柯里拉京在抑制冠状病毒复制从而发挥抗冠状病毒药物功能中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及柯里拉京在抑制冠状病毒复制从而发挥抗冠状病毒药物功能中的应用，柯里拉京具有与冠状病毒的RNA依赖的RNA聚合酶结合的特性，从而可以抑制冠状病毒的RNA依赖的RNA聚合酶的活性，进一步抑制冠状病毒复制。

背景技术

2019冠状病毒病(COVID-19)是由新型冠状病毒SARS-CoV-2(之前称为2019-nCoV)引起的传染病。该病毒主要通过呼吸道飞沫和接触传播，感染者的临床表现为发热、乏力、干咳，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，甚至死亡。目前尚无治疗新型冠状病毒感染的特效抗病毒药物，临床上以对症、支持治疗为主。暂时试用的抗病毒药物有α-干扰素、洛匹那韦/利托那韦、利巴韦林、磷酸氯喹等。因此，针对新型冠状病毒的药物靶点研究以及新药的研发迫在眉睫。

SARS-CoV-2是一种具有包膜的正链单股RNA病毒，颗粒呈圆形或椭圆形，直径约80～120nm。SARS-CoV-2属于冠状病毒科乙型冠状病毒属，是迄今为止发现的第7种可感染人类的冠状病毒。SARS-CoV-2基因组编码16个非结构蛋白，其中，RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp，也称为nsp12蛋白)在RNA的合成过程中起着至关重要的作用，是病毒侵入宿主细胞之后启动其他一切生命活动的关键蛋白质。与病毒的表面抗原蛋白相比，病毒聚合酶发生突变的概率较小，并且具有更高的进化稳定性，显示出作为高效抗病毒药物靶标的巨大前景。因此，针对SARS-CoV-2RNA聚合酶的药物开发将有可能获得能够抗击不同冠状病毒毒株甚至不同病毒的广谱抗病毒药物。

发明内容

本发明的目的是提供柯里拉京在抑制冠状病毒复制从而发挥抗冠状病毒药物功能中的应用。

柯里拉京，CAS号为23094-69-1，中文名称为柯里拉京，英文名称为Corilagin，结构式见式(Ⅰ)。

本发明提供了式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(a)或(b)：

(a)在制备冠状病毒抑制剂中的应用；

(b)在抑制冠状病毒中的应用。

本发明还提供了式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(c)或(d)：

(c)在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗冠状病毒感染引起的疾病；

(d)在治疗冠状病毒感染引起的疾病中的应用。

本发明还提供了式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(e)或(f)或(g)或(h)：

(e)在制备冠状病毒RdRp抑制剂中的应用；

(f)在抑制冠状病毒的RdRp活性中的应用；

(g)在制备冠状病毒RNA复制抑制剂中的应用；

(h)在抑制冠状病毒RNA复制中的应用。

示例性的，所述产品可为药物、疫苗或药物制剂。

所述产品为药物时，除含有式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐外，还可含有适宜的载体材料。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。

上述应用中，制备药物时，式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐可作为有效成分之一，也可作为唯一有效成分。

上述应用中，制备药物时，式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐可作为活性成分之一，也可作为唯一活性成分。

本发明还提供了药用化合物，其特征在于：所述药用化合物的活性成分为式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐。

所述药用化合物用于抑制冠状病毒。

所述药用化合物用于治疗冠状病毒感染引起的疾病。

所述药用化合物用于抑制冠状病毒的RNA复制。

所述药用化合物用于抑制冠状病毒的RdRp活性。

本发明还提供了抑制冠状病毒感染动物的方法，包括如下步骤：给受体动物施用式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐以抑制冠状病毒感染动物。

本发明还提供了治疗冠状病毒感染引起的疾病的方法，包括如下步骤：给受体动物施用式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐以治疗冠状病毒感染引起的疾病。

RdRp的全称为RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp，也称为nsp12)。

式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐通过靶向RNA依赖的RNA聚合酶发挥抗冠状病毒作用。

示例性的，以上任一所述冠状病毒感染引起的疾病可为2019冠状病毒病。

以上任一所述冠状病毒可为β属冠状病毒。

示例性的，所述冠状病毒为SARS-CoV-2或HCoV-OC43。

本发明中，所述动物可为哺乳动物，如人。

所述动物还可为除哺乳动物以外的所述病毒感染的其他动物。

本发明中，术语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge,et al.,J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1中对药学可接受的盐进行了详细描述。

本发明通过实验证明式(Ⅰ)所示化合物能在体外有效抑制SARS-CoV-2和/或HCoV-OC43的复制，具有良好的抗SARS-CoV-2活性和/或抗HCoV-OC43，具有重要的治疗SARS-CoV-2感染和/或HCoV-OC43感染的应用前景。

附图说明

图1为四种蛋白溶液的SDS-PAGE图。

图2为结合解离曲线。

图3为细胞水平化合物对聚合酶的抑制活性的结果。

图4为化合物的细胞毒性的结果。

图5为细胞水平评价RAI-S-37的抗SARS-CoV-2活性的结果。

图6为细胞水平评价RAI-S-37的抗HCoV-OC43活性的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例中的蛋白质浓度检测均采用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)。

化合物RAI-S-37，CAS号为23094-69-1，中文名称为柯里拉京，英文名称为Corilagin，结构式见式(Ⅰ)，属于小分子化合物。化合物RAI-S-37：Target Molecule Corp.(Target Mol)公司，货号T3795，代理商为上海陶素生化科技有限公司。

新型冠状病毒的RdRp，用SARS-CoV-2RdRp表示。

实施例1、初步筛选化合物

SARS-CoV-2RNA聚合酶的三维空间结构的解析为开发针对新冠肺炎的药物奠定了重要基础。与其他RNA病毒的聚合酶相似，SARS-CoV-2RdRp显示出典型的右手构象，由手掌(palm，氨基酸残基582-621和680-815)、拇指(thumb,氨基酸残基819-920)和手指(fingers，氨基酸残基397-581和621-679)三个亚结构域组成。本发明的发明人首先借助分子对接手段在分子水平对化合物的结合模式和作用机制进行解释和分析。以SARS-CoV-2RdRp为靶点，通过基于结构的虚拟筛选方法在Drugbank(8773个化合物)和TargetMol活性化合物数据库(6447个化合物)中搜索小分子化合物。根据计算得到的小分子与靶蛋白的结合自由能数据，初步筛选到176个与SARS-CoV-2RdRp均有较优结合自由能的小分子化合物。最后通过分子对接方法进一步评估小分子与靶蛋白的结合模式。最终获得并购买50种化合物。50种化合物依次用RAI-S-1至RAI-S-50表示。

实施例2、重组质粒的构建以及蛋白的制备

SARS-CoV-2的nsp7蛋白如序列表的序列1所示，预期分子量为9KD。SARS-CoV-2的nsp8蛋白，如序列表的序列3所示，预期分子量为22KD。nsp7-6His-nsp8蛋白如序列表的序列5所示，预期分子量为31KD。SARS-CoV-2的nsp12蛋白如序列表的序列7所示，预期分子量为103KD。

一、构建重组质粒

1、将nsp7基因(序列表的序列2所示的DNA分子)插入pET-21a(+)载体的BamHⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒，命名为nsp7重组质粒。

2、将nsp8基因(序列表的序列4所示的DNA分子)插入pET-21a(+)载体的BamHⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒，命名为nsp8重组质粒。

3、将nsp7-6His-nsp8基因(序列表的序列6所示的DNA分子)插入pET-21a(+)载体的BamHⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒，命名为nsp7-6His-nsp8重组质粒。

4、pET22b-SARS-CoV-2-nsp12重组质粒，表达C端具有His标签的SARS-CoV-2的nsp12蛋白(又称为nsp12-His蛋白)。pET22b-SARS-CoV-2-nsp12重组质粒记载于如下文献：Wang Q,Wu J,Wang H,et al.Structural basis for RNA replication by the SARS-CoV-2polymerase[J].Cell,2020,182(2):417-428.e13.。

以上各个重组质粒均已进行测序验证。

二、制备重组菌

将步骤一得到的四种重组质粒分别导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到相应的四种重组菌，依次命名为nsp7重组菌、nsp8重组菌、nsp7-6His-nsp8重组菌和nsp12重组菌。

三、制备蛋白质

1、将重组菌接种至含100mg/L氨苄西林的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至0D

2、完成步骤1后，9000rpm离心20min，收集菌体沉淀，用缓冲液A重悬，然后进行超声破碎，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液。缓冲液A：含20mM Tris-HCl(pH8)、300mM NaCl、4mM MgCl

3、取步骤2得到的上清液，采用1mL HisTrap excel色谱柱(GE Healthcare,USA)进行纯化。上样后，先采用缓冲液A进行洗涤，然后采用洗脱液A进行洗脱以收集目标蛋白。洗脱液A：含20mM Tris-HCl(pH8)、300mM NaCl、4mM MgCl

4、取步骤3得到的蛋白溶液，采用Hitrap Q离子交换色谱柱(GE Healthcare,USA)进行纯化。上样后，进行洗脱，初始时刻采用缓冲液B作为洗脱液，终止时刻采用洗脱液B进行洗脱，从初始时刻至终止时刻的过程采用缓冲液B和洗脱液B组成的混合液进行洗脱且洗脱液B占的体积分数线性增加。缓冲液B：含20mM Tris-HCl(pH8)、4mM MgCl

5、取步骤4得到的蛋白溶液，采用Superdex 200 10/300分子筛(GE Healthcare,USA)进行纯化。上样后，采用缓冲液C进行洗脱。收集目的峰对应得到的过柱后溶液，然后进行浓缩，得到蛋白浓度为5mg/mL的蛋白溶液，分装，-80℃冻存备用。缓冲液C：含20mM Tris-HCl(pH＝8)、150mM NaCl、4mM MgCl

6、取步骤5得到的蛋白溶液，进行SDS-PAGE。

四种重组菌分别进行上述步骤，得到相应的四种蛋白溶液。四种蛋白溶液的SDS-PAGE图见图1。

实施例3、采用生物膜层光学干涉技术测定化合物与SARS-CoV-2RdRp的结合能力

为了验证候选小分子通过与靶蛋白SARS-CoV-2RdRp结合从而抑制聚合酶的活性，发明人采用基于光纤生物传感器的生物膜层光学干涉(BioLayer Interferometry,BLI)技术体外测定候选小分子与靶蛋白的结合能力。BLI技术能够实时跟踪生物分子间的相互作用，是研究蛋白质和小分子化合物相互作用的理想选择。

供试化合物分别为：实施例1中购买的50种化合物(RAI-S-1至RAI-S-50)。

供试蛋白：实施例2制备的nsp12-His蛋白。用pH7.4的PBS缓冲液作为溶剂，进行稀释，得到供试蛋白溶液(蛋白浓度为150μg/mL)。

取供试化合物，用DMSO溶解，得到浓度为10mM的化合物母液；然后用pH7.4的PBS缓冲溶液稀释，得到浓度为200μM的化合物溶液；然后用分析物缓冲液稀释至浓度为12.5μM、25μM、50μM、75μM或100μM，即为供试化合物溶液。分析物缓冲液：含0.01％Tween-20、0.1％BSA、2％DMSO的pH7.4的PBS缓冲液。

采用Ni-NTA(NTA)生物传感器，通过Octet RED96(ForteBio,Inc.)仪器进行；采用Greiner 96孔黑色平底微孔板。

(1)第一次检测基线

将NTA传感器浸没在pH7.4的PBS缓冲液中静置120s以达平衡。

(2)将nsp12-His蛋白孵育到传感器上

将传感器探针移动到供试蛋白溶液中静置300s，使蛋白固定在NTA传感器上。

(3)洗脱

在pH7.4的PBS缓冲液中洗涤传感器，以便在接下来的实验中建立稳定的基线。

(3)第二次检测基线

将传感器移动到分析物缓冲液中静置120s以达平衡；

(5)结合

将传感器移动到供试化合物溶液中静置60s，获得K

(6)解离

将传感器移动到分析物缓冲液中静置60s，获得K

使用ForteBio数据分析软件Data Analysis 9.0分析实验数据。

解离速率常数KD＝K

在50个小分子化合物中，有6个化合物能够与SARS-CoV-2RdRp结合，拟合的KD值分别为0.54-220μM其中，RAI-S-37与目标蛋白的结合能力最强，其结合解离曲线如图2所示，拟合出的KD值为0.54±0.01μM。部分结果见表1(MW代表相对分子质量)。

表1

实施例4、在细胞水平上检测化合物对聚合酶的抑制活性

为了进一步验证化合物RAI-S-37对SARS-CoV-2聚合酶活性的影响，发明人构建了SARS-CoV-2聚合酶活性依赖的荧光素酶报告系统，在细胞水平上检测RAI-S-37的抑制活性。采用融合PCR技术将高斯荧光素酶(Gaussia luciferase，简称Gluc)的编码序列，即开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)插入到SARS-CoV-2非翻译区(5'UTR和3'UTR)之间构建荧光素酶表达质粒pCoV-Gluc。高斯荧光素酶的开放阅读框如序列表的序列8所示。SARS-CoV-2的5'UTR如序列表的序列9所示。SARS-CoV-2的3'UTR如序列表的序列10所示。SARS-CoV-2聚合酶以该段RNA为模版转录产生荧光素酶编码序列，经翻译产生luciferase蛋白。通过检测细胞培养上清的Gluc活性来评价SARS-CoV-2聚合酶活性。

1、293T细胞接种至6孔板(4×10

2、完成步骤1后，取所述6孔板，借助LipofectamineTM 2000共转染实施例2中的nsp7重组质粒、nsp8重组质粒、pET22b-SARS-CoV-2-nsp12重组质粒和质粒pCoV-Gluc(四种质粒的质量配比依次为30：30：10：1；每孔转染质粒的总质量为0.71微克)，培养24小时。

3、完成步骤2后，收集细胞，胰酶消化,然后用DMEM培养基重悬，得到细胞悬液(4×10

4、完成步骤3后，取所述96孔板，加入化合物母液(使化合物的工作浓度分别为0.4μM、0.8μM、1.6μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM或50μM)，培养24小时，收集培养上清，即为待测上清。采用广谱抗病毒核苷类抑制剂瑞德西韦Remedesivir作为阳性对照。RAI-S-37母液的制备方法：RAI-S-37溶于DMSO，得到浓度为10mM的RAI-S-37母液。空白对照孔，用等体积DMSO代替化合物母液，其他同试验孔。设置5个复孔。

5、完成步骤4后，检测Gasussia荧光素酶活性(Gluc活性)。

(1)将底物Coelenterazine-h冻干粉末溶解于600μL无水乙醇中，制成浓度为1.022mM的母液，-20℃保存。

(2)将母液以1:60的体积比稀释于pH7.4的PBS缓冲液中，制成底物工作液。在室温静置30min以稳定工作液，由于底物见光不稳定，全程需要避光处理。

(3)取10μL待测上清到白色不透明96孔板中，利用酶标仪Centro XS3 LB 960自动进样器将避光孵育的底物工作液按每孔60μL的进样量逐孔加入，持续收集信号0.5s，测量结果以相对光单位Relative Light Units(RLU)表示。

SARS-CoV-2RdRp抑制率＝(1-样品孔的荧光强度/空白对照孔的荧光强度)×100％。

结果见图3。横坐标为化合物浓度(μM)以10为底的对数，纵坐标为SARS-CoV-2RdRp抑制率。在细胞水平上，RAI-S-37显著抑制RdRp活性，EC50＝3.65μM。在相同条件下，瑞德西韦的EC50＝1.99μM。

实施例5、采用细胞增殖与毒性分析试剂盒CCK-8评价小分子化合物的细胞毒性为了排除由于细胞毒性而产生的非特异性差异，采用Cell-Counting-Kit-8(CCK-8)试剂盒评估小分子对293T细胞生长的影响。CCK-8是检测细胞增殖、细胞存活和细胞毒性的试剂盒，是一种基于WST-8(水溶性四唑盐，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用快速高灵敏度检测试剂盒，为MTT法的替代方法。试剂盒中采用水溶性四唑盐-WST-8，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅；对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈良好线性关系。

1、将293T细胞接种至96孔板(4×10

2、完成步骤1后，吸弃上清，采用含RAI-S-37的培养基培养48小时。RAI-S-37的工作浓度分别设置为：0.39μM、0.781μM、1.562μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM或50μM。每个浓度设置5个复孔。含RAI-S-37的培养基的制备方法：将RAI-S-37母液和DMEM培养基混合。RAI-S-37母液的制备方法：RAI-S-37溶于DMSO，得到浓度为10mM的RAI-S-37母液。设置空白对照孔；空白对照孔，用等体积DMSO代替RAI-S-37母液；空白对照设置5个复孔。

3、完成步骤2后，吸弃上清，加入含10％CCK-8试剂的DMEM培养基，培养1h。

4、完成步骤3后，在微孔板读数器(Thermo，Varioskan Flash)上记录450nm处每孔的光密度(OD)值。

将空白对照孔的OD450nm记作细胞活力为1。

相对细胞活力＝样品孔的OD450nm/空白对照孔的OD450nm。

结果见图4。图4中，横坐标为化合物浓度(μM)以10为底的对数。在测试浓度下，RAI-S-37对细胞活性均无明显影响。由此说明，该浓度下RAI-S-37对SARS-CoV-2RdRp的抑制活性与其细胞毒性无关。

实施例6、在细胞水平评价RAI-S-37的抗SARS-CoV-2活性

SARS-CoV-2记载于如下文献：Lei X,Dong X,Ma R,et al.Activation andevasion of type I interferon responses by SARS-CoV-2.Nat Commun.2020；11(1):3810.Published 2020Jul 30.doi:10.1038/s41467-020-17665-9。SARS-CoV-2是从确诊的COVID-19患者的呼吸道样本中分离获得，接种到Vero细胞中，然后在Vero细胞中繁殖并用于此项研究。Vero细胞：American Type Culture Collection(ATCC)，编号为CCL-81。SARS-CoV-2的所有实验均在BSL-3实验室中进行。测试化合物：Remdesivir或RAI-S-37。

一、细胞培养

1、将Vero细胞接种至48孔板(5×10

2、完成步骤1后，取所述48孔板，加入测试化合物，培养1小时。测试化合物采用不同的工作浓度。

3、完成步骤2后，取所述48孔板，按MOI＝0.05的病毒量接种SARS-CoV-2，2小时后吸弃上清，然后加入含测试化合物的细胞培养基，培养24小时。

4、完成步骤3后，收集细胞上清液以进行定量分析。

步骤2和步骤3中，测试化合物的工作浓度相同。

含RAI-S-37的细胞培养基的制备方法：将RAI-S-37母液和DMEM培养基混合。RAI-S-37母液的制备方法：RAI-S-37溶于DMSO，得到浓度为10mM的RAI-S-37母液。

RAI-S-37的工作浓度分别设置为：0.02μM、0.2μM、2μM、20μM、200μM。每个浓度设置5个复孔。

阴性对照孔，用等体积DMSO代替RAI-S-37母液。阴性对照设置5个复孔。

二、病毒RNA提取和定量实时RT-PCR(qRT-PCR)

1、完成步骤一后，收集细胞培养上清，采用Direct-zol RNA miniPrep kit(Zymoresearch,CA,USA)提取总RNA，然后采用M-MLV逆转录酶(Promega,Madison,WI)进行逆转录，得到cDNA。

2、采用TaqMan Fast Virus 1-step Master Mix(Applied Biosystems,FosterCity,CA)处理步骤1得到的cDNA，然后使用CFX96TM Real-Time PCR System(Bio-Rad,Hercules,CA)进行qRT-PCR检测，获得ct值。通过标准曲线法，得到拷贝数。

SARS-CoV-2的特异性引物的靶序列位于SARS-CoV-2核衣壳蛋白(N蛋白)。引物F：5’-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3’；引物R：5’-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3’。

3、计算病毒复制抑制率。病毒复制抑制率(％)＝(1-供试孔的拷贝数/阴性对照孔的拷贝数)×100％。

结果见图5。图5中，横坐标为化合物浓度(μM)。RAI-S-37对SARS-CoV-2表现出剂量依赖性抑制作用，EC50值为0.131μM。在相同实验条件下，瑞德西韦remdesivir的EC50值为0.060μM。

结果表明，RAI-S-37通过抑制DENV-RdRp的活性降低了SARS-CoV-2RNA的合成。

实施例7、在细胞水平评价RAI-S-37的抗HCoV-OC43活性

SARS-CoV-2与HCoV-OC43 RNA聚合酶催化核心区域的序列相似性高达85％。采用毒性较低的HCoV-OC43(VR1558株)进行体外抗病毒活性实验。通过观察不同浓度的RAI-S-37对HCoV-OC43致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)的抑制作用来评估RAI-S-37的抗HCoV-OC43活性。记载HCoV-OC43(VR1558株)的文献：Zhao X,Zheng S,Chen D,Zheng M,Li X,Li G,Lin H,Chang J,Zeng H,Guo J-T.2020.LY6E restricts entry of humancoronaviruses,including currently pandemic SARS-CoV-2.J Virol 94:e00562-20.。

1、将HCT-8细胞接种至96孔板(2×10

2、完成步骤1后，取所述96孔板，感染HCoV-OC43(MOI＝0.5)，同时加入供试化合物(RAI-S-37或瑞德西韦)，培养6天。供试化合物的工作浓度分别为：0.097μM、0.195μM、0.39μM、0.781μM、1.562μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM或200μM。

3、采用MTS细胞增殖试剂盒(20μL/孔)对细胞进行染色，然后孵育3.5小时。

4、用显微镜观察细胞，在490nm处测定光密度值(Optical density，OD)。

实验过程中将未受病毒感染的正常HCT-8细胞所在的孔设为阳性对照，即100％的CPE抑制率；将受HCoV-OC43感染，并且没有加入化合物的孔设为阴性对照，即0％的CPE抑制率。计算不同浓度下小分子化合物的CPE抑制率。

CPE抑制率(％)＝(样品孔的490nm值-阴性对照孔的490nm值)/(阳性对照孔的490nm值-阴性对照孔的490nm值)×100。

结果见图6。其中，横坐标为化合物浓度(μM)，纵坐标为CPE抑制率。结果表明在0.781μM浓度下，RAI-S-37可以完全抑制HCoV-OC43对HCT-8细胞的感染。值得指出的是，阳性对照瑞德西韦在高浓度下(50μM、100μM、200μM)有一定的细胞毒性，导致CPE抑制率降低。而RAI-S-37的细胞毒性很低，在200μM浓度下依然显示出接近100％的CPE抑制率。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所

<120> 柯里拉京在抑制冠状病毒复制从而发挥抗冠状病毒药物功能中的应用

<130> GNCYX202459

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 80

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 1

Gln Ser Lys Met Ser Asp Val Lys Cys Thr Ser Val Val Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Leu Gln Gln Leu Arg Val Glu Ser Ser Ser Lys Leu Trp Ala Gln

20 25 30

Cys Val Gln Leu His Asn Asp Ile Leu Leu Ala Lys Asp Thr Thr Glu

35 40 45

Ala Phe Glu Lys Met Val Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Ser Met Gln

50 55 60

Gly Ala Val Asp Ile Asn Lys Leu Cys Glu Glu Met Leu Asp Asn Arg

65 70 75 80

<210> 2

<211> 243

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagtcaaaga tgtccgatgt taaatgtaca tcagttgtat tactttccgt gttgcaacaa 60

cttcgcgttg aatcatcatc aaagctgtgg gctcagtgtg ttcagcttca taacgatatt 120

cttcttgcta aagatacaac agaagctttc gagaagatgg tctcactcct ctccgtcctt 180

cttagtatgc aaggcgctgt tgatattaac aaactttgtg aagaaatgct tgataaccgc 240

tga 243

<210> 3

<211> 198

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 3

Ala Ile Ala Ser Glu Phe Ser Ser Leu Pro Ser Tyr Ala Ala Phe Ala

1 5 10 15

Thr Ala Gln Glu Ala Tyr Glu Gln Ala Val Ala Asn Gly Asp Ser Glu

20 25 30

Val Val Leu Lys Lys Leu Lys Lys Ser Leu Asn Val Ala Lys Ser Glu

35 40 45

Phe Asp Arg Asp Ala Ala Met Gln Arg Lys Leu Glu Lys Met Ala Asp

50 55 60

Gln Ala Met Thr Gln Met Tyr Lys Gln Ala Arg Ser Glu Asp Lys Arg

65 70 75 80

Ala Lys Val Thr Ser Ala Met Gln Thr Met Leu Phe Thr Met Leu Arg

85 90 95

Lys Leu Asp Asn Asp Ala Leu Asn Asn Ile Ile Asn Asn Ala Arg Asp

100 105 110

Gly Cys Val Pro Leu Asn Ile Ile Pro Leu Thr Thr Ala Ala Lys Leu

115 120 125

Met Val Val Ile Pro Asp Tyr Asn Thr Tyr Lys Asn Thr Cys Asp Gly

130 135 140

Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Ser Ala Leu Trp Glu Ile Gln Gln Val Val

145 150 155 160

Asp Ala Asp Ser Lys Ile Val Gln Leu Ser Glu Ile Ser Met Asp Asn

165 170 175

Ser Pro Asn Leu Ala Trp Pro Leu Ile Val Thr Ala Leu Arg Ala Asn

180 185 190

Ser Ala Val Lys Leu Gln

195

<210> 4

<211> 597

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctattgctt cagaattctc ttcgcttcct tcatatgctg ctttcgcaac tgctcaggaa 60

gcttatgaac aggctgttgc taacggcgat tcagaagttg ttcttaagaa gttgaagaaa 120

tcactgaacg ttgctaaatc agaatttgat cgcgatgctg ctatgcagcg caaacttgag 180

aagatggccg atcaggctat gacacagatg tataaacagg ctcgctcaga agataaacgc 240

gctaaagtta catcagctat gcagacaatg ttattcacta tgcttcgcaa acttgataac 300

gatgctctta acaacattat taacaacgct cgcgatggct gtgttcctct taacattatt 360

cctcttacaa cagctgctaa acttatggtt gttattcctg attataacac atataagaat 420

acttgtgatg gcacaacatt tacatatgct tcagctcttt gggaaattca gcaggttgtt 480

gatgctgatt caaagatcgt ccagctttca gaaatttcaa tggataactc acctaacctt 540

gcttggcctc ttattgttac agctcttcgc gctaactcag ctgttaaact tcagtga 597

<210> 5

<211> 284

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 5

Gln Ser Lys Met Ser Asp Val Lys Cys Thr Ser Val Val Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Leu Gln Gln Leu Arg Val Glu Ser Ser Ser Lys Leu Trp Ala Gln

20 25 30

Cys Val Gln Leu His Asn Asp Ile Leu Leu Ala Lys Asp Thr Thr Glu

35 40 45

Ala Phe Glu Lys Met Val Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Ser Met Gln

50 55 60

Gly Ala Val Asp Ile Asn Lys Leu Cys Glu Glu Met Leu Asp Asn Arg

65 70 75 80

His His His His His His Ala Ile Ala Ser Glu Phe Ser Ser Leu Pro

85 90 95

Ser Tyr Ala Ala Phe Ala Thr Ala Gln Glu Ala Tyr Glu Gln Ala Val

100 105 110

Ala Asn Gly Asp Ser Glu Val Val Leu Lys Lys Leu Lys Lys Ser Leu

115 120 125

Asn Val Ala Lys Ser Glu Phe Asp Arg Asp Ala Ala Met Gln Arg Lys

130 135 140

Leu Glu Lys Met Ala Asp Gln Ala Met Thr Gln Met Tyr Lys Gln Ala

145 150 155 160

Arg Ser Glu Asp Lys Arg Ala Lys Val Thr Ser Ala Met Gln Thr Met

165 170 175

Leu Phe Thr Met Leu Arg Lys Leu Asp Asn Asp Ala Leu Asn Asn Ile

180 185 190

Ile Asn Asn Ala Arg Asp Gly Cys Val Pro Leu Asn Ile Ile Pro Leu

195 200 205

Thr Thr Ala Ala Lys Leu Met Val Val Ile Pro Asp Tyr Asn Thr Tyr

210 215 220

Lys Asn Thr Cys Asp Gly Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Ser Ala Leu Trp

225 230 235 240

Glu Ile Gln Gln Val Val Asp Ala Asp Ser Lys Ile Val Gln Leu Ser

245 250 255

Glu Ile Ser Met Asp Asn Ser Pro Asn Leu Ala Trp Pro Leu Ile Val

260 265 270

Thr Ala Leu Arg Ala Asn Ser Ala Val Lys Leu Gln

275 280

<210> 6

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagtcaaaga tgagcgatgt taaatgtaca tcagttgtat tactttccgt gttgcaacaa 60

cttcgcgttg aatcatcatc aaagttgtgg gctcagtgtg ttcagcttca taacgatatt 120

cttcttgcta aagatacaac agaagctttc gagaagatgg tgagtctcct ctccgtcctt 180

cttagtatgc aaggcgctgt tgatattaac aaactttgtg aagaaatgct tgataaccgc 240

catcatcatc atcatcatgc tattgcttca gaattctcgt cgcttccttc atatgctgct 300

ttcgcgacgg ctcaggaagc ttatgaacag gctgttgcta acggcgattc agaagttgtt 360

cttaagaagt taaagaaatc tttaaacgtt gctaaatcag aatttgatcg cgatgctgct 420

atgcagcgca aactagagaa gatggcagac caggctatga cacagatgta taaacaggct 480

cgctcagaag ataaacgcgc taaagttaca tcagctatgc agacaatgtt gttcacgatg 540

cttcgcaaac ttgataacga tgctcttaac aacattatta acaacgctcg cgatggctgt 600

gttcctctta acattattcc tcttacaaca gctgctaaac ttatggttgt tattcctgat 660

tataacacat ataagaatac gtgtgatggc acaacattta catatgcttc agctctttgg 720

gaaattcagc aggttgttga tgctgattca aagatcgtac agctttcaga aatttcaatg 780

gataactcac ctaaccttgc ttggcctctt attgttacag ctcttcgcgc taactcagct 840

gttaaacttc agtga 855

<210> 7

<211> 932

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 7

Ser Ala Asp Ala Gln Ser Phe Leu Asn Arg Val Cys Gly Val Ser Ala

1 5 10 15

Ala Arg Leu Thr Pro Cys Gly Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Val Tyr

20 25 30

Arg Ala Phe Asp Ile Tyr Asn Asp Lys Val Ala Gly Phe Ala Lys Phe

35 40 45

Leu Lys Thr Asn Cys Cys Arg Phe Gln Glu Lys Asp Glu Asp Asp Asn

50 55 60

Leu Ile Asp Ser Tyr Phe Val Val Lys Arg His Thr Phe Ser Asn Tyr

65 70 75 80

Gln His Glu Glu Thr Ile Tyr Asn Leu Leu Lys Asp Cys Pro Ala Val

85 90 95

Ala Lys His Asp Phe Phe Lys Phe Arg Ile Asp Gly Asp Met Val Pro

100 105 110

His Ile Ser Arg Gln Arg Leu Thr Lys Tyr Thr Met Ala Asp Leu Val

115 120 125

Tyr Ala Leu Arg His Phe Asp Glu Gly Asn Cys Asp Thr Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Leu Val Thr Tyr Asn Cys Cys Asp Asp Asp Tyr Phe Asn Lys Lys

145 150 155 160

Asp Trp Tyr Asp Phe Val Glu Asn Pro Asp Ile Leu Arg Val Tyr Ala

165 170 175

Asn Leu Gly Glu Arg Val Arg Gln Ala Leu Leu Lys Thr Val Gln Phe

180 185 190

Cys Asp Ala Met Arg Asn Ala Gly Ile Val Gly Val Leu Thr Leu Asp

195 200 205

Asn Gln Asp Leu Asn Gly Asn Trp Tyr Asp Phe Gly Asp Phe Ile Gln

210 215 220

Thr Thr Pro Gly Ser Gly Val Pro Val Val Asp Ser Tyr Tyr Ser Leu

225 230 235 240

Leu Met Pro Ile Leu Thr Leu Thr Arg Ala Leu Thr Ala Glu Ser His

245 250 255

Val Asp Thr Asp Leu Thr Lys Pro Tyr Ile Lys Trp Asp Leu Leu Lys

260 265 270

Tyr Asp Phe Thr Glu Glu Arg Leu Lys Leu Phe Asp Arg Tyr Phe Lys

275 280 285

Tyr Trp Asp Gln Thr Tyr His Pro Asn Cys Val Asn Cys Leu Asp Asp

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Arg Cys Ile Leu His Cys Ala Asn Phe Asn Val Leu Phe Ser Thr Val

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Phe Pro Pro Thr Ser Phe Gly Pro Leu Val Arg Lys Ile Phe Val Asp

325 330 335

Gly Val Pro Phe Val Val Ser Thr Gly Tyr His Phe Arg Glu Leu Gly

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Val Val His Asn Gln Asp Val Asn Leu His Ser Ser Arg Leu Ser Phe

355 360 365

Lys Glu Leu Leu Val Tyr Ala Ala Asp Pro Ala Met His Ala Ala Ser

370 375 380

Gly Asn Leu Leu Leu Asp Lys Arg Thr Thr Cys Phe Ser Val Ala Ala

385 390 395 400

Leu Thr Asn Asn Val Ala Phe Gln Thr Val Lys Pro Gly Asn Phe Asn

405 410 415

Lys Asp Phe Tyr Asp Phe Ala Val Ser Lys Gly Phe Phe Lys Glu Gly

420 425 430

Ser Ser Val Glu Leu Lys His Phe Phe Phe Ala Gln Asp Gly Asn Ala

435 440 445

Ala Ile Ser Asp Tyr Asp Tyr Tyr Arg Tyr Asn Leu Pro Thr Met Cys

450 455 460

Asp Ile Arg Gln Leu Leu Phe Val Val Glu Val Val Asp Lys Tyr Phe

465 470 475 480

Asp Cys Tyr Asp Gly Gly Cys Ile Asn Ala Asn Gln Val Ile Val Asn

485 490 495

Asn Leu Asp Lys Ser Ala Gly Phe Pro Phe Asn Lys Trp Gly Lys Ala

500 505 510

Arg Leu Tyr Tyr Asp Ser Met Ser Tyr Glu Asp Gln Asp Ala Leu Phe

515 520 525

Ala Tyr Thr Lys Arg Asn Val Ile Pro Thr Ile Thr Gln Met Asn Leu

530 535 540

Lys Tyr Ala Ile Ser Ala Lys Asn Arg Ala Arg Thr Val Ala Gly Val

545 550 555 560

Ser Ile Cys Ser Thr Met Thr Asn Arg Gln Phe His Gln Lys Leu Leu

565 570 575

Lys Ser Ile Ala Ala Thr Arg Gly Ala Thr Val Val Ile Gly Thr Ser

580 585 590

Lys Phe Tyr Gly Gly Trp His Asn Met Leu Lys Thr Val Tyr Ser Asp

595 600 605

Val Glu Asn Pro His Leu Met Gly Trp Asp Tyr Pro Lys Cys Asp Arg

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Ala Met Pro Asn Met Leu Arg Ile Met Ala Ser Leu Val Leu Ala Arg

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645 650 655

Asn Glu Cys Ala Gln Val Leu Ser Glu Met Val Met Cys Gly Gly Ser

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Leu Tyr Val Lys Pro Gly Gly Thr Ser Ser Gly Asp Ala Thr Thr Ala

675 680 685

Tyr Ala Asn Ser Val Phe Asn Ile Cys Gln Ala Val Thr Ala Asn Val

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Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asp Gly Asn Lys Ile Ala Asp Lys Tyr Val

705 710 715 720

Arg Asn Leu Gln His Arg Leu Tyr Glu Cys Leu Tyr Arg Asn Arg Asp

725 730 735

Val Asp Thr Asp Phe Val Asn Glu Phe Tyr Ala Tyr Leu Arg Lys His

740 745 750

Phe Ser Met Met Ile Leu Ser Asp Asp Ala Val Val Cys Phe Asn Ser

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Thr Tyr Ala Ser Gln Gly Leu Val Ala Ser Ile Lys Asn Phe Lys Ser

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Val Leu Tyr Tyr Gln Asn Asn Val Phe Met Ser Glu Ala Lys Cys Trp

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Thr Glu Thr Asp Leu Thr Lys Gly Pro His Glu Phe Cys Ser Gln His

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Asp Ala Tyr Pro Leu Thr Lys His Pro Asn Gln Glu Tyr Ala Asp Val

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggagtga aagttctttt tgcccttatt tgtattgctg tggccgaggc caaaccaact 60

gaaaacaatg aagatttcaa cattgtagct gtagctagca actttgctac aacggatctc 120

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<210> 9

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<212> DNA

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cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180

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<211> 229

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aggccacgcg gagtacgatc gagtgtacag tgaacaatgc tagggagagc tgcctatatg 120

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ttcttaggag aatgacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 229