一种富含surfactin和功能性微生物的饲料添加剂制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种富含surfactin和功能性微生物的饲料添加剂制备方法。

背景技术

动物性食品是非常重要，且优良的蛋白质补充源。动物性食品是畜禽养殖过程，通过畜禽将玉米、麦麸、米糠、青贮饲料等植物性食品转化获得，因此，如何降低植物性食品消耗量，加快动物性食品产出，即就是降低料肉比，成为了当前养殖行业重点关注的焦点。

目前，为了能够提升饲料利用率，促进畜禽生长，通常采取的是在饲料中添加促生长抗生素；但是，促生长抗生素的使用，造成了抗生素残留、环境污染、耐药性抗药性增强，致使动物长期处于亚健康状态，造成免疫力下降，养殖成本较高，甚至使得生产的动物性食品中也残留着促生长抗生素，极大程度影响了食用者的身体健康。因此，寻找能替代促生长抗生素的新型饲料添加剂，成为了当前养殖行业所重点关注研究方向。

Surfactin是芽孢杆菌通过非核糖体途径代谢产生的具有表面活性的环脂肽，由7个氨基酸残基组成的环肽和13-15个碳原子链长的β-羟基脂肪酸酯化而成。于1968年被Arima等首次从枯草芽孢杆菌中分离出来，具有极好的表面活性，对畜禽具有很好的促生长、抗氧化、增强动物机体免疫力等作用，已被广泛应用于畜禽饲料添加领域，例如：专利号为CN201510617789.X，公开了复合饲料添加剂，将芽孢杆菌抗菌肽和芽孢杆菌益生菌进行复合配制成饲料添加剂，使得芽孢杆菌抗菌肽含量为2-20mg/g，芽孢杆菌益生菌含量为1.0-5.0×10

为此，本研究者于2018年开展了以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21为种子进行发酵制备微生态制剂，例如：专利申请号为201810608662.5的枯草芽孢杆菌用于制备黄荆子微生态制剂方法，以黄荆子、黄豆粉、葡萄糖、尿素、水混合搅拌成培养基质，经接种发酵，喷洒无菌氯化钙补钙后，干燥粉碎装袋而得，使得其孢子数达到了1×10

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种富含surfactin和功能性微生物的饲料添加剂制备方法。

具体是通过以下技术方案得以实现的：

本发明创造的目的之一在于提供一种富含surfactin和功能性微生物的饲料添加剂制备方法，采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21发酵豆粕制备而成，包括以下步骤：

(1)制备培养基：按质量份计，取豆粕1000份、糖20-30份、磷酸二氢钾1份、氯化钾0.5份、硫酸镁0.5份、水1000-1200份，混合搅拌均匀，静置存放8-12h，常温常压环境下，用水蒸汽蒸1h，转入浅盘冷却，待用；

(2)接种发酵：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21活化，利用LB培养基制备成种子液，向步骤(1)装有培养基的浅盘中接种种子液，接种量为种子液占培养基质量的8-12％，搅拌均匀，通入无菌空气，控制发酵温度为25-40℃，发酵60-70h；

(3)干燥粉碎：将发酵所得产物置于50-70℃下干燥至含水率＜10％，粉碎装袋，即得。

上述的糖选自但不仅限于蔗糖、葡萄糖、果糖、红糖中一种或者几种混合。其主要目的是为了保障培养基中营养成分合理化，能够促使发酵进程加快。

上述的水，其中溶解有5ppm硫酸铜、5ppm硫酸锰、5ppm硫酸亚铁和5ppm硫酸锌。将有助于提高种子液接种后的发酵效果，提高枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21发酵过程产生surfactin的量，提高饲料添加剂的功效。

优选，所述的转入浅盘冷却，是将水蒸汽蒸1h后的培养基在浅盘内堆积厚度为3-5cm。所述的步骤(2)，发酵时间为60h。

本发明创造的目的之二在于提供上述的方法制备的富含surfactin和功能性微生物的饲料添加剂，所述的饲料添加剂中，surfactin含量≥0.6mg/g，且芽孢数＞1×10

优选，所述的饲料添加剂中，surfactin含量为0.6579mg/g，且芽孢数为8.9×10

本发明创造的目的之二在于提供上述的富含surfactin和功能性微生物的饲料添加剂应用于羊、鸡、猪饲料的制备。

优选，所述的饲料添加剂在饲料中添加量为占基础日粮质量0.10-0.50％。

优选，所述的饲料添加剂在饲料中添加量为占基础日粮质量0.30％。

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

①利用豆粕作为培养基主要原料，采用固态发酵方式，一是大幅度提高了豆粕经济效益，实现豆粕应用于生产含surfactin功能性饲料添加剂目的，二是改善发酵条件和培养基营养成分，促使枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21发酵生产surfactin量得到提升，提升经济价值，使得surfactin含量≥0.6mg/g，且芽孢数＞1×10

②本发明饲料添加剂属于surfactin与功能性微生物复合的添加剂，利用制备工艺过程调节与配方控制，充分保障了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21在发酵过程能大量生产surfactin，使得surfactin产生量大幅度的提高。

③本发明利用固体发酵技术，发酵完毕烘干即可使用，缩短了工艺流程，简化了工艺，且保障了工艺的可靠性，使得在工业规模化生产的设备资金投入较少。

④本发明创造所得的饲料添加剂具有催肥促长、调节肠道、提高免疫力的功效，有助于降低料肉比、降低死亡率，进而降低畜牧养殖成本，提高养殖经济效益。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

本发明创造采用的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21，于2018年04月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号为：CGMCCNo：15544。该菌种已于2018年06月13日提交了并公开在了专利申请号为201810608662.5的专利申请文件中。对于该菌株产抗菌肽、surfactin等现状均已经在现有文献中所公开，在此不再过多赘述。

LB培养基是：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl10.0 g/L，水1L，pH 7。

本发明创造基于前期的研究基础，考虑到不同的培养基配方、发酵工艺等条件，会影响菌株的生长性能，造成菌株产生有效成分有差异，综合现有研究基础，对生产富含surfactin的复合添加剂进行研究，实现了surfactin高含量与发酵工艺简单化的统一。

鉴于此，本研究者开展了如下具体研究内容：

实施例1

饲料添加剂制备方法，采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21发酵豆粕制备而成，包括以下步骤：

(1)制备培养基：按质量计，取豆粕10kg、红糖200g、磷酸二氢钾10g、氯化钾5g、硫酸镁5g、纯水10L，混合搅拌均匀，静置存放8-12h，常温常压环境下，用水蒸汽蒸1h，转入浅盘冷却，在浅盘堆积厚度为3-5cm，待用；

(2)接种发酵：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21活化，利用LB培养基制备成种子液，向步骤(1)装有培养基的浅盘中接种种子液，接种量为种子液占培养基质量的8％，搅拌均匀，通入无菌空气，控制发酵温度为25-40℃，发酵70h；

(3)干燥粉碎：将发酵所得产物置于50-70℃下干燥至含水率＜10％，粉碎装袋，即得。

实施例2

饲料添加剂制备方法，采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21发酵豆粕制备而成，包括以下步骤：

(1)制备培养基：按质量份计，取豆粕10kg、红糖与果糖等量比混合物糖300g、磷酸二氢钾10g、氯化钾5g、硫酸镁5g、纯水10L，混合搅拌均匀，静置存放8-12h，常温常压环境下，用水蒸汽蒸1h，转入浅盘冷却，在浅盘堆积厚度为3-5cm，待用；

(2)接种发酵：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21活化，利用LB培养基制备成种子液，向步骤(1)装有培养基的浅盘中接种种子液，接种量为种子液占培养基质量的12％，搅拌均匀，通入无菌空气，控制发酵温度为25-40℃，发酵60h；

(3)干燥粉碎：将发酵所得产物置于50-70℃下干燥至含水率＜10％，粉碎装袋，即得。

实施例3

饲料添加剂制备方法，采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21发酵豆粕制备而成，包括以下步骤：

(1)制备培养基：按质量份计，取豆粕10kg、葡萄糖250g、磷酸二氢钾10g、氯化钾5g、硫酸镁5g、水10L，且水中溶解有硫酸铜50mg、硫酸锰50mg、硫酸亚铁50mg和硫酸锌50mg，混合搅拌均匀，静置存放8-12h，常温常压环境下，用水蒸汽蒸1h，转入浅盘冷却，在浅盘堆积厚度为3-5cm，待用；

(2)接种发酵：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21活化，利用LB培养基制备成种子液，向步骤(1)装有培养基的浅盘中接种种子液，接种量为种子液占培养基质量的10％，搅拌均匀，通入无菌空气，控制发酵温度为25-40℃，发酵60h；

(3)干燥粉碎：将发酵所得产物置于50-70℃下干燥至含水率＜10％，粉碎装袋，即得。

1、测定试验

对实施例1-3制备得到的饲料添加剂作为样品，开展surfactin和孢子数测定试验。

孢子数测定方法：称取1.00g发酵好的surfactin功能性微生物饲料添加剂，加入无菌水定容至100mL，80℃水浴10min，再采用平板菌落计数法计数，所得计数结果即芽孢数。

Surfactin测定方法：采用HPLC定量测定法测定。

HPLC定量测定：

色谱条件：色谱柱5TC-C18，波长210nm，流速1mL/min，时间0-20min，流动相：90％乙腈(有机相和水相均含0.1％三氟乙酸)；仪器：安捷伦1100型色谱仪。

测定方法：在上述色谱条件下检测精密配制的surfactin(sigma)标准品梯度溶液浓度，制作surfactin标准品浓度与峰面积关系的标准曲线。得到surfactin标准品峰面积与浓度(mg/mL)的关系函数，Y＝6920.7x+404.36，R

将上述测定试验结果记录在如下表1中。

表1

2、养殖应用试验

本研究者为了能够验证本发明创造所得的饲料添加剂对动物生长性能以免疫力影响效果，于2019年、2020年两年间，将上述实施例1-3制备的样品直接应用于相应饲料配制，并饲养雏鸡、猪、羊，测定雏鸡、猪、羊生长性能，具体试验研究如下所述：

2.1基础日粮

表2

2.2饲养试验

饲养饲料配制：按照每t基础日粮加入3kg上述实施例1-3制备的饲料添加剂的配比配制饲养用饲料作为实验组，单独采用基础日粮饲养作为对照组。

2.21雏鸡饲养试验

2.211试验方法

选取本地品种鸡苗，按照每组试验内设三个重复组，每重复组20只鸡苗。按照早晚各喂食1次，自由采食，定期清理粪便，保障鸡舍内卫生；分别于供食鸡苗20日龄、35日龄、50日龄对各试验组进行空腹称重，记录每组喂食量及自然死亡情况。

2.212试验结果

将喂养雏鸡过程的生长性能记录如下表3所示：

表3

将喂养雏鸡过程雏鸡死亡率和料重比的计算数据记录如下表4所示：

表4

由表3、表4数据显示，本发明制备所得的饲料添加剂添加到基础日粮中，能够明显改善雏鸡生长速率，降低发病率和死亡率，增强免疫力，降低养殖成本。

2.22仔猪饲养试验

选取48头30±3日龄，且体重等体态特征相近的江口萝卜猪×杜洛克猪×长白猪三元杂交断奶仔猪，随机分为4个处理组，每个处理组12头，每个处理组重复三次，每重复组4头。4个处理组分别采用实施例1-3制备的饲料添加剂添加所得的饲养饲料和纯日粮作为饲料投喂(对照组)，按照每日早晚各投料1次，自由采食，投料饲养28d后，空腹称重，计算平均增重，记录采食量，且计算料重比，其结果如下表5所示：

表5

由表5显示可见，本发明创造所得的饲料添加剂添加在基础日粮中，能够有助于改善仔猪生长性能，达到促肥增长的效果，降低料重比，降低养殖成本。

2.23羔羊喂养试验

选取120只15±4日龄，且体重等体态特征相近的沿河白山羊，随机分为4个处理组，每处理组30只；每处理组三个重复处理，每个重复处理组10只。4个处理组分别采用实施例1-3制备的饲料添加剂添加所得的饲养饲料以及纯日粮作为饲料投喂(对照组)，按照每日早晚各投料1次，自由采食，投料饲养30d后，空腹称重，计算平均增重，记录采食量，且计算料重比，其结果如下表6所示：

表6

由表6显示可见，本发明创造所得的饲料添加剂添加在基础日粮中，能够有助于改善羔羊生长性能，达到促肥增长的效果，降低料重比，降低养殖成本。

综上，本发明创造所得的饲料添加剂具有用于畜禽养殖过程，催肥促长、调节肠道、提高免疫力功效，降低畜禽养殖成本，提高畜禽养殖经济效益。

3、饲料添加剂添加量优化试验

3.1试验方法

以实施例3制备的饲料添加剂作为该试验的饲料添加剂，将该饲料添加剂按照以下配比与基础日粮配制成雏鸡饲养饲料。

①基础日粮+0.10％饲料添加剂；

②基础日粮+0.20％饲料添加剂；

③基础日粮+0.40％饲料添加剂；

④基础日粮+0.50％饲料添加剂；

将上述配制所得的饲料用于雏鸡喂养试验，试验方法参见“2.21雏鸡饲养试验”部分阐述，在此不再赘述。

3.2试验结果

将喂养雏鸡过程的生长性能记录如下表7所示：

表7

将喂养雏鸡过程雏鸡死亡率和料重比的计算数据记录如下表8所示：

表8

由表7、表8数据显示，合适添加量将有助于改善雏鸡生长性能，加快雏鸡促肥增长，增强免疫力，降低死亡率，降低料重比，降低养殖成本。在基础日粮中添加surfactin含量为0.6579mg/g，且芽孢数为8.9×10

4、带病动物试验情况

将实施例3制备的饲料添加剂，按照占基础日粮0.1％的质量比加入混合，供给拉稀羊群作为饲料喂养，按照每日早晚各投料1次，自由采食，喂养1-2d后，拉稀羊群不再拉稀，且相比未添加饲料添加剂，直接以基础日粮喂养作为对照组来说，其日增重明显增加，料重比明显降低，未见有拉稀羊群死亡。

将实施例3制备的饲料添加剂，按照占基础日粮0.1％的质量比加入混合，供给拉稀鸡作为饲料喂养，按照每日早晚各投料1次，自由采食。经喂养1-2d后，鸡的拉稀效果得到了明显改善，相比未添加饲料添加剂，直接以基础日粮喂养作为对照组来说，拉稀鸡的死亡率低80％以上，极大程度提高了拉稀鸡的抗病力，增强了免疫力。

本发明创造其他未尽事宜参照现有技术，或者本领域技术人员所熟知的公知常识、常规技术手段加以实现，即可。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。