用于检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增方法的引物组

技术领域

本发明涉及用于检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增方法的引物组，属于猪病学检测领域。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV)是单股环状的DNA病毒。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物鉴定，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associateddiseases，PCVAD)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征，肺炎、猪皮炎、肾病综合征和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。2016年，一种新型的圆环病毒3型病毒（猪圆环病毒3型，porcine circovirus 3，PCV3）首先在美国报道，该病毒基因组长约为2000bp，其能引起猪的皮炎肾病终合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，对猪场疾病控制十分重要。

2019年，我国猪群中发现一种新型猪圆环病毒——猪圆环病毒4型（PCV4），本研究团队第一时间根据在福建地区猪群中也发现PCV4流行，并测到了其全基因组序列（FJ2020001株，GenBank登录号MW238796），其全基因组序列长为1770bp，和GenBank数据库中PCV4代表株HNU-AHG1-2019的核苷酸同源性为99.2%。目前，关于PCV4致病机理、致病力等相关研究均未明确。所以，建立一种简单实用的检测方法对PCV4防控有着重要意义。

目前，对新鉴定的传染病病原的检测方法主要是基于核酸水平的检测，如PCR方法、实时荧光定量PCR方法（real-time PCR）和环介导等温扩增( loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)反应等方法。但是普通的PCR方法以及灵敏度更高的荧光定量PCR方法，均需要使用精密仪器，对实验人员有较高的技术要求等，无法在基层实验室广泛使用。LAMP可在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列。该方法特异性强，灵敏度较PCR方法高，无需PCR仪等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度（60℃-65℃），大大降低了检测的费用，特别适合基层和现地使用。目前，还未见针对PCV4的环介导等温扩增(LAMP)反应方法，但该属其他类型病毒如PCV1、PCV2和PCV3均已经有相应的LAMP检测方法。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增方法的引物组。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

所述检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增方法的引物组，由1对外引物、1对内引物和1对环引物组成，其中所述的外引物由F3和B3组成，内引物由FIP和BIP组成，环引物由LF和LB组成；上述三对引物的序列如下：

F3：5’- GCAAGGGTTTGTGAACCTGAA -3’，

B3：5’- ATTGAGCTGCCGGCATTC -3’，

FIP：5’- CGCGGGCCTGCTCAATATGGAAATGAGGTTCCACCCGTTTA -3’，

BIP：5’-TTGCTCCAAAGGAGGGGACTTACGCCGCTTTAAGGTCGCTG -3’。

LF：5’-CTCCGCTCTCCGATAGCTTT-3’；

LB：5’-TGGAAGTAGGAGAGCCCAGT-3’。

25μL反应体系中含有：2×反应液12.5μL、FIP和BIP（浓度为20 pmol）各2μL、F3和B3（浓度为10 pmol）各0.5μL、LF和LB（浓度为10 pmol）各1μL、模板2μL、Loopamp显色试剂1μL、Bst DNA大片段聚合酶1μL，补充灭菌去离子水至终体积25μL。

本发明还提供了所述的环介导等温扩增反应的引物组在制备猪圆环病毒4型快速诊断试剂中的应用。

本发明优点在于：本发明根据猪圆环病毒4型基因组序列特征，设计特异性的LAMP引物，根据所设计的LAMP引物，建立一种检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增方法。该方法不与猪其他常见传染病发生非特异性反应，本方法特异性强，准确度高，适用性好。敏感性实验表明，本发明所建立的检测方法能在50 min内检测出84 ng/μL的病毒核酸。LAMP反应结束后，直接根据颜色变化进行结果判定，这极大的降低了污染的可能性，提高该方法的现地使用性。

附图说明

图1建立的LAMP方法的特异性，1：PCV1；2：PCV2；3：PCV3；4：PRV；5：PRRSV；6：PCV4。

图2 LAMP敏感性实验电泳结果，1-6：8.4×10

具体实施方式

下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。

实施例1

一、实验方法和步骤

1.1、LAMP实验引物的设计

根据GenBank中登录的所有猪圆环病毒4型基因序列和本研究室从我省（福建省）现地猪场中检测到的猪圆环病毒4型基因组序列（FJ2020001株，GenBank登录号MW238796），利用分子生物学软件进行分析比较，选择猪圆环病毒4型基因组保守区域片段，利用LAMP引物设计的在线网站(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)设计引物，包括1对外引物、1对内引物和1对环引物组成，其中所述的外引物由F3和B3组成，内引物由FIP和BIP组成，环引物LF和LB组成。

上述三对引物的序列如下：

F3：5’- GCAAGGGTTTGTGAACCTGAA -3’，

B3：5’- ATTGAGCTGCCGGCATTC -3’，

FIP：5’- CGCGGGCCTGCTCAATATGGAAATGAGGTTCCACCCGTTTA -3’，

BIP：5’-TTGCTCCAAAGGAGGGGACTTACGCCGCTTTAAGGTCGCTG -3’。

LF：5’-CTCCGCTCTCCGATAGCTTT-3’；

LB：5’-TGGAAGTAGGAGAGCCCAGT-3’。

、毒株

猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）、猪圆环病毒4型（PCV4）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

、病毒核酸的提取

用核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit（北京全式金生物技术有限公司）按照说明书方法进行操作提取猪圆环病毒4型阳性病料的DNA，并按照试剂盒的方法同时提取PCV1、PCV2、PCV3、PRV、PRRSV基因组核酸，均放置－20℃保存备用。

、LAMP的体系的建立

按照Laoopamp DNA 扩增反应试剂盒（环介导等温扩增法DNA扩增试剂盒）配置LAMP试验反应液，反应体系为25μL。每25μL反应体系中含有：2×反应液12.5μL、FIP和BIP（浓度为20 pmol）各2μL、F3和B3（浓度为10 pmol）各0.5μL、LF和LB（浓度为10 pmol）各1μL、模板2μL、Loopamp显色试剂1μL、Bst DNA大片段聚合酶1μL，补充灭菌去离子水至终体积25μL。实验不同温度（60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃）、不同时间（20min、30min、40min、50min、60min）检测引物组反应性能。优化后的反应条件为64℃反应40min。

特异性实验

取PCV1、PCV2、PCV3、PRV提取的DNA；取PRRSV提取RNA后反转录的cDNA，分别为模板进行LAMP反应，重复实验操作2次。

、敏感性试验

以提取的PCV4阳性标准品（倍比稀释，5个浓度，分别为8.4×10

、临床样品的检测

对本研究室收集的135份猪组织病料按照步骤1.3中的方法提取DNA后按照优化的LAMP反应体系和条件进行LAMP检测。

二、实验结果

2.1 肉眼判定

结果发现：对PCV1、PCV2、PCV3、PRV提取的DNA、PRRSV反转录的cDNA按照本发明建立的LAMP方法检测均为阴性；仅对PCV4阳性DNA有很好的扩增，本结果在自然光条件下可以见到的通过明显的颜色区别进行判定（见图1，6号），表明建立的LAMP方法特异性强。

敏感性试验的电泳判定

反应结束后，利用2%普通琼脂糖凝胶电泳检测，结果可见PCV4的浓度在8.4×10

临床样品的检测

对本研究室收集的135份猪组织病料进行LAMP检测，结果可见有阳性样品4份，阳性率为2.96%。将LAMP阳性样品和文献——Novel circovirus species identified in farmedpigs designated as Porcine circovirus 4, Hunan province, China.（TransboundEmerg Dis. 2020, 67(3):1057-1061. doi: 10.1111/tbed.13446.）中的PCR方法（上游引物PCV4-904F ：5′-TGAGGGAGGATGGGCAGTTGTATG-3′和下游引物PCV4-1745R：5′-CACCACCCACAGATGCCAATCA-3′，预期片段大小为842bp）进行对比，4份LAMP阳性样品经常规PCR检测均为阳性，符合率为100%。对相关阳性样品进行克隆测序后BLAST分析，和PCV4对应的核苷酸序列较高，和PCV4分离株FJ2020001株核苷酸同源性均在98.8%以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 用于检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增方法的引物组

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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