猪伪狂犬病毒的PMA-qPCR检测方法

技术领域

本发明涉及病毒核酸检测领域，具体涉及猪伪狂犬病毒的PMA-qPCR检测方法。

背景技术

猪伪狂犬病(Pesedorabies,PR)是由猪伪狂犬病毒(Pesedorabies virus,PRV)引起的猪的急性、烈性和高度接触性传染病。PRV属于疱疹病毒、甲型疱疹病毒亚科的猪疱疹病毒I型，是双链DNA病毒。该病能造成发病公猪出现睾丸炎；妊娠母猪流产，产死胎、弱胎和木乃伊胎；育肥猪呼吸困难、生长停滞；新生仔猪腹泻、呕吐和精神症状并大量死亡。PRV已经给全球养猪业造成了巨大的经济损失。我国PRV仍呈流行趋势，严重制约着养殖业的健康发展。对PRV感染早期进行及时、快速、准确的诊断，是有效防制猪伪狂犬病的重要前提。

目前，世界各国广泛使用的PRV基因缺失疫苗多为gE、gI基因缺失表型或gE、TK双基因缺失表型，以及gE、gI和TK三基因缺失表型。PRV传统诊断方法包括病毒的分离、动物接种试验、ELISA、病毒中和试验、乳胶凝集试验、胶体金免疫层析试验及血凝与血凝抑制试验等方法，这些方法存在耗时长，敏感性低，易出现假阳性。而普通PCR和qPCR等具有检测灵敏度高、特异性强和检测速度快等优势，但是均不能区分病毒是否具有感染性，用于样品中PRV的检测容易导致假阳性的结果，因为病毒的基因组在病毒死亡后在短期时间内仍可以被检测到。因此需要研发一种快速、准确、简便的检测具有感染性PRV的方法，从而为PR的预防和控制提供帮助。

叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)是一种能与DNA分子结合的具有鉴别功能染料，该染料可进入受损的细菌或病毒等DNA分子的小沟内，在光的作用下使PMA分解产生氮烯类物质与DNA分子发生共价交联反应，从而抑制DNA的PCR扩增。因此众多学者将PMA与qPCR相结合用于各种活菌的检测，如大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、布鲁氏菌等。然而，将上述方法应用于活病毒检测的研究尚不多见。目前还没有采用PMA-qPCR检测技术对PRV进行检测的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用PMA-qPCR检测具感染性的猪伪狂犬病毒的方法。

本发明第一方面提供一种猪伪狂犬病毒的PMA-qPCR检测方法。在本发明所述猪伪狂犬病毒的PMA-qPCR检测方法中，qPCR扩增的引物是：

上游引物：5’-TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTG-3’(SEQ ID No.2)，

下游引物：5’-TTTGAATTCTTACGACACGGCGTCGCA-3’(SEQ ID No.3)。

qPCR扩增所得片段如下(SEQ ID No.1)：

TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACCGAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGACGACGATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCCCCGGCCCATCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCGTAAGAATTCAAA。

在引物的选择上，本发明针对猪伪狂犬病毒基因组的gE基因进行引物设计并对不同引物进行筛选；筛选结果显示即使在同一个基因上进行引物设计，采用相同的PMA处理条件及病毒液浓度，也不是所有引物均能区分PRV活病毒和PRV灭活病毒。

在使用PMA进行病毒液预处理时，PMA工作液浓度的选取和孵育时间是其中重要的参数。PAM浓度应该最大化地抑制结构破损病毒的信号，即PMA的量相对病毒的量要饱和；且孵育时间要保证所有结构破损病毒的核酸都能被PMA非特异性地封闭。这样能够有效地抑制结构破损病毒的核酸扩增，而不影响结构完整病毒的核酸扩增。

发明人经过多次实验探索，在本发明所述PMA-qPCR检测方法中，所采用的PAM工作液浓度能够起到良好的封闭作用，且不影响结构完整病毒核酸的扩增。

本发明所提供的PMA-qPCR检测方法中，在使用PMA预处理猪伪狂犬病毒时，PMA工作液的终浓度为50-100μM。使用上述引物进行猪伪狂犬病毒检测时，终浓度为50-100μM的PMA预处理病毒液，可以有效区分PRV活病毒和PRV灭活病毒。

本发明所提供的PMA-qPCR检测方法中，猪伪狂犬病毒病毒液的稀释倍数为10-1000。使用上述引物进行猪伪狂犬病毒检测时，终浓度为50-100μM的PMA预处理稀释10-100倍后的病毒液，可以有效区分PRV活病毒和PRV灭活病毒。

在使用PMA-qPCR的方法进行病毒检测时，PMA处理条件，可以保证PMA能够充分渗透非感染性病毒的衣壳(及包膜)，形成牢固的DNA修饰，有效检测活病毒。在发明人的不断探究中，逐步确定了，最适合具感染性猪伪狂犬病毒的PMA-qPCR检测所需的PMA处理条件。

在本发明所述的PMA-qPCR检测方法中，所述PMA工作液与所述猪伪狂犬病毒液混合均匀，避光处理13-15min，间隔3-5min摇晃一次，再置于100W蓝光灯下照射18-20min，间隔3-5min摇晃一次。所述PMA工作液是PMA染料溶解于二甲基亚砜中混合均匀得到的。

在本发明所述的PMA-qPCR检测方法中，完成猪伪狂犬病毒液的预处理后，提取猪伪狂犬病毒核酸，进行qPCR扩增。

在本发明PMA-qPCR检测方法中，所述qPCR扩增的反应体系包括：DNA荧光染料、DNA聚合酶和PCR反应液、待测样品的DNA、阴性对照品；具体地，qPCR扩增的反应体系还包括：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix、10μM上游引物、10μM下游引物、50×ROX ReferenceDye 1、Template cDNA、去离子水补至总反应体系20μL。

具体地，采用本发明所述的PMA-qPCR检测方法进行猪伪狂犬病毒检测时，检测步骤包括：

1)利用PMA对病毒液进行预处理，使PMA与死亡或细胞膜损伤病毒DNA交联；

2)提取病毒DNA；

3)取DNA荧光染料、DNA聚合酶和PCR反应液混合，分别加入待测样品的DNA或者阴性对照品配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于CFX96TM real-time PCR仪器进行荧光检测；

4)采集荧光信号，检测结果判断标准如下：

(1)样本Ct值≤35，判断样本为阳性；

(2)35＜样本Ct值≤40，若扩增曲线对数扩增曲线，判断为可疑阳性样本，否则判断样本为阴性；

对可疑阳性样本进行复检，若复检样本Ct值≤35，判断可疑阳性样本为阳性，否则判断样本为阴性；

(3)样本无Ct值或Ct值＞40，判断样本为阴性。

本发明所述PMA-qPCR检测方法可用于制备猪伪狂犬病毒生物制品；也可用于猪伪狂犬病毒疫苗质量检测。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明所述PMA-qPCR检测方法，将PMA处理和qPCR手段相结合检测PRV，特异性强、灵敏度高、可检测具有感染性PRV病毒，实验结果显示常见非感染性病毒对照组和水均未出现阳性结果。

(2)本发明所述PMA-qPCR检测方法，重复性好，在各个猪伪狂犬病毒平行样检测中的Ct值基本相同。

(3)本发明所述PMA-qPCR检测方法可高效、快速、准确的检测具有感染性的猪伪狂犬病毒。

附图说明

图1为本发明实施例1中PRV活病毒及灭活病毒在不同终浓度PMA工作液处理下的qPCR结果图。

图2为本发明实施例2中PRV活病毒组、PRV活病毒+PMA组、灭活PRV病毒组及灭活PRV病毒+PMA组的qPCR扩增结果图。

图3为本发明实施例3中PRV病毒不同稀释倍数下的qPCR扩增结果图。

图4为本发明对比例1中PRV活病毒及灭活病毒在不同终浓度PMA工作液处理下的qPCR结果图。

图5为本发明对比例2中qPCR扩增结果图。

图6为本发明对比例2中标准曲线图。

图7为本发明对比例3中对SEQ ID No.2-3所示引物的特异性检测的结果图。

图8为本发明对比例4中PMA处理后猪伪狂犬病毒qPCR扩增结果图。

具体实施方式

以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

根据NCBI的PRV的gE基因设计一对长片段引物，该片段引物扩增长度为384bp，基因序列及引物序列如下：

引物扩增所得片段(SEQ ID No.1)：

TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACCGAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGACGACGATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCCCCGGCCCATCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCGTAAGAATTCAAA。

引物序列：

PRV-gE-F2:TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTG-3’(SEQ ID No.2)，

PRV-gE-R2:TTTGAATTCTTACGACACGGCGTCGCA-3(SEQ ID No.3)。

向PRV活病毒及PRV灭活病毒的10倍稀释液中加入PMA工作液，使其终浓度分别为100μM、50μM、20μM、10μM，使用该引物进行qPCR扩增。

PMA-qPCR检测具体步骤如下：

选取PRV毒株，接种至PK15细胞中，37℃、5％CO

将1mg的PMA染料溶解于500μL的二甲基亚砜(DMSO)中混合均匀得到4mM浓度的储存液，放置于-20℃冰箱中避光保存。

在避光条件下向稀释的病毒液中加入PMA工作液，使其终浓度为100μM、50μM、20μM、10μM，充分混匀后，避光处理13-15min，其间间隔3-5min摇晃一次，再置于100W蓝光灯下照射18-20min，其间间隔3-5min摇晃一次。利用病毒基因组提取试剂盒进行DNA的提取，使用

qPCR反应引物序列如下：

上游引物：5’-TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTG-3’(SEQ ID No.2)

下游引物：5’-TTTGAATTCTTACGACACGGCGTCGCA-3’(SEQ ID No.3)。

qPCR扩增反应体系如下：

利用CFX96TM real-time PCR仪器进行检测，反应条件为：95℃预变性5min；每个循环为：95℃，10sec；60℃，30sec；40个循环；然后95℃，15sec；60℃，60sec；95℃，15sec。反应结束后利用自带软件获取数据。

实验结果显示(如图1)，图1结果显示在PMA终浓度为10、20μL时，PMA-qPCR扩增得到的PRV活病毒与灭活病毒的Ct值均小于35，不能区分PRV活病毒和PRV灭活病毒；

而PMA终浓度为50、100μL时，PMA-qPCR扩增得到的PRV活病毒的Ct值小于35，判断样本为阳性；而PRV灭活病毒未出现Ct值。

本实施例说明，PMA的终浓度为50-100μM时，使用实施例所提供的引物进行qPCR扩增，可以区分PRV活病毒和PRV灭活病毒。

使用该引物扩增时，PMA的终浓度为50-100μM时，可以区分PRV活病毒和PRV灭活病毒。

实施例2具感染性猪伪狂犬病毒的PMA-qPCR检测

本实施例采用与实施例1相同的qPCR扩增引物及PMA-qPCR检测的具体步骤，PMA的终浓度为50-100μM。本实施例选取PRV活病毒组、PRV活病毒+PMA组、灭活PRV病毒组及灭活PRV病毒+PMA组作为样本，水作为阴性对照，实验结果见图2。

图2的结果显示，PRV活病毒组Ct值(①②)为27.10和27.15、PRV活病毒+PMA组Ct值(③④)为26.58和26.60、灭活PRV病毒组Ct值(⑤⑥)为28.51和28.43，即PRV活病毒组、PRV活病毒+PMA组和灭活PRV病毒组的Ct值＜35，判断样本均为阳性；灭活PRV病毒+PMA组及水对照组无Ct值，判断样本均为阴性。

本实施例说明本发明所提供的PMA-qPCR检测方法能对具有感染性猪伪狂犬病毒(PRV)进行有效检测。

实施例3不同病毒液稀释倍数

本实施例采用与实施例1相同的qPCR扩增引物及PMA-qPCR检测的具体步骤。本实施例中将PRV病毒液进行10倍、100倍、1000倍稀释后，加入PMA工作液，使PMA工作液终浓度为50-100μM。实验结果见图3。

图3的结果显示，当使用病毒原液进行扩增时Ct值为26.4，当病毒原液稀释10倍时Ct值为28.0，根据对比例2所得标准曲线回归方程(y＝-4.0593x+45.31，其中y代表Ct值，x代表基因拷贝数浓度的对数；R

因此，使用本发明所提供的PMA-qPCR检测具感染性PRV时，当病毒液稀释10-1000倍稀释时，用实施例1提供的引物进行扩增，可区分猪狂犬病毒是否具有感染性。

对比例1采用不同引物进行具感染性的猪伪狂犬病毒PMA-qPCR检测

本对比例根据NCBI的PRV的gE基因设计了一对用于猪伪狂犬病毒的PMA-qPCR检测的引物，该引物扩增所得片段长度为276bp，基因序列及引物序列如下：

引物扩增所得片段(SEQ ID No.4)：

GCTGTACGTGCTCGTGATGACCCACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCTCGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGTCACGGTCATCAAGGAGCTGACGGCCCCGGCCCGGGCCCCGGGCACCCCGTGGGGCCCCGGCGGCGGCGACGACGCGATCTACGTGGACGGCGTCACGACGCCGGCGCCGCCCGCGCGCCCGTGGAACCCGTACGGCCGGACGACGCCCGGGCGGCTGTTTGTGCTGGCGCTGGGCTCCTTCGTGATGACGTGCGT。

PRV-gE-F1:GCTGTACGTGCTCGTGAT(SEQ ID No.5)，

PRV-gE-R1:ACGCACGTCATCACGAAGGAG(SEQ ID No.6)。

向PRV活病毒及PRV灭活病毒的10倍稀释液中加入PMA工作液，使其终浓度分别为100μM、50μM、20μM、10μM,使用本对比例所提供引物进行扩增，具体方法步骤如实施例1。实验结果见图4。

图4的结果显示，使用本对比例所提供引物进行PMA-qPCR扩增时，PMA终浓度的改变不影响PRV活病毒及PRV灭活病毒的检测，不能区别PRV病毒是否具有感染性。该引物不可用于区分PRV病毒是否具有感染性。

对比例2引物的灵敏性检测结果

在本对比例中，为确定引物及方法的灵敏性，制备了重组质粒pUC19-PRV-gE标准品及建立了扩增曲线。

所述重组质粒pUC19-PRV-gE标准品是，使用上述实施例1中所述引物扩增得到的PRV-gE的基因片段插入pUC19中，形成重组质粒。

所述标准曲线的建立方法将上述制备的重组质粒测定拷贝数浓度后，10倍倍比稀释按上述方法进行qPCR扩增，见图5；以拷贝数浓度对数值为横坐标，以对应的Ct值为纵坐标绘制标准曲线，见图6。

标准曲线回归方程如下：y＝-4.0593x+45.31，其中y代表Ct值，x代表基因拷贝数浓度的对数；R

对比例3引物的特异性检测结果

本对比例采用与实施例1相同的qPCR扩增引物及PMA-qPCR检测的具体步骤。

本对比例分别选取PRV病毒和对照病毒，如猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒为样品，水为对照组。实验结果见图7。

图7结果显示PRV活病毒组Ct值＜35，判断样本为阳性；对照组病毒如猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒及水均无Ct值，判断样本均为阴性。说明采用本发明提供的PMA-qPCR检测方法对猪伪狂犬病毒具有明显的特异性和准确性。

对比例4 PMA对猪伪狂犬病毒PMA-qPCR检测的影响

本对比例采用与实施例1相同的qPCR扩增引物及PMA-qPCR检测的具体步骤。

本对比例以PRV活病毒组与PRV活病毒+PMA组为样品，以水卫对照组进行qPCR扩增，结果见图8。

图8结果显示，PRV活病毒组Ct值(①②)分别为26.96、26.77；PRV活病毒+PMA组Ct值(③④)分别为28.93、28.39；Ct值小于35，判断样本为阳性；而对照组(⑤⑥)无Ct值，判断样本为阴性。

本对比例说明PMA的添加对PRV病毒检测结果判定影响不大，因此PMA可用于PRV病毒的检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 猪伪狂犬病毒的PMA-qPCR检测方法

<130> KHP201118982.2

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttggatcca tgcggccctt tctgcgcgcc gcgcagctcc tggcgctgct ggccctggcg 60

ctctccaccg aggccccgag cctctccgcc gagacgaccc cgggccccgt caccgaggtc 120

ccgagtccct cggccgaggt ctgggacgac ctctccaccg aggccgacga cgatgacctc 180

aacggcgacc tcgacggcga cgaccgccgc gcgggcttcg gctcggccct cgcatccctg 240

agggaggcgc ccccggccca tctggtgaac gtgtccgagg gcgccaactt caccctcgac 300

gcgcgcggcg acggcgccgt gctggccggg atctggacgt tcctgcccgt ccgcggctgc 360

gacgccgtgt cgtaagaatt caaa 384

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttggatcca tgcggccctt tctg 24

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgaattct tacgacacgg cgtcgca 27

<210> 4

<211> 276

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctgtacgtg ctcgtgatga cccacaacgg ccacgtcgcc acctgggact acacgctcgt 60

cgccaccgcg gccgagtacg tcacggtcat caaggagctg acggccccgg cccgggcccc 120

gggcaccccg tggggccccg gcggcggcga cgacgcgatc tacgtggacg gcgtcacgac 180

gccggcgccg cccgcgcgcc cgtggaaccc gtacggccgg acgacgcccg ggcggctgtt 240

tgtgctggcg ctgggctcct tcgtgatgac gtgcgt 276

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgtacgtg ctcgtgat 18

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgcacgtca tcacgaagga g 21