抗药物抑制的嵌合抗原受体T细胞培养基组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种细胞培养基，具体涉及一种抗药物抑制的嵌合抗原受体T细胞培养基组合物及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)T细胞技术是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。通过基因改造技术，效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态。CAR由胞外区、跨膜区和胞内区三个部分组成，其本质上是由不同蛋白功能结构域串联形成的膜蛋白。

当前主要采用含血清培养基(如IL-2+RPMI1640+FBS培养基)培养CAR-T细胞，但其存在诸多缺点，例如：转染后CAR-T细胞无法大量增殖，且易出现CAR丢失的现象，导致长期培养后T细胞表面的CAR分子逐渐丢失；培养时间有限，导致CAR-T细胞无法达到回输数量；以及，随着细胞培养的进行，T细胞逐渐由记忆性T细胞向效应性T细胞转变，这会导致CAR-T细胞在进入人体后持久性降低。为此，研究人员提出了多种解决方案，但这些方案都只在一定程度上解决了其中的部分问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种抗药物抑制的嵌合抗原受体T细胞培养基组合物及其应用，以克服现有技术中存在的不足。

为实现前述目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种抗药物抑制的嵌合抗原受体T细胞培养基组合物，其包括：500-800IU/ml IL-2、300-600IU/ml IL-7、50-100IU/ml IL-15、1-5wt％B27、2-4wt％自体血浆、10-25μg/mL改性二硫化钼纳米片，余量为RPMI1640培养基。

在一些实施方式中，所述改性二硫化钼纳米片包括二硫化钼纳米片和苯胺二聚体，所述苯胺二聚体通过物理作用结合于二硫化钼纳米片表面。

在一些实施方式中，所述改性二硫化钼纳米片包括质量比为10∶1-3的二硫化钼纳米片和苯胺二聚体。

在一些实施方式中，所述二硫化钼纳米片的片径为1μm以上，厚度为1-2nm。

本发明实施例还提供了所述抗药物抑制的嵌合抗原受体T细胞培养基组合物于培养CAR-T细胞中的用途。

本发明实施例还提供了一种CAR-T细胞的培养方法，其包括：

从正常成人外周血提取T细胞，制作成CD19-CAR-T细胞；

将所述CD19-CAR-T细胞加入所述抗药物抑制的嵌合抗原受体T细胞培养基组合物配制成细胞悬浮液进行培养，培养1-2天后添加新鲜的抗药物抑制的嵌合抗原受体T细胞培养基组合物。

在一些实施方式中，其中CD19-CAR-T细胞的密度为(1～10)×10

在一些实施方式中，其中采用的细胞培养条件为5％CO

本发明实施例还提供了由前述任一种方法培养的CAR-T细胞。

本发明实施例还提供了所述CAR-T细胞于制备抗肿瘤药物中的用途。

较之现有技术，利用本发明培养基培养的CD19-CAR-T细胞在与化学药物联合治疗肿瘤时，能较少受到化学药物的抑制作用，且细胞的成活率、杀伤活性和扩增倍数都得到显著提升。

具体实施方式

通过阅读以下具体实施方式将更完整地理解本发明。本文中揭示本发明的详细实施例；然而，应理解，所揭示的实施例仅具本发明的示范性，本发明可以各种形式来体现。因此，本文中所揭示的特定功能细节不应解释为具有限制性，而是仅解释为权利要求书的基础且解释为用于教示所属领域的技术人员在事实上任何适当详细实施例中以不同方式采用本发明的代表性基础。

若非特殊说明，本说明书中所涉及的技术术语的释义与本领域的常规释义相同，例如：

嵌合抗原受体(CAR)：是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

CAR-T细胞：嵌合抗原受体T细胞。

CD19-CAR-T：靶向CD19分子的嵌合体抗原受体基因修饰的T细胞。

CD3：在免疫学中，CD3(分化簇3)T细胞的共受体是一种蛋白质复合物。在哺乳动物中，该复合物含有一个CD3γ链，CD3δ链，和2CD3ε链。这些链具有被称为一个分子副T细胞受体(TCR)和ζ-链以产生激活信号的T淋巴细胞。该TCR，ζ链和CD3分子一起构成的T细胞受体复合物。

以下结合若干实施例对本发明的技术方案作更为具体的说明。应说明的是，本发明如下实施例提供的培养基中各原料均应是符合美国药典或《国家标准化学试剂》或《中华人民共和国药典》2010年版第二部的超纯或分析纯试剂，以满足临床安全合理的要求。本发明如下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

一、培养基的制备

实施例1一种CAR-T细胞培养基，由作为基础组分的RPMI1640培养基(市购)和添加组分组成。具体的，该组合物包括500IU/ml IL-2、600IU/ml IL-7、100IU/ml IL-15、5wt％B27、4wt％自体血浆、25μg/mL改性二硫化钼纳米片，余量为RPMI1640培养基。其中，改性二硫化钼纳米片包括质量比为10∶1的二硫化钼纳米片和苯胺二聚体，苯胺二聚体通过物理作用结合于二硫化钼纳米片表面。二硫化钼纳米片的片径为1μm以上，厚度为1-2nm。该改性二硫化钼纳米片可以通过如下方法制备，即：在室温下，将二硫化钼纳米片和苯胺二聚体均分散于DMSO中，并持续搅拌1-2h，之后以10000-12000rpm的转速离心分离，取沉淀物以去离子水洗涤3次以上、30-50℃真空干燥。该培养基可以通过将各组分在无菌条件下均匀混合后形成。

实施例2一种CAR-T细胞培养基，由作为基础组分的RPMI1640培养基(市购)和添加组分组成。具体的，该组合物包括800IU/ml IL-2、300IU/ml IL-7、50IU/ml IL-15、1wt％B27、2wt％自体血浆、10μg/mL改性二硫化钼纳米片，余量为RPMI1640培养基。其中，改性二硫化钼纳米片包括质量比为10∶3的二硫化钼纳米片和苯胺二聚体，苯胺二聚体通过物理作用结合于二硫化钼纳米片表面。二硫化钼纳米片的片径为1μm以上，厚度为1-2nm。该改性二硫化钼纳米片的制备方法与实施例1相同。

实施例3一种CAR-T细胞培养基，由作为基础组分的RPMI1640培养基(市购)和添加组分组成。具体的，该组合物包括600IU/ml IL-2、500IU/ml IL-7、80IU/ml IL-15、3wt％B27、3wt％自体血浆、20μg/mL改性二硫化钼纳米片，余量为RPMI1640培养基。其中，改性二硫化钼纳米片包括质量比为5∶1的二硫化钼纳米片和苯胺二聚体，苯胺二聚体通过物理作用结合于二硫化钼纳米片表面。二硫化钼纳米片的片径为1μm以上，厚度为1-2nm。该改性二硫化钼纳米片的制备方法与实施例1相同。

对比例1一种CAR-T细胞培养基，由作为基础组分的RPMI1640培养基(市购)和添加组分组成。具体的，该组合物包括500IU/ml IL-2、600IU/ml IL-7、100IU/ml IL-15、5wt％B27、4wt％自体血浆，余量为RPMI1640培养基。

对照例2(空白组)：一种CAR-T细胞培养基，为RPMI1640培养基(市购)。

二、CAR-T细胞培养

(1)将CD19-CAR-T细胞(杭州启澜生物医学技术有限公司提供)机械分离制成单细胞悬液，分别以实施例1-3及对比例1-2的CAR-T细胞培养基重悬细胞，取细胞密度为2.0×10

(2)培养48h后按照5×10

(3)之后每1～2天补充相应培养基一次，保持细胞密度在5×10

(4)计算细胞的扩增曲线，并取培养到10天和30天的细胞进行流式检测，检测结果请参阅下表1。

表1

注：上表所示的任意一个测试数据均为多组样品测试结果的平均值。

三、CAR-T细胞耐受化学药物抑制能力测试

将CD19-CAR-T细胞(杭州启澜生物医学技术有限公司提供)机械分离制成单细胞悬液，分别以实施例1-3及对比例1-2的CAR-T细胞培养基重悬细胞，取细胞密度为2.0×10

表2

注：上表中P值＜0.05。

尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下作出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。