用试剂相接触以在凝胶胶囊中扩增该多核苷酸的工序。本发明的扩增方法可以单独扩增在所谓的单细胞水平上的基因组或与其类似的基因组合体。本发明的扩增方法通过非常简单的方法实现单独的基因组扩增，因此，可对于100个单位、1000个单位、1万个单位、10万个单位或更高单位的细胞一次获得基因组信息，因此可用作文库。

本发明的方法中的向液滴内的包封工序，可采用在下文(液滴生成)的项目或其他项目中详述的任意实施方式。

在一个实施方式中，可以在本发明的扩增方法中靶向的细胞或细胞样结构，为2以上的任意数字，可以为例如10个以上、50个以上、100个以上、500个以上、1000个以上、5000个以上、1万个以上、5万个以上、10万个以上、50万个以上、100万个以上、500万个以上、1000万个以上。与使用以往的单细胞反应系统、例如0.2mL、1.5mL微管反应系统的情况相比，本发明的扩增方法可靶向多个细胞。

作为可在本发明的扩增方法中靶向的细胞或细胞样结构，可采用在(细胞及细胞样结构)的项目中所描述的任意细胞或细胞样结构。在一个优选实施方式中，可靶向细胞。在另一个实施方式中，靶向细胞样结构，其中可靶向病毒或诸如线粒体、核等的细胞小器官。

在本发明的扩增方法中，能够以多种形式提供包含所提供的细胞或细胞样结构的样品。对于包含在样品中的介质，可针对从(细胞及细胞样结构)的项目中选择的任意细胞或细胞样结构选择适当的介质(包括缓冲液、盐、营养素、其他成分等)。作为这种成分，只要是适合液滴生成的成分，可使用任何成分。优选该成分也适合于进行凝胶化。作为这种成分，可例举有PBS、Tris-HCl、TE、HEPES等缓冲液，除此之外可例举消毒水、海水、人造海水、各种液体培养基等，但不限定于此。为了生成液滴，可优选不包含表面活性剂的水、缓冲液等介质。

在本说明书中，将细胞或细胞样结构以每次一个细胞或一个结构单位进行的向液滴中的包封，可采用(液滴制作)的项目中所述的任意实施方式。具代表性的为使用微通道，并使细胞或细胞样结构的悬浮液在微通道中流动，通过剪断悬浮液来制作包封了每一个细胞或细胞样结构的液滴，除了(液滴制作)中的说明之外，本领域技术人员可参考实施例中例示的代表例来制备适当成分或参数来实施。

在本发明的扩增方法中，使液滴凝胶化以生成凝胶胶囊的工序，可采用下文(凝胶化)的项目中所述的任意实施方式。

在一个实施方式中，凝胶化可通过冷却所制作的液滴来进行，该所制作的液滴以在液滴或液滴的材料(例如，包含细胞或细胞样结构的样品)中包含凝胶胶囊的材料的方式形成，或者，可通过光等的刺激来使其凝胶化。

作为凝胶胶囊的材料，可使用下文(凝胶化)的项目中所述的任意材料。

在本发明中，裂解细胞或细胞样结构的工序，可通过向一种以上的裂解用试剂中浸入凝胶胶囊来实现，并且可采用下文(裂解)的项目中所述的任意实施方式。

在这里，在裂解细胞或细胞样结构的工序中，重要的是，细胞中的多核苷酸洗脱在该凝胶胶囊内并以除去结合在该多核苷酸的物质的状态下保持在该凝胶胶囊内。

如此，为了维持已将结合在多核苷酸中的物质除去的状态，通过分阶段或同时添加多种裂解剂，来确实可靠地破坏细胞或细胞样结构的细胞壁/细胞膜结构，甚至需要使包含在细胞内的蛋白质、结合在多核苷酸的物质变性。裂解通过从破坏细胞外层分阶段添加试剂来实现。进而，裂解操作之后残留在凝胶胶囊内的裂解物及所述裂解试剂会抑制后续阶段中的多核苷酸扩增，因此会优选使用适当的洗涤液使其通过凝胶胶囊内，将所述抑制物质释放至凝胶胶囊外。为了在凝胶胶囊内完成这些操作，会优选采用水凝胶结构，该结构在将多核苷酸保持在凝胶胶囊内的同时实现各种药物溶液和细胞裂解物的渗透、释放。也可以通过使用凝胶胶囊来保持遗传物质，此时稀释残留试剂。此步骤也可重复实施。通过将试剂稀释至不引起抑制的水平，可顺利地进行诸如扩增反应等下游操作。

在本发明中，在凝胶胶囊中扩增多核苷酸的工序，可通过使多核苷酸与扩增用试剂相接触来实现，可采用下文(扩增)中规定的任意实施方式。

液滴生成

本发明可包括使用包含两个以上细胞或细胞样结构的样品来将细胞或细胞样结构以一个细胞或一个结构单位包封到液滴中的工序。另外，在本发明中，装置可具备用于将细胞或细胞样结构以一个细胞或一个结构单位包封到液滴中的液滴制作部。

液滴制作例如可使用微通道来进行。液滴制作部可具有微通道。通过使细胞或细胞样结构的悬浮液在微通道中流动并剪切悬浮液，可制作已将每一个细胞或细胞样结构包封的液滴。剪切能够以规定间距进行。悬浮液的剪切可用油来进行。作为油，可使用例如矿物油(例如，轻质矿物油)、植物油、硅油、氟化油。通过调节悬浮液的浓度、通道中的流速、剪切间距，本领域技术人员可按照使得每个液滴不包封一个以上的细胞或细胞样结构的方式制作液滴。

液滴的直径为约1～250μm，更优选地，可为约10～200μm，例如，液滴的直径可为约1μm、约5μm、约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约40μm、约50μm、约80μm、约100μm、约150μm、约200μm或约250μm。

凝胶化

本发明可包括使液滴凝胶化以生成凝胶胶囊的工序。另外，在本发明中，装置可具备用于使液滴凝胶化以生成凝胶胶囊的凝胶胶囊生成部。液滴的凝胶化构成为液滴中含有凝胶胶囊的材料，可通过冷却所制作的液滴来进行。或者，还可针对液滴提供光等刺激来进行凝胶化。为了使液滴中含有凝胶胶囊的材料，例如可通过将凝胶胶囊的材料包含在细胞或细胞样结构的悬浮液中来完成。

凝胶胶囊的直径可为约1～250μm，更优选地，可为约10～200μm，例如，可为约1μm、约5μm、约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约40μm、约50μm、约80μm、约100μm、约150μm、约200μm或约250μm。凝胶胶囊的直径可与制作的液滴相同，但当凝胶化时直径可改变。

凝胶胶囊的材料可包含琼脂糖、丙烯酰胺、光固化树脂(例如，PEG-DA)、PEG、明胶、海藻酸钠、基质胶、胶原蛋白等。

凝胶胶囊可以为水凝胶胶囊。在本说明书中，术语“水凝胶”是指由高分子物质或胶体粒子的网络结构保持的溶剂或分散介质为水的凝胶。

在从大量的细胞一次提取DNA的情况等时，可通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀来纯化DNA。然而，在试图从单细胞取得、分析遗传物质的情况下，每个细胞的遗传物质的量非常少，并且有必要在没有损失的情况下单独转化为只有核酸的状态。对于单细胞，尝试通过通常的大规模的流程来进行核酸纯化，结果要么完全提取不出核酸，要么仅提取源自夹杂物的核酸。污染或目标遗传物质的损失是单细胞实验中的主要问题，但通过使用包封了单细胞或细胞样结构的凝胶胶囊，可在凝胶胶囊中保持所纯化的遗传物质(例如，DNA)，另外，可排除源自外部的分子的夹杂。另外，即便在操作方面也可以用非常简单的操作来并行处理大量的单细胞。可进行所谓对包含凝胶化后的液滴的试管进行离心后除去上清液并置换为洗涤液的步骤。或者，也可以进行所谓通过用过滤器对凝胶化后的液滴进行过滤、除去上清液液之后使洗涤液通过并最终回收凝胶胶囊的步骤。通过使用凝胶胶囊，可在保持遗传物质的状态下稀释残留试剂。该步骤也可以反复进行。通过稀释试剂至不引起抑制的水平，可顺利地进行诸如扩增反应等下游操作。

就本发明的一个方面而言，可提供包含凝胶胶囊或其材料的组合物。从上述的或下文的观点来看，这种组合物对于在单细胞水平上扩增细胞中的核酸可以是有用的。另外，这种组合物对于制作基因组文库可以是有用的。在另一个实施方式中，可提供包含凝胶胶囊或其材料、和单细胞状态的细胞的组合物。从上述的或下文的观点来看，这种组合物对于在单细胞水平上扩增细胞中的核酸可以是有用的。另外，这种组合物对于制作基因组文库可以是有用的。这种组合物对于在单细胞水平上对细胞中的核酸进行测序可以是有用的。

裂解

本发明可包含将凝胶胶囊浸入一种以上的裂解用试剂中以裂解所述细胞或细胞样结构的工序。另外，在本发明中，装置可具备用于将凝胶胶囊浸入裂解用试剂中的裂解用试剂浸入部。当裂解时，细胞中的多核苷酸可洗脱到凝胶胶囊内中并能够以除去与多核苷酸结合的物质的状态保持在凝胶胶囊中。裂解用试剂中例如有酶、表面活性剂、其他改性剂、还原剂及pH调节剂，还可使用它们的组合。就本发明的一个方面而言，可提供包含裂解用试剂的组合物，该组合物用于在单细胞水平上扩增细胞中的核酸。

裂解用试剂可包含从由溶菌酶、labiase、丝状真菌细胞壁溶解酶、无色肽酶、蛋白酶、核酸酶、酵母裂解酶、壳多糖酶、溶葡球菌酶、变溶菌素、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、苯酚、氯仿、盐酸胍、尿素、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、TCEP-HCl、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、辛基葡萄糖苷、辛硫基葡萄糖苷、CHAPS、CHAPSO、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、Nonidet P-40、Zwittergent 3-12组成的组中选择的至少一种。裂解用试剂有时为从由溶菌酶、无色肽酶、蛋白酶、十二烷基硫酸钠及氢氧化钾组成的组中选择的至少一种。

当仅以检测细胞或细胞样结构中一部分序列的存在与否为目的时，则不一定需要进行的细胞或细胞样结构的裂解，还可基于因物理刺激或热刺激引起的源自细胞或细胞样结构的核酸泄露来进行检测。然而，为了从单细胞获得整个基因组等的大量信息，优选积极破坏细胞或细胞样结构，并以完整的状态从细胞分离其中的遗传物质。另外，当使用凝胶胶囊时，热刺激、机械刺激可能导致凝胶胶囊的崩解，并且会有优选使用裂解试剂的情况。

关于多种微生物，在逐个细胞进行核酸的扩增或分析时，作为裂解试剂或裂解试剂的组合，期望使用在某种程度上强的裂解试剂或裂解试剂的组合。例如，革兰氏阳性细菌的细胞壁具有厚厚的肽聚糖层，因此有可能仅温和的细菌无法充分裂解细胞。

强裂解试剂有可能抑制DNA扩增等反应，优选在下游反应之前将其充分除去。当使用凝胶胶囊时，待分析或扩增的遗传物质由凝胶胶囊加以保持，从而即使在遗传物质的量少的单细胞分析中也可以除去裂解试剂。因此，可使用强裂解试剂或裂解试剂的组合。此外，使用强裂解试剂或裂解试剂的组合可实现全面的核酸扩增或基因组分析，而与多种细胞(包括具有细胞壁的或其他种类的微生物)无关。其方法可包括从凝胶胶囊除去裂解用试剂和/或夹杂物质的工序。另外，裂解用试剂浸入部具有从凝胶胶囊除去裂解用试剂和/或夹杂物质的机构。

当目标分子为细胞表面标记物或核酸的一部分，且目的为检测其存在自身时，即使裂解操作是部分性的或未进行裂解操作，也可实现目的。另一方面，当试图扩增基因组DNA的全长时，基因组DNA通常在细胞中仅存在一个分子，因此需要使细胞或细胞样结构的完全裂解并从DNA充分除去结合蛋白质类。由此，将由肠道微生物等数百种以上的微生物组成的标本作为对象时，可将其全部均匀裂解，并可对其全部进行全基因组扩增。另外，由此可进行文库的制备并最终获得全基因组序列信息。

扩增

本发明可包括使多核苷酸与扩增用试剂相接触以在凝胶胶囊内扩增多核苷酸的工序。另外，在本发明中，装置可具备用于将凝胶胶囊浸入扩增用试剂中的扩增用试剂浸入部。扩增用试剂浸入部还可具有在向扩增用试剂中的浸入之后根据需要来调节凝胶胶囊的温度的机构。

伴随加热处理(80度以上)的反应有可能引起凝胶(例如，琼脂糖凝胶)的回溶(re-dissolution)，因此存在破坏单独粒子化的形状并使单细胞分离无效的情况。在这种情况下，因为约60度以下的酶反应保持凝胶液滴形状，所以优选。等温链置换扩增反应(multiple displacement amplification)可在该温度范围内进行，另外，可实现整个基因组DNA的扩增，在这一点是优选的。作为所用的酶，可例举例如phi29聚合酶、Bst聚合酶、Aac聚合酶、重组酶聚合酶。

当进行以检测特定细胞(例如，特定微生物)作为目的的PCR时，通常使用与该微生物对应的特定引物。然而，当扩增整个基因组时，优选使用随机引物。

基于基因组DNA，细胞中存在数千至数万种mRNA，每种的分子量也很大。因此，在RNA作为对象的表达分析中，以绝对(相对)地要求基因的种类或表达量作为目的，可仅读取一部分基因(数十个碱基)即可定量哪个基因有何种程度的表达。当靶向基因组DNA时，原则上，基因组DNA在单细胞中仅存在一个分子，因此在不泄露的情况下增加其仅一个分子的序列信息就需要对其数百万碱基均进行解码。在凝胶胶囊中的处理对于这种扩增是有利的。另外，在单细胞分析中有利的是，可从一个细胞整体获得用于测序的核酸而不是各一部分的片段信息。

细胞及细胞样结构

在本发明中，靶向的细胞或细胞样结构没有特别限定，但例如为微生物(例如细菌、真菌、单细胞动物)、多细胞生物的细胞(例如体细胞、生殖细胞、培养细胞、肿瘤细胞、动物细胞、植物细胞)、细胞内器官(线粒体、核、叶绿体)、病毒。

对于基因组序列已知的生物的细胞，可以通过测量RNA来发现其中表达的基因，但在分析基因组序列和/或基因的信息为未知生物时，在分析RNA之前，需要获得基因组自身信息。在那种情况下，利用凝胶胶囊的本发明的方法在单细胞水平上扩增基因组序列是有利的。

在本发明中，可使用包含两个以上细胞或细胞样结构的样品。两个以上细胞可以源自多个生物。作为样品，例如可例举微生物样品、组织样品、共生微生物及宿主生物的混合样品以及包含由动物、人标本提取的微生物及细胞的样品。作为微生物样品，除了细菌菌群样品之外，还可以例举含有两种以下的细胞或细胞样结构的样品、含有真菌等的细菌以外的细胞或细胞用结构的样品。作为包含由人标本提取的微生物及细胞的样品，例举有粪便、唾液、痰、手术清洁液、血液、皮肤/身体粘膜的擦拭液、棉签等，也可以直接使用，但还可在进行了分离细胞或微生物的操作之后使用。

在本发明中，可靶向的微生物没有限定，但可以例举真细菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蓝细菌、球菌、杆菌、螺旋菌、革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、古细菌、真菌等。在本发明中可靶向的细菌为例如Negibacteria、Eobacteria、Deinococci、Deinococci、Deinococcales、Thermales、Chloroflexi、Anaerolineae、Anaerolineales、Caldilineae、Chloroflexales、Herpetosiphonales、Thermomicrobia、Thermomicrobiales、Sphaerobacterales、Ktedonobacteria、Ktedonobacterales、Thermogemmatisporales、Glycobacteria、Cyanobacteria、Gloeobacterophyceae、Gloeobacterales、Nostocophyceae、Synechococcophycidae、Synechococcales、Nostocophycidae、Chroococcales、Oscillatoriales、Nostocales、Pseudanabaenales、Spirochaetes、Spirochaetes、Spirochaetales、Fibrobacteres、Fibrobacteria、Gemmatimonadetes、Gemmatimonadetes、Gemmatimonadales、Chlorobi、Chlorobea、Chlorobiales、Ignavibacteria、Ignavibacteriales、Bacteroidetes、Bacteroidia、Bacteroidales、Flavobacteriia、Flavobacteriales、Sphingobacteriia、Sphingobacteriales、Cytophagia、Cytophagales、Planctomycetes、Planctomycea、Planctomycetales、Phycisphaerae、Phycisphaerales、Chlamydiae、Chlamydiae、Chlamydiales、Verrucomicrobia、Verrucomicrobiae、Verrucomicrobiales、Opitutae、Opitutales、Puniceicoccales、Spartobacteria、Chthoniobacterales、Lentisphaerae、Lentisphaeria、Lentisphaerales、Victivallales、Proteobacteria、Alphaproteobacteria、Rhodospirillales、Rickettsiales、Rhodobacterales、Sphingomonadales、Caulobacterales、Rhizobiales、Parvularculales、Kordiimonadales、Sneathiellales、Kiloniellales、Betaproteobacteria、Burkholderiales、Hydrogenophilales、Methylophilales、Neisseriales、Nitrosomonadales、Rhodocyclales、Procabacteriales、Gammaproteobacteria、Chromatiales、Acidithiobacillales、Xanthomonadales、Cardiobacteriales、Thiotrichales、Legionellales、Methylococcales、Oceanospirillales、Pseudomonadales、Alteromonadales、Vibrionales、Aeromonadales、Enterobacteriales、Pasteurellales、Deltaproteobacteria、Desulfurellales、Desulfovibrionales、Desulfobacterales、Desulfarculales、Desulfuromonadales、Syntrophobacterales、Bdellovibrionales、Myxococcales、Epsilonproteobacteria、Campylobacterales、Nautiliales、Acidobacteria、Acidobacteria、Acidobacteriales、Holophagae、Holophagales、Acanthopleuribacterales、Aquificae、Aquificae、Aquificales、Deferribacteres、Deferribacteres、Geovibriales、Thermodesulfobacteria、Thermodesulfobacteria、Thermodesulfobacteriales、Nitrospirae、Nitrospira、Nitrospirales、Fusobacteria、Fusobacteriia、Fusobacteriales、Synergistetes、Synergistia、Synergistales、Caldiserica、Caldisericia、Caldisericales、Elusimicrobia、Elusimicrobia、Elusimicrobiales、Armatimonadetes、Armatimonadia、Armatimonadales、Chthonomonadetes、Chthonomonadales、Fimbriimonadia、Fimbriimonadales、Posibacteria、Thermotogae、Thermotogae、Thermotagales、Firmicutes、Bacilli、Bacillales、Lactobacillales、Clostridia、Clostridiales、Halanaerobiales、Thermoanaerobacterales、Natranaerobiales、Negativicutes、Selenomonadales、Erysipelotrichia、Erysipelotrichales、Thermolithobacteria、Thermolithobacterales、Tenericutes、Mollicutes、Mycoplasmatales、Entomoplasmatales、Acholeplasmatales、Anaeroplasmatales、Actinobacteria、Actinobacteria、Actinomycetales、Actinopolysporales、Bifidobacteriales、Catenulisporales、Corynebacteriales、Frankiales、Glycomycetales、Jiangellales、Kineosporiales、Micrococcales、Micromonosporales、Propionibacteriales、Pseudonocardiales、Streptomycetales、Streptosporangiales、Dictyoglomi、Dictyoglomia、Dictyoglomales、Chrysiogenetes、Chrysiogenetes、Chrysiogenales、Haloplasmatales等细菌。另外，就其中的多个混合的样品而言，可以对每个细胞进行全面分析。

组合物/试剂盒

就本发明的一个方面而言，提供可在本发明的方法中使用的组合物或试剂盒。在本发明中，可提供用于在单细胞水平上扩增细胞中的核酸的组合物。组合物可包含凝胶胶囊或其材料。如本说明书的其他地方所述，使用凝胶胶囊在单细胞水平上扩增细胞中的核酸的这一点上可以是有利的。在本发明中，可提供用于制作基因组文库的组合物。如本说明书的其他地方所述，使用凝胶胶囊对制作基因组文库可以是有利的。

在本发明中，可提供包含凝胶胶囊或其材料、及单细胞状态的细胞组合物，其用于在单细胞水平上扩增细胞中的核酸。组合物提供给本说明书的其他地方所述的方法的工序，并可用于在单细胞水平上的核酸扩增。在本发明中，可提供包含凝胶胶囊或其材料、及单细胞状态的细胞的组合物，其用于制作基因组文库。组合物提供给说明书的其他地方所述的方法的工序，用于制作基因组文库。在本发明中，可提供包含凝胶胶囊或其材料、及单细胞状态的细胞组合物，其用于在单细胞水平上对细胞中的核酸进行测序。组合物提供给说明书的其他地方所述的方法的工序，并用于在单细胞水平上的细胞中的核酸测序。

就本发明的一个方面而言，提供包含裂解用试剂的组合物，其用于在单细胞水平上扩增细胞中的核酸。裂解用试剂可包含从由溶菌酶、labiase、丝状真菌细胞壁溶解酶、无色肽酶、蛋白酶、核酸酶、酵母裂解酶、壳多糖酶、溶葡球菌酶、变溶菌素、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、苯酚、氯仿、盐酸胍、尿素、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、TCEP-HCl、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、辛基葡萄糖苷、辛硫基葡萄糖苷、CHAPS、CHAPSO、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、Nonidet P-40、Zwittergent 3-12组成的组中选择的至少一种。

可提供用于在单细胞水平上扩增细胞中的核酸的试剂盒。试剂盒例如可包含凝胶胶囊的材料以及根据需要所包含的一种以上的试剂。作为所述一种以上的试剂，可例举有裂解用试剂。

基因组文库的制作方法及基因组文库的制作装置

本发明可提供从各种微生物纯化多核苷酸到凝胶胶囊中并将在凝胶胶囊中扩增的多核苷酸转化为基因组文库的方法。就本发明的一个方面而言，可提供用简单的操作进行细胞的裂解和基因组扩增的基因组文库的制作方法及基因组文库的制作装置。

当从单个微生物细胞进行基因组分析时，为了对每一个细胞进行基因组扩增反应，需要将细胞一个一个转移至反应容器的操作。在现有的细胞分取技术的流式细胞仪中，难以分离较小的非生物粒子和微生物以提供给反应，且容器中的反应液量过大，以微生物体积的数十亿倍以上的微升计。因此，反应过程中经常发生污染或扩增错误，获得源自纯粹的单细胞的扩增核酸样品的收率较低。

另外，最大并行处理能力限于数百个反应，难以以单细胞单位来从环境中的数千种以上的微生物全面分析基因组DNA。为了解决技术问题，需要如下方法，即以适合一个微生物的规模创建出大量的反应环境，并依次进行细胞裂解或酶促反应，纯化微量的基因组DNA，然后并行扩增以可实现保管和再分析的形状来供应扩增核酸样品。

在WO2017/218486号公报中描述了使用微通道来制作凝胶珠并进行单细胞的分析。然而，在WO2017/218486号公报中没有规定对应于微生物样品的详细条件等。

在日本特表2017-532024号公报中描述了以高通量从单个细胞分离核酸并进行裂解、条形码化等制备的方法和装置。然而，日本特表2017-532024号公报中所述的方法和装置所针对的是mRNA，而不是基因组DNA。另外，无法适用于具有硬细胞壁的微生物样品。

据在Nat Biotechnol.2017Jul；35(7):640-646中发表的“利用微流控液滴条形码进行超高通量单细胞基因组测序(Single-cell genome sequencing at ultra high-throughput with microfluidic droplet barcoding)”中所记载，使用微通道来制作凝胶珠以进行单一微生物细胞的基因组分析。在该文献中所描述的方法中，用酶溶液消化微生物样品，然后将条形码序列附加至基因组DNA，因此在凝胶内部不进行DNA扩增。由于未进行DNA扩增，因此无法进行再分析，并且无法进行针对感兴趣的样品的详细评估。另外，基因组解码率停留在0.1％以下。

据在Nature Methods volume13，pages 759-762(2016)发表的“用于数字定量和单细胞测序的虚拟微流体(Virtual microfluidics for digital quantification andsingle-cell sequencing)”中所记载，使分散有肠道微生物的全部溶剂凝胶化，将微生物溶解在凝胶中，然后扩增基因组。另外，描述了利用针来刺出用荧光色素标记的基因组扩增点，然后回收，再次进行基因组扩增以进行全基因组解码。但是，该文献中描述的凝胶本体尺寸较大，因此溶菌和DNA扩增反应不足，基因组解码率平均低至10％。

“使用液滴微流控技术进行大规模平行全基因组扩增以进行单细胞测序(Massively parallel whole genome amplification for single-cell sequencingusing droplet micro fluidics)”中记载了一种使用特殊微通道的单细胞微生物的基因组扩增法，其中特殊微通道是指微生物细胞与溶菌液一同封闭在液滴中，然后与包含全基因组扩增试剂的第二液滴融合。在该文献的基因组扩增法中，未进行凝胶珠化，因此只能应用弱的溶菌条件，并且只能应用一部分微生物。另外，未进行凝胶化，因此不易进行用于形成文库的分别收集。

本发明的基因组文库的制作方法可包括：使用包含一个以上的微生物的样品，并在液滴中以一次一个细胞的方式包封该微生物的细胞的工序；使所述液滴凝胶化以生成凝胶胶囊的工序；将所述凝胶胶囊浸入一种以上的裂解用试剂中以裂解所述细胞，将多核苷酸洗脱到所述凝胶胶囊中并保持在所述凝胶胶囊中的工序；将所述凝胶胶囊浸入扩增用试剂中以在凝胶胶囊中扩增所述多核苷酸的工序；以及将所述多核苷酸被扩增的凝胶胶囊一个一个进行分选并分别收集的工序。

另外，在本发明的基因组文库的制作方法中，可使所述细胞的悬浮液在微通道中流动并用油剪切所述悬浮液来制作已包封所述细胞的所述液滴。另外，在本发明的基因组文库的制作方法中，所述液滴的直径可以为1～250μm。另外，在本发明的基因组文库的制作方法中，所述凝胶胶囊的直径可以为1～250μm。另外，在本发明的基因组文库的制作方法中，所述凝胶胶囊可由琼脂糖、丙烯酰胺、光固化树脂、PEG、明胶、海藻酸钠、基质胶或胶原蛋白形成。另外，在本发明的基因组文库的制作方法中，所述凝胶胶囊可以为水凝胶胶囊。

另外，在本发明的基因组文库的制作方法中，可包括在将所述凝胶胶囊浸入所述裂解用试剂中之后，从所述凝胶胶囊除去所述裂解用试剂及夹杂物质的工序。

另外，在本发明的基因组文库的制作方法中，所述裂解用试剂可以为从由溶菌酶、labiase、丝状真菌细胞壁溶解酶、无色肽酶、蛋白酶、核酸酶、酵母裂解酶、壳多糖酶、溶葡球菌酶、变溶菌素、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、苯酚、氯仿、盐酸胍、尿素、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、TCEP-HCl、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、TritonX-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、辛基葡萄糖苷、辛硫基葡萄糖苷、CHAPS、CHAPSO、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、Nonidet P-40、Zwittergent 3-12组成的组中选择的至少一种。

另外，在本发明的基因组文库的制作方法中，所述基因组文库的制作方法可以为用于源自未培养微生物的单细胞基因组的文库化并全基因组的分析的细胞处理方法。

另外，在本发明的基因组文库的制作装置中，可包括：液滴制作部，用于已一次一个细胞的方式将细胞包封到液滴中；凝胶胶囊生成部，用于使所述液滴凝胶化以生成凝胶胶囊；裂解用试剂浸入部，用于将所述凝胶胶囊浸入裂解用试剂中；除去部，用于从所述凝胶胶囊除去夹杂物质；扩增用试剂浸入部，用于将所述凝胶胶囊浸入扩增用试剂中；分选部，用于分选所述凝胶胶囊并将所述凝胶胶囊收容在收容容器中。

根据本发明，可提供用简单的操作来进行细胞的裂解以及基因组扩增的基因组文库的制作方法及基因组文库的制作装置。

可以给出以下实施方式来作为基因组文库的制作方法及基因组文库的制作装置的实施方式的示例。

实施方式1：一种基因组文库的制作方法，其特征在于，包括：使用包含一个以上的微生物的样品，并在液滴中以一次一个细胞的方式包封该微生物的细胞的工序；使所述液滴凝胶化以生成凝胶胶囊的工序；将所述凝胶胶囊浸入一种以上的裂解用试剂中以裂解所述细胞，其中将多核苷酸洗脱到所述凝胶胶囊中并保持在所述凝胶胶囊中的工序；将所述凝胶胶囊浸入扩增用试剂中以在所述凝胶胶囊中扩增多核苷酸的工序；以及将扩增了所述多核苷酸的凝胶胶囊一个一个进行分选并分别收集的工序。

实施方式2：根据实施方式1所述的基因组文库的制作方法，其特征在于，包括在将所述凝胶胶囊浸入所述裂解用试剂中之后从所述凝胶胶囊除去所述裂解用试剂及夹杂物质的工序。

实施方式3：根据实施方式1或2所述的基因组文库的制作方法，其特征在于，通过使所述细胞的悬浮液在微通道中流动并用油剪切所述悬浮液来制作包封所述细胞的所述液滴。

实施方式4：根据实施方式3所述的基因组文库的制作方法，其特征在于，所述液滴的直径为1～250μm。

实施方式5：根据实施方式1至4中任一项所述的基因组文库的制作方法，其特征在于，所述凝胶胶囊的直径为1～250μm。

实施方式6：根据实施方式1至5中任一项所述的基因组文库的制作方法，其特征在于，所述凝胶胶囊由琼脂糖、丙烯酰胺、光固化树脂、PEG、明胶、海藻酸钠、基质胶或胶原蛋白形成。

实施方式7：根据实施方式1至6中任一项所述的基因组文库的制作方法，其特征在于，所述裂解用试剂为从由溶菌酶、labiase、丝状真菌细胞壁溶解酶、无色肽酶、蛋白酶、核酸酶、酵母裂解酶、壳多糖酶、溶葡球菌酶、变溶菌素、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、苯酚、氯仿、盐酸胍、尿素、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、TCEP-HCl、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、辛基葡萄糖苷、辛硫基葡萄糖苷、CHAPS、CHAPSO、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、Nonidet P-40、Zwittergent 3-12组成的组中选择的至少一种。

实施方式8：根据实施方式1至7中任一项所述的基因组文库的制作方法，其特征在于，所述凝胶胶囊为水凝胶胶囊。

实施方式9：根据实施方式1至8中任一项所述的基因组文库的制作方法，其特征在于，所述基因组文库的制作方法为用于源自未培养微生物的单细胞基因组的文库化并全基因组的分析的细胞处理方法。

实施方式10：一种基因组文库的制作装置，其特征在于，包括：

液滴制作部，将细胞每次一个包封到液滴中；

凝胶胶囊生成部，用于使所述液滴凝胶化以生成凝胶胶囊；

裂解用试剂浸入部，用于将所述凝胶胶囊浸入裂解用试剂中；除去部，用于从所述凝胶胶囊除去夹杂物质；

扩增用试剂浸入部，用于将所述凝胶胶囊浸入扩增用试剂中；和

分选部，用于分选所述凝胶胶囊并将所述凝胶胶囊收容在收容容器中。

数据/数据库/数据处理

从多个细胞或细胞样结构的集合、以及源自所述细胞或细胞样结构的凝胶胶囊或基因组文库的集合选择用于数据获取或分析的。例如，在本发明中，可生成包含细胞或细胞样结构的亚群，该亚群的生成包括基于该细胞或细胞样结构的核酸序列，从包含两个以上细胞或细胞样结构的集合中生成包含至少一个细胞或细胞样结构的亚群的工序。亚群的生成可降低诸如测序或基于测序读长的基因组草图的创建等工序的工作量。

在本发明的一个实施方式中，可基于源自该细胞或细胞样结构的核酸信息来对分别提供的两个以上细胞或细胞样结构进行分选。根据需要，可分析该分选的细胞或细胞样结构。就分选而言，例如可进行下述分选：由PCR进行测序以对部分序列进行解码、确认有无特定的基因序列、参照DNA产量等。

在本发明的一个实施方式中，可在测序后对源自两个以上细胞或细胞样结构的核酸信息进行分选。在提供源自两个以上细胞或细胞样结构的核酸信息作为每个该细胞或细胞样结构的核酸信息的集合之后，可基于全部或部分该核酸信息，按照该细胞或细胞样结构分选该核酸信息。根据需要，可分析所分选的核酸信息。

在本发明的一个实施方式中，所获得的序列信息可被记录为数据库。数据库可记录在自动数据构建/提供系统上。数据库可分别区别存储源自一个细胞或细胞样结构的序列信息。每个序列信息可分类汇总。作为分类，优选按照生物种类进行分类。所分类的集群(cluster)没有其他种的生物的序列信息的污染，基于此可构建集群内完整的序列信息。当构建完整的序列信息时，还可再分类。从分析中所得的信息还可用于微调新获得的源自一个细胞或细胞样结构的序列信息的分类。

在本说明书中，“或”在可采用文中所列举的事项的“至少一个”时使用。“或者”也与其相同。在本说明书中，当明记为“两个值”的“范围内”时，该范围中也包含两个值本身。

在本说明书中所引用的诸如科学文献、专利、专利申请之类的参考文献，通过全文引用并入本说明书作为参考，其程度与各自具体描述的程度相同。

以上，示出优选实施方式进行说明以使本发明便于理解。在下文中，基于实施例对本发明进行说明，但上述的说明及下文中的实施例仅以例示作为目的来提供，而不是用于限定本发明。因此，本发明的范围不受限于本说明书中具体描述的实施方式和实施例，而是仅由发明要求保护范围限定。

实施例

以下，对于本发明的实施例，参照附加的图1～图7进行说明。在下文中描述的实施例并不用于限定发明要求保护范围中所记载的本发明的内容。另外，在下文中描述的所有构成并非都是本发明的必须要件。

1.来源于小鼠肠道微生物的单细胞扩增基因组文库的制作

以从小鼠粪便采集的小鼠肠道微生物作为样品来制作了单细胞扩增基因组文库17。在本实施例中，提取基因组DNA14并进行扩增以制作基因组文库17，还可提取信使RNA或其他多核苷酸并进行扩增以制作它们的多核苷酸文库。此外，样品可以为仅包含同种微生物的样品，或者可以为包含不同种微生物的样品，只要包含至少一种微生物即可。

在该实验中，将雄性ICR小鼠(66周龄)(东京实验动物公司)的粪便取样到容量1.5mL的管(1212-10,SSIbio)(未图示)中，并在500μL的磷酸缓冲生理盐水(PBS)(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，14190-144，美国赛默飞世尔(Thermo FisherScientific)公司)中使用粉碎机(ASPES-50，日本亚速旺(ASONE)公司)磨碎，直至固体消失。以2000×g离心分离(himac CF15RX，Koki Holdings公司)2秒，回收上清液，重复两次回收上清液的操作之后，以15000×g离心3分钟以对小鼠肠道微生物进行了细菌收集。

用PBS离心清洗菌体颗粒2次之后，通过悬浮在PBS中来获得小鼠肠道微生物的细胞悬浮液。测量所制备的细胞悬浮液中的细胞浓度(显微镜：CKX41，日本奥林巴斯(OLYMPUS)公司；细菌计数板：A161，2-5679-01，日本亚速旺(ASONE)公司)，并添加超低熔点琼脂糖(A5030-10G，美国西格玛奥德里奇(SIGMA-ALDRICH)公司)以使最终浓度为1.5％，从而制作了用于制作凝胶胶囊11的肠道微生物悬浮液1(细胞最终浓度：1.5×10

利用使用聚二甲基硅氧烷(Sylgard 184：美国道康宁(Dow Corning)公司)自制的微通道2，进行微小液滴3的制作以及小鼠肠道微生物单细胞4向微小液滴3中的包封。如图1所示，在本实施例中，由第一通道5、第二通道6、第三通道7及第四通道8形成，使用相邻的通道直角配置的微通道2，但还可使用以大致“T”字形连接的微通道2。本实施例的微通道2使用宽度为34μm、高度为50μm的微通道，但微通道2的尺寸可根据制作的微小液滴3的尺寸或包封的单细胞4的尺寸来适当变更。

接着，从第一通道5(水相入口)引入肠道微生物悬浮液1，从第二通道6及第四通道8(油相入口)引入微液滴氟油试剂(Pico-Surf1，2％in Novec7500)(Sphere Fluidics公司)(以下称为“油10”)，剪切肠道微生物悬浮液1，由此制作直径50μm的微小液滴3，使其在第三通道7流动并回收到容量0.2mL的管9中。以500液滴/秒的速度制作了约450000个微小液滴3。微小液滴3中的细胞浓度为0.1细胞/滴(cells/droplet)。

在本实施例中，通过使微小液滴3的直径均匀且为50μm，从而易于将每个单细胞4包封在微小液滴3中。当考虑到单细胞4的尺寸时，微小液滴3的直径例如为1～250μm，优选20～200μm。

如图2所示，管9中收容有多个微小液滴3和油10，但微小液滴3的比重比油10更轻，因此积聚在上层。

接着，在冰上将管9冷却15分钟，并且用超低熔点琼脂糖使微小液滴3凝胶化。凝胶化的微小液滴3为凝胶胶囊11。微小液滴3的直径为50μm，因此凝胶胶囊11的直径也为50μm。另外，凝胶胶囊11的直径例如为1～250μm，优选20～200μm。通过使凝胶胶囊11的直径均匀，可使下文中的溶菌试剂13向各凝胶胶囊11中的渗透率更加均匀。

接着，向管9中加入20μL的1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇(美国西格玛奥德里奇(SIGMA-ALDRICH)公司)，除去下层的油10，然后依次添加丙酮(日本富士胶片和光纯药公司)(500μL)、异丙醇(500μL)(日本富士胶片和光纯药公司)并离心清洗以除去油10。用于除去油10的离心清洗通过下文中的除去部25来进行。在本实施例中，渗透到凝胶胶囊11中的油10也包含在夹杂物质中。另外，添加500μL的PBS并进行3次离心清洗，成为使凝胶胶囊11悬浮于水层(PBS)12中的状态。如图3所示，凝胶胶囊11的比重大于水层12的比重，因此积聚在下层中。

随后，将凝胶胶囊11依次浸入作为裂解用试剂的溶菌试剂13中，在凝胶胶囊11的内部将细胞4的细胞壁等待收集对象以外的部分加以裂解，使基因组DNA14洗脱在凝胶胶囊11中。

具体而言，向管9中加入作为溶菌试剂13之一的溶菌酶(10U/μL)(R1804M，美国Epicentre公司)，对细胞4进行裂解。接着，向管9中加入作为溶菌试剂13之一的无色肽酶(850U/mL)(015-09951、日本富士胶片和光纯药公司)。接着，向管9中加入作为溶菌试剂13之一的蛋白酶K(1mg/mL)(MC5005，美国普洛麦格(Promega)公司)及十二烷基硫酸钠(SDS)0.5％(71736-100ML，美国西格玛奥德里奇(SIGMA-ALDRICH)公司)，对细胞4进行裂解，然后进行5次离心清洗，从管9除去蛋白酶以及裂解后的细胞4的基因组DNA14以外的成分(夹杂物质)。随后，将凝胶胶囊11浸入Buffer D2(德国凯杰(QIAGEN)公司)中，所述Buffer D2为含有作为溶菌试剂13之一的氢氧化钾的水溶液，以进行残留成分的裂解和基因组DNA14的变性。如上所述，本实施例中使用的溶菌試液13为溶菌酶、无色肽酶、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠及Buffer D2。此外，氢氧化钾还用于通常的DNA扩增反应工序中，但还需兼顾溶菌的效果，因此本实施例中将其用作溶菌试剂13之一。由于凝胶胶囊11在短时间内浸入溶菌试剂13中，因此，洗脱的基因组DNA14保持在凝胶胶囊11中而不会因溶菌试剂13流到凝胶胶囊11的外部。在本实施例中，渗透到凝胶胶囊11的溶菌试剂13也包含在夹杂物质中。

在本实施例中，依次加入溶菌酶、无色肽酶及蛋白酶K，加入十二烷基硫酸钠，对细胞4进行裂解，然后仅在加入Buffer D2之前进行离心清洗，由此可获得充分的清洁效果。然而，还可在通过各溶菌试剂13将细胞4裂解之后进行离心清洗。

如此，可通过多种溶菌试剂13进行细胞4的裂解，来提取目标基因组DNA14，并且通过在浸入溶菌试剂13之后进行离心清洗，以除去溶菌试剂13或裂解后的细胞4的多核苷酸以外的成分等夹杂物质，可纯化基因组DNA14而不会抑制随后的基因组DNA扩增反应。

将扩增用试剂15添加到含有凝胶胶囊11的管9中，并将凝胶胶囊11浸入到扩增用试剂15中，在凝胶胶囊11中保持有在氢氧化钾溶液(Buffer D2)中变性后的基因组DNA14。具体而言，使用了MDA(Multiple Displacement Amplification)法，该方法使用作为链置换型DNA合成酶的phi29DNA聚合酶。在此，浸入全基因组扩增反应试剂REPLI-g单细胞试剂盒(Single Cell Kit)(德国凯杰(QIAGEN)公司)中，进行3小时的全基因组扩增反应(S1000热循环仪，美国伯乐(Bio-Rad)公司)。扩增用试剂15(REPLI-g Single Cell Kit)中含有中和氢氧化钾溶液(Buffer D2)的成分。

使用Tris-EDTA离心清洗全基因组扩增后的凝胶胶囊11，然后如图5所示，使用作为染色用试剂的双链嵌合荧光染色(SYBR Green，S7563，美国赛默飞世尔公司)的荧光DNA嵌入剂进行染色。此外，染色可使用Evagreen(31000，日本Cosmo Bio株式会社)等其他已知的染色用试剂，例如。

通过流式细胞仪30(BD FACSMelody细胞分选仪，美国BD Biosciences公司)分选凝胶胶囊11，该凝胶胶囊11保持扩增了规定以上的基因组DNA14，单独回收到预先添加有1μL的PBS的作为收容容器的培养板16(PCR-96-FS-C，美国爱思进(Axygen)公司)中。此外，关于凝胶胶囊11的分选，还可将凝胶胶囊11滴到载玻片上，并且将在显微镜观察下显示荧光的凝胶胶囊11用微量移液器(例如，Microdispenser、Drummond Scientific等公司)单独提取。

针对所回收的每个凝胶胶囊11，通过在65度下加热(S1000热循环仪，美国伯乐(Bio-Rad)公司)来裂解凝胶胶囊11之后，在各培养板16的孔中通过MDA法进行二次扩增。通过积累大量收容有该凝胶胶囊11的培养板16，可获得来源于小鼠肠道微生物的单细胞扩增基因组文库17。

在二次扩增之前，将凝胶胶囊11群在4℃温度冷藏保存在Tris-EDTA中。可将单细胞扩增基因组文库17在-20℃或-80℃温度下冷冻以长期保存直至其用于随后的实验中。

在这里，参照图6，对单细胞扩增基因组文库17的制作装置18进行描述。制作装置18具备通过微通道2将单细胞4包封到微小液滴3中的液滴制作部19。所生成的微小液滴3收容在管9中。

另外，制作装置18具备使微小液滴3凝胶化以生成凝胶胶囊11的凝胶胶囊生成部20。凝胶胶囊生成部20具有冷却部21，可在将微小液滴3收容在管9中的状态下对其进行冷却。另外，凝胶胶囊生成部20具有以将微小液滴3收容在管9的状态下照射紫外线的紫外线照射部22，可通过使用光固化树脂来生成凝胶胶囊11。此外，可仅具有冷却部21或紫外线照射部22中任一个。

另外，制作装置18具备裂解用试剂浸入部23，该裂解用试剂浸入部23用于将溶菌试剂13注入收容有凝胶胶囊11的管9中并使凝胶胶囊11浸入溶菌试剂13中。溶菌试剂13从裂解用试剂注入部24注入到管9中。

另外，制作装置18具备用于从凝胶胶囊11除去包含油10或溶菌试剂13的夹杂物质的除去部25。除去部25具有离心清洗部26，在溶菌试剂13中浸入凝胶胶囊11规定时间之后，通过离心清洗部26来将溶菌试剂13及夹杂物质从凝胶胶囊11内及管9中除去。

另外，制作装置18具备浸渍在扩增用试剂15中的扩增用试剂浸入部27，该扩增用试剂15使保持在凝胶胶囊11中的基因组DNA14扩增。扩增用试剂15从扩增用试剂注入部28注入管9中。

另外，制作装置18具备用于对保持扩增了规定以上的基因组DNA14的凝胶胶囊11进行分选的分选部29。分选部29具有流式细胞仪30，并且对保持扩增了规定以上的基因组DNA14的凝胶胶囊11进行分选并回收到培养回收到其他容器31中。

2.从单细胞扩增基因组文库进行全基因组解码

接着，从单细胞扩增基因组文库17进行全基因组解码并分析。具体而言，使用单细胞扩增基因组文库17中的各扩增基因组的一部分，对16S rRNA基因的V3V4区域进行PCR法(6.25μL的PrimeSTAR Max DNA Polymerase(R045B，日本宝生物(Takara bio)公司)、0.5μL的10μM正向引物(Primer Forward)(5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’(序列号1))、0.5μL的10μM反向引物(Primer Reverse)(5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’(序列号2))、1.0μL的DNA稀释液、4.25μL的UltraPure DNase/RNase-Free蒸馏水(Distilled Water)(10977-015，美国赛默飞世尔公司)(S1000热循环仪，美国伯乐(Bio-Rad)公司))。PCR的反应条件为：在95℃下初始热变性5分钟，在98℃下热变性10秒钟，在51℃下退火15秒钟，在72℃下延伸反应5秒钟，共进行27个循环，在72℃下反应5分钟之后，在4℃下保存。通过琼脂糖凝胶电泳(电泳槽：Mupid-exU、EXU-1、Mupid，标记物：GeneRuler

其结果，在分析的所有44个单细胞基因组中，有一半的基因组解码率(完成率)超过50％，其中4个超过90％。另外，污染度低至平均1.9％(参照表1)。

表1-1

表1获得的单细胞基因组的评估结果

表1-2

将以上的值与国际标准单菌基因组最小信息(Minimum information about asingle amplified genome，MISAG)(Bowers et al.，Nature Biotechnology 2017 35(8):725-731.doi:10.1038/nbt.3893.4)进行比较，结果，源自从小鼠粪便获得的单细胞的基因组信息是被评估为中等质量到高质量的基因组信息。通过本实施例的方法，可获得革兰氏阳性细菌的基因组信息。

尤其，关于与厚壁菌门柔膜菌纲支原体目(Firmicutes,Mollicutes,Mycoplasmatales)密切相关的新型微生物，获得具有95％以上的完成率的1.76Mb的基因组信息。另外，确认到所获得的新型基因组缺乏与一般的柔膜菌纲微生物相同的脂质及氨基酸合成系统，并推断出是针对小鼠的寄生虫。另一方面，保存有在大部分柔膜菌纲微生物中缺乏的肽聚糖合成系统，并且预期其示出与已知的柔膜菌纲微生物不同的性状。

此外，假设在该实验系统中获得1TB的序列数据，则基因组解码率(完成率)超过50％的样品采集率为5500个单细胞基因组数据、2200个微生物种。这是从以往元基因组序列中同等的数据量分析时的5～17倍(参照图7)。

如上所述，本实施例的基因组文库17的制作方法包括：使用含有一种以上的微生物的样品，将该微生物的细胞的每个单细胞4包封到微小液滴3中的工序；使微小液滴3凝胶化以生成凝胶胶囊11的工序；将凝胶胶囊11浸入一种以上的溶菌试剂13中来裂解细胞4，将基因组DNA14洗脱到凝胶胶囊11中并保持在凝胶胶囊11中的工序；将凝胶胶囊11浸入到扩增用试剂15中并在凝胶胶囊11中扩增基因组DNA14的工序；以及对基因组DNA14被扩增的凝胶胶囊11的每一个进行分选并分别收集的工序。通过上述的基因组文库17的制作方法，可将微生物随机包封在大量生产的凝胶胶囊11中，并单独扩增基因组DNA14。另外，可通过简单的操作连续进行细胞4的裂解和基因组的扩增。另外，可利用相当于常规方法中的一个反应的试剂量来实现数十～数百万个并行单细胞基因组扩增反应，由此可大大降低运行成本。另外，在二次扩增时，可仅选择已进行扩增的凝胶胶囊11，因此可避免针对非生物粒子的不必要的反应操作。另外，在制作单细胞扩增基因组文库17时，通过凝胶胶囊11中包含的足够量的模板数量(相当于皮克)重新开始扩增，从而可有效地抑制因污染分子的扩增而引起的数据劣化。另外，单细胞扩增基因组文库17具有微克容量(相当于一百万个以上细胞的量)，并且可解决通过常规方法获得正常扩增基因组的收率问题。另外，单细胞扩增基因组文库17可在冷藏/冷冻条件下长期保管，不仅可进行全基因组序列解码，还可进行特定基因序列的筛选等再分析。有价值的环境微生物样品的生物信息可作为扩增核酸样品进行永久性再分析，这一点随着DNA测序技术的不断发展成为主要优点。另外，由于不仅可以分析微生物的基因组，还可以同时分析保持在细胞内的质粒信息，因此，可以检测质粒上的物质生成基因或抗性基因。

另外，在本实施例的基因组文库17的制作方法中，包括将凝胶胶囊11浸入到溶菌试剂13中之后从凝胶胶囊11除去溶菌试剂13及夹杂物质的工序，因此，在通常的反应中，即使使用由诸如抑制基因组扩增反应的多种强力试剂组构成的溶菌试剂13，也可以清洁及除去该溶菌试剂13。另外，同时除去污染分子，从而可有效抑制数据劣化。

另外，在本实施例的基因组文库17的制作方法中，使细胞4的肠道微生物悬浮液1在微通道2中流动，并用油10剪切肠道微生物悬浮液1，由此制作包封有细胞4的微小液滴3，从而可制作直径均匀的微小液滴3。

另外，在本实施例的基因组文库17的制作方法中，微小液滴3的直径为1～250μm，例如，直径为20～200μm，由此，可提高细胞4以每个单细胞为单位在微小液滴3中进行包封的概率。

另外，在本实施例的基因组文库17的制作方法中，凝胶胶囊11的直径为1～250μm，例如，直径为20～200μm，可提高细胞4以每个单细胞为单位在微小液滴3中进行包封的概率。

另外，在本实施例的基因组文库17的制作方法中，凝胶胶囊11可由琼脂糖、丙烯酰胺、光固化树脂、PEG、明胶、海藻酸钠、基质胶或胶原蛋白形成，由此可易于制作凝胶胶囊11。

另外，在本实施例的基因组文库17的制作方法中，溶菌试剂13为从由溶菌酶、labiase、丝状真菌细胞壁溶解酶、无色肽酶、蛋白酶、核酸酶、酵母裂解酶、壳多糖酶、溶葡球菌酶、变溶菌素、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、苯酚、氯仿、盐酸胍、尿素、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、TCEP-HCl、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、TritonX-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、辛基葡萄糖苷、辛硫基葡萄糖苷、CHAPS、CHAPSO、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、Nonidet P-40及Zwittergent 3-12组成的组中选择的至少一种，由此，可裂解细胞4的一部分并提取基因组DNA14。

另外，在本实施例的基因组文库17的制作方法中，凝胶胶囊11为水凝胶胶囊，由此，可从微小液滴3生成凝胶胶囊11。

另外，本实施例的基因组文库17的制作方法为用于源自未培养微生物的单细胞基因组的文库化和全基因组的分析的细胞处理方法，由此，有价值的环境微生物样品的生物信息可作为扩增核酸样品进行永久性再分析。

另外，本实施例的基因组文库17的制作装置18包括：液滴制作部19，用于将细胞4以每个细胞为单位包封在微小液滴3中；凝胶胶囊生成部20，用于使微小液滴3凝胶化以生成凝胶胶囊11；裂解用试剂浸入部23，用于将凝胶胶囊11浸入溶菌试剂13中；除去部25，用于从凝胶胶囊11除去夹杂物质；扩增用试剂浸入部27，用于将凝胶胶囊11浸入扩增用试剂15中；以及分选部29，用于对凝胶胶囊11进行分选并在培养板16中收容凝胶胶囊11；由此可将微生物随机包封在大量生产的凝胶胶囊11中，并单独扩增基因组DNA14。另外，可通过简单的操作连续进行细胞4的裂解和基因组的扩增。另外，可利用相当于常规方法中的一个反应的试剂量来实现数十～数百万个并行单细胞基因组扩增反应，由此可大大降低运行成本。另外，在二次扩增时，可仅选择已进行扩增的凝胶胶囊11，因此可避免针对非生物粒子的不必要的反应操作。另外，在制作单细胞扩增基因组文库17时，通过凝胶胶囊11中包含的足够量的模板数量(相当于皮克)重新开始扩增，从而可有效地抑制因污染分子的扩增而引起的数据劣化。另外，单细胞扩增基因组文库17具有微克容量(相当于一百万个以上细胞的量)，并且可解决通过常规方法获得正常扩增基因组的收率问题。另外，单细胞扩增基因组文库17可在冷藏/冷冻条件下长期保管，不仅可进行全基因组序列解码，还可进行特定基因序列的筛选等再分析。有价值的环境微生物样品的生物信息可作为扩增核酸样品进行永久性再分析，这一点随着DNA序列技术的发展成为主要优点。另外，由于不仅可以分析微生物的基因组，还可以同时分析保持在细胞内的质粒信息，因此，可以检测质粒上的物质生成基因或抗性基因。

此外，本发明不限定于上述的实施例，并且可在本发明的主旨范围内进行各种变形。例如，管9或培养板16可使用其他公知的容器。另外，海水、土壤、唾液、痰、手术清洁液、血液、从皮肤/口腔提取的组织及动植物组织粉碎液等也可用作样品。

注释

如上所述，使用本发明的优选实施方式来举例说明了本发明，但本发明不应解释为限于该实施方式。应理解的是，本发明仅应由发明要求的保护范围来解释。应当理解的是，本领域技术人员可基于本发明的描述及技术常识来从本发明的具体优选实施方式的描述实现等效范围。在本说明书中所引用的专利、专利申请及文献应以其内容本身与本说明书中具体描述的内容相同的方式通过引用并入本说明书中以作为针对本说明书的参考。本申请要求基于申请号为日本专利申请第2018-089259号(申请日：2018年5月6日)的日本专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本说明书中作为参考。

工业实用性

本发明可用于生物学的研究、医疗、环境、保健等领域。

附图标记说明

1：肠道微生物悬浮液 2：微通道

3：微小液滴(液滴) 4：小鼠肠道微生物单细胞

5：第一通道 6：第二通道

7：第三通道 8：第四通道

9：管 10：油

11：凝胶胶囊 12：水层

13：溶菌试剂 14：基因组DNA(多核苷酸)

15：扩增用试剂 16：培养板(收容容器)

17：单细胞扩增基因组文库 18：制作装置

19：液滴制作部 20：凝胶胶囊生成部

21：冷却部 22：紫外线照射部

23：裂解用试剂浸入部 24：裂解用试剂注入部

25：除去部 26：离心清洗部

27：扩增用试剂浸入部 28：扩增用试剂注入部

29：分选部 30：流式细胞仪

31：容器

序列表自由文本

序列号1：正向引物

序列号2：反向引物

序列表

<110> 比特拜欧姆株式会社

<120> 进行单细胞分析的方法及其装置

<130> F519PCT055

<150> JP 2018-089259

<151> 2018-05-07

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 2

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55