CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(CTC)的检测已被广泛应用于肿瘤疗效的快速评估、预后的判别及耐药与复发的即时性监测。免疫荧光原位杂交(imFISH)是在组织、细胞水平上对蛋白、DNA或RNA进行定性、定位和定量分析的实验技术，利用该技术对CTC进行鉴别与分类，可确定并分离出具有特殊临床意义的CTC。近年来CTC阴性富集法联合imFISH检测技术展现出了良好的前景。

质控样品对于确保方法的准确性具有重要作用。现有技术中，循环肿瘤细胞(CTC)阴性富集法+imFISH检测技术未有质控品及质控方法，因此该方法用于检测CTC的准确性难以判断。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法，以解决现有技术中缺乏此类质控品的技术问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法，包括以下步骤：留取肿瘤细胞，经胰酶消化后利用甲醇-乙酸固定液进行梯度固定。

作为优选，所述肿瘤细胞是经细胞培养获得的。

作为优选，所述肿瘤细胞是活体肿瘤经切除破碎获得的。

作为优选，所述肿瘤细胞是单个肿瘤细胞或肿瘤细胞团。

作为优选，所述胰酶消化的时长为3～5min，待肿瘤细胞呈漂浮状时，加入封闭血清终止消化。

作为优选，在所述梯度固定的过程中，每次均包括以下步骤：向肿瘤细胞中加入其体积20～50倍的、含有甲醇乙酸混合液的工作液，混匀，静置10min后，800～2000r/min离心5～10min。

作为优选，在所述梯度固定的过程中，甲醇乙酸混合液在工作液中的占比依次为25％、50％、75％、100％；所述工作液中，除甲醇乙酸混合液之外，余量均为浓度0.9％的NaCl溶液。

作为优选，所述梯度固定完毕后，还包括以下步骤：将肿瘤细胞重悬于甲醇乙酸混合液中，利用甲醇乙酸混合液对其进行稀释，并进行细胞计数。

作为优选，待稀释至5-10个细胞或细胞团/μL时，停止稀释，置于不低于0℃的环境中保存。

作为优选，在胰酶消化后，不执行所述梯度固定步骤，而执行以下步骤：将肿瘤细胞与细胞冻存液混匀，置于不高于-70℃的环境中保存。

在以上技术方案中，质控细胞可为单个肿瘤细胞也可以是肿瘤细胞团。此外，培养的肿瘤细胞在酶消化后(或活体肿瘤切除破碎后的肿瘤细胞用酶处理后)可不经过甲醇-乙酸-NaCl梯度固定液固定，而是可直接计数后用细胞冻存液混匀，置超低温冰箱保存。

本发明提供了CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法。该方法制备的质控样品，可从CTC的富集至imFISH阶段做全程质控，可用于判断批次间检测技术的准确性，并对检测人员操作方法及细胞回收率进行质控，保证每一例病例检测的准确性。该质控样品为经过处理并固定DNA的培养肿瘤细胞，可长期保存于固定液中，而且在常温或冰箱冷藏保存即可，无需超低温冰箱保存活细胞。

本发明解决了CTC阴性富集法联合imFISH检测技术中缺少临床实验室质控要求的问题，所制备的质控样品能够从富集细胞开始到imFISH最后的阅片阶段实现质量控制，在该项检测技术中增加质控项目有利于提高检测的准确性，对实验室及检测技术中存在失控之处能及时反应出来，并及时予以纠正，对提高此项检测技术的检测质量具有积极意义。本发明在循环肿瘤细胞(CTC)阴性富集法+imFISH检测技术中实现了富集细胞阶段及imFISH阶段的实验室质量控制，可具体用于检测CTC富集阶段的肿瘤细胞富集率、评价imFISH阶段的制片情况等实验。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法，包括以下步骤：

1、细胞实验室培养肿瘤细胞：

A、将含有肿瘤细胞的细胞冻存管从液氮或超低温冰箱中取出后，迅速放入37℃水浴锅中轻微摇动，复苏细胞。待液体融化后，用75％酒精喷洒瓶身并移至超净工作台。

B、将冻存管中的细胞悬液全部转移至含有10ml培养液的15ml离心管中，1000r/min，离心5min。

C、离心完毕后，取出离心管，弃去上清，并于离心管中加入1ml培养液，混匀。将混匀后的细胞悬液全部转移至装有10ml培养液的10cm培养皿中，轻轻摇动，使得细胞与培养液充分混匀并均匀分布于培养皿中。

D、将盛有细胞混悬液的培养皿置于37℃，5％CO

E、隔夜培养，并于倒置显微镜下观察培养细胞覆盖率。当培养皿中的细胞覆盖率达到80％～90％时传代。将原有培养液吸取并弃去，加入2ml PBS液，清洗细胞，清洗2次，并吸尽培养皿中的PBS。

2、培养良好的肿瘤细胞从培养箱取出后，加入1ml胰酶消化3-5min，(胰酶量可根据细胞量而定)并在倒置显微镜下观察，待大部分细胞呈漂浮状时，加入封闭血清终止消化。

3、将培养皿中的细胞悬液全部转移至15ml离心管中，800-2000r/min离心5-10min。

4、离心完毕，弃去上清液，加入25％的甲醇-乙酸-0.9％NaCl液(甲醇乙酸混合液占25％)，加入的量约为离心管中细胞沉淀的20-50倍体积大小。混匀，静置10min后，800-2000r/min离心5-10min。

5、离心完毕，弃去上清液，加入50％的甲醇-乙酸-0.9％NaCl液(甲醇乙酸混合液占50％)，加入的量约为离心管中细胞沉淀的20-50倍体积大小。混匀，静置10min后，800-2000r/min离心5-10min。

6、离心完毕，弃去上清液，加入75％的甲醇-乙酸-0.9％NaCl液(甲醇乙酸混合液占75％)，加入的量约为离心管中细胞沉淀的20-50倍体积大小。混匀，静置10min后，800-2000r/min离心5-10min。

7、离心完毕，弃去上清液，加入100％的甲醇-乙酸液，加入的量约为离心管中细胞沉淀的20-50倍体积大小。混匀，静置10min后，800-2000r/min离心5-10min。

8、离心完毕，弃去上清液，加入100％的甲醇-乙酸液至10ml刻度线并混匀细胞悬液。

9、将15ml离心管中的细胞悬液在进一步稀释，可分装于多个15ml或50ml离心管中并用甲醇-乙酸固定液稀释，边稀释边用移液枪吸取10ul滴于玻片中观察并计数细胞，稀释至5-10个/ul细胞或细胞团时可停止稀释。

10、吸取100-200ul细胞悬液于微量细胞计数保存瓶中，并放置于倒置显微镜中计数并记下细胞数，瓶壁编号。

11、计数完毕后于保存瓶中加入500-1000ul的甲醇-乙酸固定液，拧紧瓶盖，常温或常规冷藏保存均可。

12、保存于微量细胞计数保存瓶中的质控细胞混悬液可按阴性富集法收集CTC操作，用于批内与批间质控。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。