包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐

本发明涉及包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸(N-[4-[[(2-氨基-1,4,5,6,7,8-六氢-5-甲基-4-氧代-(6S)-蝶啶基(pteridinyl))甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸)和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐及其获得方法。

四氢叶酸盐主要用作5-甲酰基四氢叶酸的钙盐(亚叶酸钙和左旋卵磷脂)，5-甲基四氢叶酸的钙盐

5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐特别用作药物和食品添加剂，用作维生素制剂，用于预防神经管畸形，用于治疗抑郁症和用于影响同型半胱氨酸水平。

已知5-甲基-(6S)-四氢叶酸及其盐非常不稳定。特别是它们极易氧化(在这方面也参见A.L.Fitzhugh，Pteridines 4(4)，187-191(1993))，并因此难以以药物活性成分或食品添加剂可接受的纯度水平生产。

为了克服5-甲基四氢叶酸及其盐的不稳定性，已经采用了各种方法，例如尽可能完全地排除氧或添加抗氧化剂如抗坏血酸或还原的L-谷胱甘肽。

US 6,441,168 B1公开了5-甲基四氢叶酸的碱土金属盐，特别是钙盐，其结晶及其用途。这样的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶钙盐的缺点是它以其晶体形式存在多达四个多晶形变体。因此，必须非常精确地控制5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶钙盐的制备过程。另外，US 6,441,168 B1的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶钙盐通常在其所有多晶形形式的晶格中含有每当量的5-甲基-(6S)-四氢叶酸至少1但多达4当量的水。

药学上有用的化合物的新晶形提供了改进药物和/或维生素/医疗食品的性能概况的机会。它扩大了制剂学家可用于设计具有改进特性的新剂型的材料库。

本发明的根本技术问题是提供包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸的晶形，其克服了本领域已知的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶钙盐的缺点。

另外，新晶形通常显示出期望的不同的物理和/或生物学特性，这可以有助于将活性化合物制备或配制为达到监管批准所需的纯度水平和均匀性。

为了四氢叶酸(盐)的稳定性，一直以来的目的是提供在储存时吸水率低并且在制备过程中可以充分干燥的化合物。另外，非常需要在环境条件下不吸收大量水的药物。特别需要的是当环境相对湿度变化时不改变其水含量的物质，因为由于环境相对湿度的变化而导致的水含量的大的变化使得就剂型而言更难于达到很高的精度。

本发明的根本技术问题通过包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐和/或其水合物和/或溶剂化物解决，其中5-甲基-(6S)-四氢叶酸与4-(2-羟乙基)-吗啉的摩尔比为1：0.3至1：2.0(以mol/mol计)。

本发明的固体形式具有改进的药理学特性，因此提供了调节和设计改进的药品的提高的可能性。与本领域已知的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐的多晶形相比，5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐的吸水率显著低，导致对药物产品中目标剂型水平的控制得到显著改进，因为在相对湿度变化的条件下吸水量的变化显著不那么明显。5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐的另一个有利方面是可以在一个单一的结晶步骤中实现5-甲基-(6S)-四氢叶酸的高化学和光学纯度。另外，包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐的结晶形式以一种明确定义的多晶形变体存在。因此，制备包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐的方法不需要非常精确地控制结晶条件。

优选地，结晶盐的5-甲基-(6S)-四氢叶酸与4-(2-羟乙基)-吗啉的摩尔比为1：0.5至1：1.5(以mol/mol计)。

甚至更优选地，5-甲基-(6S)-四氢叶酸与4-(2-羟乙基)-吗啉的摩尔比为1：0.75至1：1.25(以mol/mol计)。

最优选地，5-甲基-(6S)-四氢叶酸与4-(2-羟乙基)-吗啉的比例为约1∶1(以mol/mol计)。

优选地，本发明的盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐，并且其PXRD图谱具有至少一个选自以下的位于14.2、14.8、19.7、20.0和20.6处的峰的特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)。

更优选地，本发明的盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐，并且其PXRD图谱具有至少三个选自以下的位于14.2、14.8、19.7、20.0和20.6处的峰的特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)。

甚至更优选地，本发明的盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐，并且其PXRD图谱具有选自位于14.2、14.8、19.7、20.0和20.6处的峰的特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)。

甚至更优选地，本发明的盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐，并且其PXRD图谱具有至少一个选自以下的位于4.9、12.2、14.2、14.8、15.1、15.3、17.4、19.7、20.0、20.6、23.6、24.9和28.1处的峰的特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)。

最优选地，本发明的盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐，并且具有基本上如图1所示的PXRD图谱。

上述的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐可以具有至少99wt％或更高的化学和/或立体异构纯度。

5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐与5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐的比较表明，5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐的水含量变化在20％至80％的最相关的范围内变化小于2％(实施例2，图2)，而5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐的水含量变化超过4％(参考例2，图3)。该结果对于本领域技术人员而言是非常令人惊讶的，并且在考虑到US 6,441,168 B1的教导时是无法预期的。而且，本发明的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐清楚地解决了本发明的根本技术问题。

有利的是包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸的盐，其具有例如在温度/湿度可控的环境中或在热带国家(相对湿度通常很高)处理用于复合的物质时非常低的水含量并且尤其是具有低的吸收/解吸水的趋势。

因此，即使在这些条件下，本发明的盐也表现出改进的储存稳定性。考虑到美国专利6,441,168B1的教导，这些改进的性质是不可想到的。

5-甲基-(6S)-四氢叶酸难溶于水。已知在室温下钙盐的热力学稳定形式(形式III)表现出约2.5mg/ml的水溶解度，并且亚稳态形式I的溶解度为约10mg/ml。在某些pH条件下，特别是当环境的pH低于给定盐的平衡pH时，盐可能潜在地歧化成游离酸，结果是溶解度显著降低。因此，由于盐的缓慢歧化(难溶的游离酸的形成)，要求保护的盐在约中性至较低的pH值的热力学溶解度是不可获得的。但是，生物利用度受动力学作用支配。固体形式的药物在给药后溶解，并且在第一个溶解步骤之后，药物被体液稀释并分配。因此，动力学溶解度是影响生物利用度的关键参数，因为最初溶解的药物易于稀释和递送。令人惊讶地发现，对于5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐而言，动力学溶解度相对于已知的钙盐(亚稳态形式I)提高了约三倍。本发明的盐与钙盐的热力学稳定形式(形式III)的动力学溶解度之差异想必更大。因此，可以暂时获得更高的药物物质浓度。

本发明的另一方面是包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐的获得方法，包括以下步骤：

a)提供任选地在合适的溶剂或溶剂混合物中的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的混合物，

b)结晶，

c)任选地添加更多的溶剂或溶剂混合物，和

d)分离得到的晶体。

优选地，步骤a)中的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的摩尔比为1：1至1：3。

进一步优选地，溶剂是水，醇和/或酮。

在步骤b)和/或c)中，可以添加晶种。

由于包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐的晶形仅以一种明确定义的多晶形变体存在，因此结晶盐的制备方法不需要特别精确的控制结晶条件。

本发明的另一方面是药物组合物，食品添加剂和/或制剂，其包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐以及任选的一种或多种可接受的赋形剂，这也是本发明的一部分。药物组合物可以具有片剂，胶囊剂，口服液制剂，散剂，冻干剂，颗粒剂，锭剂，可重构散剂，可注射或可输注的溶液或混悬剂或栓剂的形式。而且，药物组合物可以进一步包含至少一种另外的治疗剂。根据本发明的药物组合物适用于所有给药方式，优选用于口服，肠胃外，肌内，脊柱内，鞘内，牙周，局部或直肠给药。

本发明的另一方面是包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐作为用于生产药物的成分和/或作为食品添加剂的用途。

优选地，包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐用于贫血，神经管缺陷，心血管疾病，抑郁症，阿尔茨海默氏病，认知障碍和骨质疏松症的降低同型半胱氨酸的治疗和/或低血浆叶酸(盐)和/或低血红细胞叶酸(盐)和/或低脑脊液叶酸(盐)和/或低周围或中枢神经系统叶酸(盐)的饮食管理。

总之，本发明的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐所提供的性质概况有利于用于药物或用作食品添加剂。尤其是，在相对湿度20％至80％的环境中的水含量的低变化和较高的动力学溶解性是技术人员不能预见到的。

实施例

粉末X-射线衍射

配备有Mythen1K检测器的Stoe Stadi P；Cu-Kα1辐射；标准测量条件：透射；40kV和40mA的管功率；弯曲锗单色仪；步距为0.02°2θ，步进时间为48s，扫描范围为1.5-50.5°2θ；检测模式：步进扫描；1°2θ检测器步进；标准样品制备：将10至20mg样品置于两片乙酸酯箔之间；样品架：Stoe透射样品架；在测量过程中旋转样品。所有样品的制备和测量均在环境空气中进行。

TG-FTIR

用连接至Bruker FTIR光谱仪Vector 22的Netzsch Thermo-Microbalance TG209(具有针孔的样品盘，N

DVS

DVS测量通常使用来自ProUmid(以前称为“Projekt Messtechnik“),August-Nagel-Str.23,89079Ulm(Germany)的SPS11-100n“Sorptions Prüfsystem”进行。

DVS测量如下进行：将样品放在微量天平顶部的铝制支架上，并在开始预定的湿度程序之前使其在50％RH下平衡：

(1)在50％恒定相对湿度(RH)下保持两个小时，然后

(2)以每小时5％的速率将RH升高到95％

(3)将RH保持在95％五个小时

(4)以每小时5％的速率降低到0％RH

(5)将RH保持在0％五个小时

(6)以每小时5％的速率将RH升高到95％

(7)将RH保持在95％五个小时

(8)以每小时5％的速率降低到0％RH

(9)将RH保持在0％五个小时

(10)以每小时5％的速率升高至50％RH

(11)将RH保持在50％约一小时

实施例1：5-甲基-(6S)-四氢叶酸与4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐的制备

将4.763克5-甲基-(6S)-四氢叶酸一水合物(测定5-甲基四氢叶酸97.65％w/w)称入配备有磁力搅拌棒的玻璃烧瓶中。加入9.5mL水和4.76mL 4-(2-羟乙基)-吗啉(Aldrich#H28203)。在室温下搅拌约2分钟后，形成棕色澄清溶液。在室温下搅拌溶液的同时，在约2.5小时内缓慢加入95mL丙酮。将形成的悬浮液在室温下搅拌约23小时。然后将悬浮液用烧结玻璃过滤器(孔隙率P4)过滤，并将滤饼在环境温度下风干。将100mL乙醇加入滤饼中，并通过真空抽吸将洗涤溶液抽过过滤器。用另外的100mL乙醇重复洗涤步骤。然后将滤饼风干约0.5小时(通过烧结的玻璃过滤器抽吸空气)。获得约5.6克固体产物，并通过HPLC，粉末X-射线衍射，H-NMR光谱和TG-FTIR进行表征。粉末X-射线衍射表明该材料为晶体，具有如图1所示的峰位置的如表1所示的PXRD图谱。

表1：根据实施例1的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐的2-θ角，d-间隔和定性强度。对于强度，Vs＝非常强，s＝强，m＝中，w＝弱，vw＝非常弱。应该注意的是，由于优选的取向效果，强度值可以显著变化。

实施例2：5-甲基-(6S)-四氢叶酸与4-(2-羟乙基)-吗啉的结晶盐的制备

在室温下将47.63克5-甲基-(6S)-四氢叶酸一水合物(测定5-甲基-(6S)-四氢叶酸97.99％w/w，6S-非对映异构体：98.0％)悬浮在95mL水中。加入47.6mL的4-(2-羟乙基)-吗啉，同时在没有冷却的情况下温度升高至约50℃。将混合物冷却至室温。在约2.5小时内向深棕色透明溶液中缓慢加入950mL丙酮。将形成的悬浮液在室温下搅拌约23小时。然后将悬浮液用烧结玻璃过滤器(孔隙率G3)过滤，并将滤饼用1000mL乙醇洗涤。将如此获得的浅米色固体在40℃/10mbar下干燥过夜。获得约52.4克固体产物，并通过HPLC，粉末X-射线衍射和

实施例3：吸湿性和水含量(DVS实验)

根据实施例1的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐的样品的TG-FTIR分析显示该样品包含约8.9％w/w的水。该值通过TG-FTIR在约35％的相对湿度下确定。通过动态水蒸气吸附分析(DVS)在相对湿度0至95％r.h的范围内检查该样品。DVS测量如上所述进行。

5-甲基-(6S)-四氢叶酸与4-(2-羟乙基)-吗啉的盐的结果与5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐的结果的比较表明，5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐的水含量在20％至80％的相对湿度范围内变化约2％，而5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐的变化为约4％(参考例2)。此外，该实施例表明5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐在50％相对湿度下的水含量为约10％，并且当相对湿度从50％增加到95％时该化合物吸收约2％的额外的水。50％r.h.是中欧夏季的典型环境相对湿度条件；然而，当药品存放在浴室中时，相对湿度可暂时达到至少95％。

实施例3：5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐的动力学溶解度

将27.1mg根据实施例1制备的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐称入带有螺帽的7mL玻璃小瓶中，并用可调体积的移液管将0.5mL的纯化/去离子水添加到固体中。在室温下剧烈搅拌该混合物，几秒钟后所有固体溶解并获得澄清溶液。这意味着对于5-甲基-(6S)-四氢叶酸和4-(2-羟乙基)-吗啉的盐，每毫升水可以容易溶解大于54mg。这对应于每毫升水大于37mg的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的即时动力学溶解度。

参考例1：5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐的动力学溶解度

将42.5mg无水形式的结晶的5-甲基-(6S)-四氢叶酸钙盐称重到带有螺帽的7mL玻璃小瓶中。使用可调体积的移液管将2.00mL的纯化/去离子水添加到固体中。将混合物在室温下剧烈搅拌1分钟。一分钟后，观察到悬浮液。通过离心过滤将悬浮液过滤，并将1.50mL的水溶液转移至去了皮重的玻璃小瓶(约10mL的体积)中。将水在空气干燥器中在40℃蒸发约15小时，然后在50℃蒸发约8小时。随后在50℃在真空(10至20mbar)下约13小时完成干燥。通过固体残留物的重量评估来确定溶解度。溶解度为每毫升水9.0mg 5-甲基-(6S)-四氢叶酸。

参考例2：5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐的吸湿性和水含量

5-甲基-(6S)-四氢叶酸钙盐样品的TG-FTIR分析表明，该样品含有约12.4％的水。通过动态水蒸气吸附分析(DVS)在0至95％r.h的相对湿度范围内检查该样品。DVS测量如上所述进行。

结果显示在图3中，并且表明在20％至80％的最相关的范围内，5-甲基-(6S)-四氢叶酸钙盐的水含量变化了约4％。此外，参考例表明5-甲基-(6S)-四氢叶酸钙盐在50％相对湿度下的水含量为约12.4％，并且当相对湿度从50％增加到95％时该化合物吸收多于10％的额外的水。