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经修饰的微生物和使用其制造丁二烯的方法

文献发布时间：2023-06-19 11:13:06

本申请是申请日为2012年12月17日、申请号为201280069265.6、发明名称为“经修饰的微生物和使用其制造丁二烯的方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明大体上涉及经修饰的微生物和使用其制造丁二烯的方法。

背景技术

丁二烯(1,3-丁二烯，CH

发明内容

本发明大体上涉及微生物(例如非天然存在的微生物，在本文中也称为被修饰的微生物)，其包含一或多种编码一或多种路径中催化碳源向丁二烯转化的酶的多核苷酸；和所述微生物在工业过程中的用途，包括用于制造丁二烯和衍生自其的产物。

本发明提供从可发酵碳源制造丁二烯的方法，其包含：提供可发酵碳源；使所述可发酵碳源与微生物在发酵培养基中接触，所述微生物包含一或多种编码在丁二烯制造路径中路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的酶的多核苷酸，和一或多种编码路径中催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸；以及使所述一或多种编码在所述丁二烯制造路径中所述路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的所述酶的多核苷酸、和所述一或多种编码路径中催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸在所述微生物中表达，以制造丁二烯。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，在所述丁二烯制造路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的所述酶陈列于表1-3中的任一者中。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的所述酶陈列于表1-3中的任一者中。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，丁二烯经由乙酰CoA和丙酰CoA中间物；巴豆酰CoA中间物；和/或甲酸中间物来制造。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化乙酰CoA和丙酰CoA向酮戊酰CoA转化的酶的多核苷酸编码酮硫解酶，包括例如由如SEQ ID NO:58-78中的任一者陈列的多核苷酸编码的酮硫解酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化酮戊酰CoA向(R)或(S)3-羟基戊酰CoA转化的酶的多核苷酸编码氧化还原酶，包括例如由如SEQ ID NO:103-123中的任一者陈列的多核苷酸编码的氧化还原酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化(R)或(S)羟基戊酰CoA向2-戊烯酰CoA转化的酶的多核苷酸编码脱水酶，包括例如由如SEQ ID NO:37-55中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱水酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化2-戊烯酰CoA向2-戊烯酸转化的酶的多核苷酸编码转移酶或水解酶，包括例如分别由如SEQ ID NO:1-28或29-33中的任一者陈列的多核苷酸编码的转移酶或水解酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化2-戊烯酸向丁二烯转化的酶的多核苷酸编码脱羧酶，包括例如由如SEQID NO:79-98中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱羧酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化2-戊烯酸向4-戊烯酸转化的酶的多核苷酸编码异构酶，包括例如由如SEQ ID NO:99-102中的任一者陈列的多核苷酸编码的异构酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化4-戊烯酸向丁二烯转化的酶的多核苷酸编码脱羧酶，包括例如由如SEQID NO:79-98中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱羧酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化2-戊烯酰CoA向戊-2,4-二烯酰CoA转化的酶的多核苷酸编码脱氢酶，包括例如由如SEQ ID NO:124-139中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱氢酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化戊-2,4-二烯酰CoA向戊-2,4-二烯酸转化的酶的多核苷酸编码转移酶或水解酶，包括例如分别由如SEQ ID NO:1-28或29-33中的任一者陈列的多核苷酸编码的转移酶或水解酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化2,4-戊烯酸向丁二烯转化的酶的多核苷酸编码脱羧酶，包括例如由如SEQ ID NO:79-98中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱羧酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向巴豆醇转化的酶的多核苷酸编码氧化还原酶，包括例如由如SEQ ID NO:103-123中的任一者陈列的多核苷酸编码的氧化还原酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向巴豆醛转化的酶的多核苷酸编码氧化还原酶，包括例如由如SEQ ID NO:103-123中的任一者陈列的多核苷酸编码的氧化还原酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化巴豆醛向巴豆醇转化的酶的多核苷酸编码氧化还原酶或CoA合成酶，包括例如分别由如SEQ ID NO:103-123或SEQ ID NO 34-36中的任一者陈列的多核苷酸编码的氧化还原酶或合成酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化巴豆醇向丁二烯转化的酶的多核苷酸编码脱水酶，包括例如由如SEQ IDNO:37-55中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱水酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化CO

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化丙酮酸酯和CoA向乙酰CoA和甲酸转化的酶的多核苷酸编码酮硫解酶，包括例如由如SEQ ID NO:58-78中的任一者陈列的多核苷酸编码的酮硫解酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化甲酸向甲酰CoA转化的酶的多核苷酸编码转移酶或CoA合成酶，包括例如分别由如SEQ ID NO:1-28或34-36中的任一者陈列的多核苷酸编码的转移酶或CoA合成酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化2乙酰CoA向乙酰乙酰CoA转化的酶的多核苷酸编码酮硫解酶，包括例如由如SEQ ID NO:58-78中的任一者陈列的多核苷酸编码的酮硫解酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化乙酰乙酰CoA和甲酰CoA向3,5-酮戊酰CoA转化的酶的多核苷酸编码酮硫解酶，包括例如由如SEQ ID NO:58-78中的任一者陈列的多核苷酸编码的酮硫解酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化3,5-酮戊酰CoA向(R)或(S)-5-羟基-3-酮戊酰CoA转化的酶的多核苷酸编码氧化还原酶，包括例如由如SEQ ID NO:103-123中的任一者陈列的多核苷酸编码的氧化还原酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化(R)或(S)-5-羟基-3-酮戊酰CoA向(R)或(S)-3,5-二羟基戊酰CoA转化的酶的多核苷酸编码氧化还原酶，包括例如由如SEQ ID NO:103-123中的任一者陈列的多核苷酸编码的氧化还原酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化(R)或(S)-3,5-二羟基戊酰CoA向(R)或(S)3-羟基-4-戊烯酰CoA转化的酶的多核苷酸编码脱水酶，包括例如由如SEQ ID NO:37-55中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱水酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化(R)或(S)-3-羟基-4-戊烯酰CoA向3-羟基-4-戊烯酸转化的酶的多核苷酸编码转移酶或水解酶，包括例如分别由如SEQ ID NO:1-28或29-33中的任一者陈列的多核苷酸编码的转移酶或水解酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多种编码路径中催化3-羟基-4-戊烯酸向丁二烯转化的酶的多核苷酸编码脱羧酶，包括例如由如SEQ ID NO:79-98中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱羧酶。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述微生物是选自由以下组成的属的细菌：伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、丙酸螺菌属(Propionispira)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、暗杆菌属(Pelobacter)或乳杆菌属(Lactobacillus)。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述微生物是真核生物，其是酵母、丝状真菌、原生动物或藻类。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述碳源是甘蔗汁、甘蔗糖蜜、水解淀粉、水解木质纤维素材料、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳酸酯、乳糖、木糖、丙酮酸酯或甘油，呈其任何形式或混合物形式。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述碳源是单糖、寡糖或多糖。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述丁二烯由所述微生物分泌到所述发酵培养基中。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述方法可以进一步包含从所述发酵培养基回收所述丁二烯。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述微生物已经被遗传修饰，以使所述一或多种编码在所述丁二烯制造路径中路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的酶的多核苷酸、和所述一或多种编码路径中催化一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸表达。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述可发酵碳源向丁二烯的所述转化是ATP阳性(例如每分子制造的丁二烯产生净ATP)，并且可以与NADH消耗路径组合以提供丁二烯制造的厌氧工艺。

本发明还提供微生物，其包含一或多种编码在丁二烯制造路径中路径中催化可发酵碳源向一或多种中间物转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的所述酶陈列于表1-3中的任一者中。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，丁二烯经由乙酰CoA和丙酰CoA中间物；巴豆酰CoA中间物；和/或甲酸中间物来制造。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述微生物是选自由以下组成的属的细菌：伯克霍尔德菌属、丙酸杆菌属、丙酸螺菌属、梭菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、暗杆菌属或乳杆菌属。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述微生物是真核生物，其是酵母、丝状真菌、原生动物或藻类。

在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述酵母是酿酒酵母、运动发酵单胞菌或巴斯德毕赤酵母。

本发明的这些和其它实施例将更详细揭示于下文中。

附图说明

本发明的以上发明内容以及以下具体实施方式当结合附图阅读时将得到更好理解。出于说明本发明的目的，图中展示本发明优选的实施例。然而，应理解，本发明不限于所示的确切配置、实例和手段。

具体实施方式

本发明大体上涉及微生物(例如非天然存在的微生物；被修饰的微生物)，其包含被遗传修饰的路径；和所述微生物用于将可发酵碳源转化为丁二烯的用途(参看图1-3)。所述微生物包含一或多种编码经由新颖酶路径催化可发酵碳源向丁二烯转化的酶的多核苷酸。任选地，所制造的丁二烯接着可以转化为聚丁二烯或许多其它含丁二烯的聚合物。

本发明部分提供新颖酶路径(包括例如新颖酶路径组合)的发现，其用于从碳源(例如可发酵碳源)制造丁二烯。本文中揭示的酶路径允许经由以下来酶促制造丁二烯：乙酰CoA和丙酰CoA中间物；巴豆酰CoA中间物；和/或甲酸中间物。

本文中提供的方法提供类似于灭菌的最后结果而无典型地为建立和在整个制造工艺期间维持无菌所需的高资金支出和持续较高管理成本。在此方面，大多数工业规模的丁二烯制造工艺因其工艺的好氧性质而在可测量数目的细菌污染物存在下操作。据信，丁二烯制造工艺的细菌污染导致产物产率降低和制造丁二烯的微生物的生长抑制。由于制造的丁二烯的有毒性质减少制造工艺中的污染物，因此现有方法的所述缺陷通过本发明揭示的方法来避免。

本文中揭示的酶路径与先前已知酶路径相比对于制造丁二烯来说是有利的，由于本文中揭示的酶路径是ATP阳性并且当与NADH消耗路径组合时它可以提供丁二烯的厌氧路径。虽然有可能使用好氧工艺制造丁二烯，但厌氧工艺因当在发酵工艺(尤其丁二烯发酵)期间烯烃(其本质上是爆炸性的)与氧气混合时招致的风险而是优选的。此外，在发酵器中补充氧气和氮气需要空气压缩机、发酵器(泡罩塔或气提发酵器)、温度控制和氮气的额外投资。氧气的存在还可以催化丁二烯的聚合并且可以促进发酵器培养液中好氧污染物的生长。另外，制造丁二烯的好氧发酵工艺在工业规模下呈现出几个缺陷(其中它对于维持无菌条件是技术上有挑战的)，例如以下事实：(i)获得更多生物质，对于所要产物来说降低碳的总产率；(ii)氧气的存在促进污染物的生长(韦斯特许斯(Weusthuis)等人,2011,生物技术动向(Trends in Biotechnology),2011,第29卷,第4期,153-158)；和(iii)氧气与气态化合物(例如丁二烯)的混合物造成严重爆炸风险；(iv)氧气可能会催化不期望的烯烃聚合反应；以及最终(v)在好氧条件下的较高发酵和纯化成本。另外，通过本文中揭示的工艺制造的丁二烯未搀入O

应理解，本文中描述的任何和所有方法中涉及的步骤可以按任何次序进行并且不限制或局限于具体叙述的次序。举例来说，本发明提供从可发酵碳源制造丁二烯的方法，其包含：提供可发酵碳源；使所述可发酵碳源与微生物在发酵培养基中接触，所述微生物包含一或多种编码在丁二烯制造路径中路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的酶的多核苷酸，和一或多种编码路径中催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸；以及使所述一或多种编码在所述丁二烯制造路径中所述路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的所述酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸在所述微生物中表达，以制造丁二烯。因此，使所述一或多种编码在所述丁二烯制造路径中所述路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的所述酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸在所述微生物中表达以制造丁二烯可以在使所述可发酵碳源与微生物在发酵培养基中接触之前或之后进行，所述微生物包含一或多种编码在所述丁二烯制造路径中路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸。

还应理解，本文中揭示的微生物可以包含图1-3中的任一者中揭示的整个路径，包括、包含所有编码催化可发酵碳源向丁二烯转化的酶的多核苷酸。或者，还应理解，本文中揭示的微生物可以包含一或多种编码图1-3中的任一者中的催化可发酵碳源向丁二烯转化的酶的多核苷酸(例如微生物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上编码如图1-3中的任一者中所揭示的催化可发酵碳源向丁二烯转化的酶的多核苷酸)。

在一些实施例中，所制造的丁二烯的克数与可发酵碳源的克数的比率是0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.50、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1.00。

在一些实施例中，所制造的丁二烯中的碳的摩尔数目构成可发酵碳源中的碳的摩尔数目的20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

如本文中所用，“丁二烯”旨在意指丁-1,3-二烯或1,3-丁二烯(CAS 106-99-0)，通式是CH

如本文中所用，术语“生物活性”或“功能活性”当提及蛋白质、多肽或肽时，可以意指所述蛋白质、多肽或肽展现关于某一生物过程、路径或反应适用的功能或性质。生物或功能活性可以指例如与另一多肽或分子相互作用或缔合(例如结合)的能力，或它可以指催化或调节其它蛋白质或分子的相互作用(例如酶促反应)的能力。

如本文中所用，术语“培养”可以指使细胞(例如微生物细胞)群体在适用于生长的条件下在液体培养基中或在固体培养基上生长。

如本文中所用，术语“衍生自”可以涵盖术语源自、获自、可获自、分离自和产生自，并且一般来说表示一种规定物质在另一规定物质中得到其来源或具有可以参考另一规定物质描述的特征。

如本文中所用，术语“表达载体”可以指含有编码多肽或蛋白质的多核苷酸或核酸序列(例如可操作地连接于一或多个能够影响宿主中的编码序列表达的适合控制序列的DNA编码序列(例如基因顺序))的DNA构建体。所述控制序列包括影响转录的启动子、控制所述转录的任选的操纵序列、编码适合mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是可能的基因组插入物。在转型到适合宿主中后，载体可以复制并且独立于宿主基因组而起作用(例如独立载体或质粒)，或在一些情况下，可以自身整合到基因组中(例如整合的载体)。质粒是最常用的表达载体形式。然而，本发明旨在包括这样的其它表达载体形式，以便提供等效功能并且在本领域中已知或变得已知。

如本文中所用，术语“表达”可以指基于编码多肽(例如基因)的核酸序列制造多肽的过程。所述过程包括转录和翻译。

如本文中所用，术语“基因”可以指制造多肽或蛋白质(例如融合蛋白)中涉及的DNA区段，并且包括在编码区之前和之后的区以及个别编码区段(外显子)之间的介入序列(内含子)。

如本文中所用，术语“异源”关于核酸、多核苷酸、蛋白质或肽可以指非天然存在于规定细胞(例如宿主细胞)中的核酸、多核苷酸、蛋白质或肽。希望所述术语涵盖由天然存在的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。相比之下，术语同源关于核酸、多核苷酸、蛋白质或肽是指天然存在于细胞中的核酸、多核苷酸、蛋白质或肽。

如本文中所用，术语“宿主细胞”可以指细胞或细胞系，包括细胞，例如重组表达载体可以被转染用于表达多肽或蛋白质(例如融合蛋白)的微生物。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，并且子代因天然、意外或蓄意突变而可以不必与初始母细胞完全一致(在形态方面或在总基因组DNA互补序列方面)。宿主细胞可以包括用表达载体进行体内转染或转型的细胞。

如本文中所用，术语“引入”在将核酸序列或多核苷酸序列插入到细胞中的情形下，可以包括转染、转型或转导并且指将核酸序列或多核苷酸序列并入到真核或原核细胞中，其中核酸序列或多核苷酸序列可以被并入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中、转化为自主复制子或瞬时表达。

如本文中所用，术语“非天然存在”在关于本发明的微生物体或微生物使用时旨在意指微生物体具有至少一个在所参考物种的天然存在菌株(包括所参考物种的野生型菌株)中并不常见的基因改变。基因改变包括例如引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其它核酸添加、核酸缺失和/或微生物体遗传物质的其它功能性破坏。所述修饰包括例如所参考物种的异源、同源或异源与同源多肽的编码区和其功能片段。其它修饰包括例如修饰改变了基因或操纵子的表达的非编码调节区。本发明的非天然存在的微生物体可以含有稳定基因改变，其是指可以被培养五代以上而无改变损失的微生物。一般来说，稳定基因改变包括持续10代以上的修饰，具体地说稳定修饰将持续约25代以上，并且更具体地说稳定遗传修饰将持续50代以上，包括无限期。本领域的技术人员应理解，包括本文中例示的代谢修饰的基因改变参考适合宿主生物体(例如大肠杆菌(E.coli))和其相应代谢反应或所要遗传物质(例如所要代谢路径的基因)的适合来源生物体来描述。然而，考虑到多种生物体的完整基因组定序和基因组学领域中的高技术水平，本领域的技术人员将能够容易地将本文中提供的教示和指导应用于基本上所有其它生物体。举例来说，本文中例示的大肠杆菌代谢改变可以通过并有来自不同于所参考物种的物种的相同或类似编码核酸容易地应用于其它物种。所述基因改变大体上包括例如物种同源物的基因改变，和尤其直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置换。

如本文中所用，“丁二烯”旨在意指一种共轭直链二烯，分子式是C4H6，通式是CH

如本文中所用，术语“可操作地连接”可以指规定元件的并置或配置，其使所述元件一齐起作用以实现一种效果。举例来说，启动子在它控制编码序列的转录时可以可操作地连接于编码序列。

如本文中所用，术语“启动子”可以指结合RNA聚合酶以引发基因转录中涉及的调节序列。启动子可以是诱导性启动子或组成性启动子。诱导性启动子是在环境或发育调节条件下活性的启动子。

如本文中所用，术语“多核苷酸”或“核酸序列”可以指具有任何长度和任何三维结构并且单链或多链(例如单链、双链、三螺旋等)的核苷酸聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的类似物或被修饰的形式，包括被修饰的核苷酸或碱基或其类似物。所述多核苷酸或核酸序列可以编码氨基酸(例如多肽或蛋白质，例如融合蛋白)。因为遗传密码是简并的，所以一个以上密码子可以用以编码具体氨基酸，并且本发明涵盖编码具体氨基酸序列的多核苷酸。可以使用任何类型的被修饰的核苷酸或核苷酸类似物，只要多核苷酸在使用条件下维持所要功能即可，包括增加核酸酶抗性的修饰(例如脱氧、2'-O-Me、硫代磷酸酯等)。还可以出于检测或捕获例如放射性或非放射性标记或锚定(例如生物素)的目的并入标记。术语多核苷酸还包括肽核酸(PNA)。多核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。术语多核苷酸、核酸和寡核苷酸在本文中可互换使用。多核苷酸可以含有RNA、DNA或两者和/或其被修饰的形式和/或类似物。核苷酸的序列可以杂有非核苷酸组分。一或多个磷酸二酯键联可以置换为替代性键联基团。这些替代性键联基团包括(但不限于)其中磷酸酯置换为P(O)S(硫代酯)、P(S)S(二硫代酯)、(O)NR

如本文中所用，术语“蛋白质”或“多核苷酸”可以指包含氨基酸并且由本领域的技术人员公认为蛋白质的组合物。本文中使用氨基酸残基的常规一字母或三字母编码。术语蛋白质和多肽在本文中可互换用以指具有任何长度的氨基酸聚合物，包括包含键联(例如融合)肽/多肽(例如融合蛋白)的那些。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含被修饰的氨基酸，并且它可以杂有非氨基酸。所述术语还涵盖已经被天然地或通过介入而修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰，例如与标记组分结合。定义内还包括例如含有一或多种氨基酸(包括例如非天然氨基酸等)类似物以及本领域中已知的其它修饰的多肽。

如本文中所用，相关蛋白质、多肽或肽可以涵盖变异蛋白质、多肽或肽。变异蛋白质、多肽或肽在少量氨基酸残基方面不同于母体蛋白质、多肽或肽和/或彼此。在一些实施例中，不同氨基酸残基的数目是以下中的任一者：约1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45或50个。在一些实施例中，变异体相差约1到约10个氨基酸。或者或另外，变异体与参考蛋白或核酸可以具有规定程度的序列一致性，例如如使用序列比对工具(例如BLAST、ALIGN和CLUSTAL)测定(参看下文)。举例来说，变异蛋白质或核酸与参考序列可以具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至99.5％氨基酸序列一致性。

如本文中所用，术语“回收”、“隔离”、“纯化”和“分离”可以指从至少一种组分移出的物质(例如蛋白质、肽、核酸、多核苷酸或细胞)，其与所述组分天然地相关。举例来说，这些术语可以指实质上或基本上不含如其天然状态下可见的通常伴随其的组分(例如完整生物系统)的物质。

如本文中所用，术语“重组”可以指已经由人操纵以使得其与如天然所见的核酸、多肽和细胞不相同的核酸序列或多核苷酸、多肽或蛋白质以及基于其的细胞。重组还可以指已经被修饰以改变其序列或表达特征(例如通过使编码序列突变以制造改变的多肽、使编码序列与另一编码序列或基因融合、在不同启动子控制下放置基因、使基因在异源生物体中表达、使基因以降低或提升的水平表达、使基因有条件地或组成性地以不同于其天然表达谱的方式表达等)的遗传物质(例如核酸序列或多核苷酸、其编码的多肽或蛋白质以及包含所述核酸序列或多核苷酸的载体和细胞)。

如本文中所用，术语“选择性标记”或“可选择标记”可以指能够表达于宿主细胞中的基因，其提供那些含有引入的核酸序列、多核苷酸或载体的宿主的选择便利性。可选择标记的实例包括(但不限于)抗微生物物质(例如潮霉素、博莱霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势(例如营养优势)的基因。

如本文中所用，术语“实质上类似”和”实质上一致”在至少两个核酸、多核苷酸、蛋白质或多肽的情形下，可以意指核酸、多核苷酸、蛋白质或多肽包含与参考(例如野生型)核酸、多核苷酸、蛋白质或多肽相比具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至99.5％序列一致性的序列。序列一致性可以使用已知程序(例如BLAST、ALIGN和CLUSTAL)使用标准参数测定。(参看例如阿特休尔(Altshul)等人(1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215:403-410；亨尼科夫(Henikoff)等人(1989)国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)89:10915；卡林(Karin)等人(1993)国家科学院院刊90:5873；和希金斯(Higgins)等人(1988)基因(Gene)73:237)。可在国家生物技术信息中心(theNational Center for Biotechnology Information)公开获得用于执行BLAST分析的软件。此外，可以使用FASTA搜寻数据库(珀森(Person)等人(1988)国家科学院院刊85:2444-2448)。在一些实施例中，实质上一致多肽不同之处仅是一或多个保守氨基酸取代。在一些实施例中，实质上一致多肽是可免疫交叉反应的。在一些实施例中，实质上一致核酸分子在严格条件下(例如在一系列高严格性的培养基内)彼此杂交。

如本文中所用，术语“转染”或“转型”可以指将外源核酸或多核苷酸插入到宿主细胞中。外源核酸或多核苷酸可以维持为非整合载体(例如质粒)形式，或者，可以整合到宿主细胞基因组中。术语转染(transfecting或transfection)旨在涵盖用于将核酸或多核苷酸引入到宿主细胞中的所有常规技术。转染技术的实例包括(但不限于)磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂质体转染、电穿孔和显微注射。

如本文中所用，术语“转型”、“稳定转型”和“转基因”可以指具有非天然(例如异源)核酸序列或多核苷酸序列整合到其基因组中或为游离型质粒形式维持多代的细胞。

如本文中所用，术语“载体”可以指经设计以将核酸引入到一或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、单链和双链盒等。

如本文中所用，术语“野生型”、“天然”或“天然存在的”蛋白质可以指天然所见的那些蛋白质。术语野生型序列是指天然所见或天然存在的氨基酸或核酸序列。在一些实施例中，野生型序列是蛋白质工程化计划(例如制造变异蛋白质)的起点。

除非另作定义，否则在本文中，本文中所用的所有技术与科学术语都具有如本发明所属的本领域的普通技术人员通常理解的相同含义。辛格尔顿(Singleton)等人,微生物学与分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology),第二版,约翰威利父子公司(John Wiley and Sons),纽约(New York)(1994)和黑尔&马卡姆(Hale&Markham),哈珀柯林斯生物学词典(The Harper Collins Dictionary of Biology),哈珀永久公司(Harper Perennial),纽约(1991)给技术人员提供本发明中所用的许多术语的通用词典。此外，应理解本文中路径中的任一者中揭示的底物中的任一者可以或者包括底物的阴离子或阳离子。

本文中提供的数值范围包括界定所述范围的数目。

除非另外说明，否则对应地，核酸序列以5'到3'定向左到右地书写；氨基酸序列以氨基到羧基定向左到右地书写。

虽然本发明能够以各种形式形式体现，但以下对几个实施例的描述在以下理解下进行：本发明应视为本发明的例证，并且不旨在将本发明限于说明的具体实施例。标题仅为了方便起见而提供并且不应视为以任何方式限制本发明。任何标题下说明的实施例都可以与任何其它标题下说明的实施例组合。

除非另外明确指示，否则本申请案中规定的各个数量值中的数值的使用陈述为仿佛所述范围内的最小和最大值前面都有词语“约”的近似值。此外，本发明的范围预期为连续范围，包括所述最小与最大值之间的每个值以及可以通过所述值形成的任何范围。本文中还揭示可以通过用揭示的数值除任何其它揭示的数值而形成的任何和所有比率(和任何所述比率的范围)。因此，技术人员应理解，许多所述比率、范围和比率范围可以明确衍生自本文中呈现的数值，并且在所有情况下，所述比率、范围和比率范围都表示本发明的各个实施例。

微生物的修饰

微生物可以通过本领域中已知的任何方法修饰(例如遗传工程化)以包含和/或表达(例如包括过表达)一或多种编码一或多种路径中能够将可发酵碳源转化为丁二烯的酶的多核苷酸(例如异源多核苷酸和/或非异源多核苷酸)。微生物可以天然地表达一或多种路径中将可发酵碳源转化为丁二烯所需的全部酶，或可以被修饰以表达(包括例如过表达)一或多种路径中的一或多种酶。在一些实施例中，微生物可以包含所述路径中的少于全部酶，并且编码缺少的酶的多核苷酸可以被遗传引入到微生物中。举例来说，被修饰的微生物可以被修饰以包含一或多种编码丁二烯制造路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向一或多种中间物(例如乙酰CoA和丙酰CoA；巴豆酰CoA；和/或甲酸)转化的酶的多核苷酸。另外或或者，被修饰的微生物可以被修饰以包含一或多种编码催化一或多种中间物(例如乙酰CoA和丙酰CoA；巴豆酰CoA；和/或甲酸)向丁二烯转化的酶的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸可以编码丁二烯制造路径中催化一或多种中间物转化的酶。在一些实施例中，多核苷酸可以被修饰(例如遗传工程化)以调节(例如增大或减小)编码的酶的底物特异性，或多核苷酸可以被修饰以改变编码的酶的底物特异性(例如编码对一底物具有特异性的酶的多核苷酸可以被修饰以使得酶对另一底物具有特异性)。优选的微生物可以包含编码如表1-3和图1-3中的任一者中陈列的酶的多核苷酸。

微生物可以包含一或多种编码路径中催化乙酰CoA和丙酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸。在一些实施例中，一或多种编码路径中催化乙酰CoA和丙酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸可以包括(但不限于)：

-一或多种编码路径中催化乙酰CoA和丙酰CoA向酮戊酰CoA转化的酶(例如硫解酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化酮戊酰CoA向(R)或(S)3-羟基戊酰CoA转化的酶(例如羟基戊酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化(R)或(S)羟基戊酰CoA向2-戊烯酰CoA转化的酶(例如羟基戊酰CoA脱水酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化2-戊烯酰CoA向2-戊烯酸转化的酶(例如戊烯酰CoA水解酶或转移酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化2-戊烯酸向丁二烯转化的酶(例如2-戊烯酸脱羧酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化2-戊烯酸向4-戊烯酸转化的酶(例如移位C＝C键异构酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化4-戊烯酸向丁二烯转化的酶(例如4-戊烯酸脱羧酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化2-戊烯酰CoA向戊-2,4-二烯酰CoA转化的酶(例如戊烯酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化戊-2,4-二烯酰CoA向戊-2,4-二烯酸转化的酶(例如戊-2,4-二烯酰CoA水解酶或转移酶)的多核苷酸；和/或

-一或多种编码路径中催化2,4-戊烯酸向丁二烯转化的酶(例如戊-2,4-二烯酸脱羧酶)的多核苷酸。

在一些实施例中，微生物进一步包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向甲基丙二酰CoA和/或丙烯酰CoA转化的酶的多核苷酸。

在一些实施例中，提供一种微生物，其包含一或多种以上多核苷酸，包括所有的以上多核苷酸。

将乙酰CoA和丙酰CoA转化为丁二烯的例示性酶以及其作用的底物和其制造的产物呈现于下表1中。表1中表示的酶编号与图1中所用的酶编号有关，所述图示意地表示可发酵碳源经由乙酰CoA和丙酰CoA中间物向丁二烯的酶促转化。

表1：经由乙酰CoA和丙酰CoA中间物制造丁二烯.

微生物可以包含一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸。在一些实施例中，一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸可以包括(但不限于)：

-一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向巴豆醇转化的酶(例如巴豆酰CoA还原酶(双官能))的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向巴豆醛转化的酶(例如巴豆醛脱氢酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化巴豆醛向巴豆醇转化的酶(例如巴豆醇脱氢酶)的多核苷酸；和/或

-一或多种编码路径中催化巴豆醇向丁二烯转化的酶(例如巴豆醇脱水酶)的多核苷酸。

在一些实施例中，提供一种微生物，其包含一或多种以上多核苷酸，包括所有的以上多核苷酸。

在优选实施例中，微生物进一步包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向巴豆酰CoA转化的酶的多核苷酸。

在一些实施例中，微生物可以进一步包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向3-羟基丁酰CoA和/或4-羟基丁酰CoA转化的酶的多核苷酸。在所述实施例中，微生物进一步包含一或多种编码路径中催化3-羟基丁酰CoA向巴豆酰CoA转化的酶的多核苷酸和/或一或多种编码路径中催化4-羟基丁酰CoA向巴豆酰CoA转化的酶的多核苷酸。

将巴豆酰CoA转化为丁二烯的例示性酶以及其作用的底物和其制造的产物呈现于下表2中。表2中表示的酶编号与图2中所用的酶编号有关，所述图示意地表示可发酵碳源经由巴豆酰CoA中间物向丁二烯的酶促转化。

表2：经由巴豆酰CoA中间物制造丁二烯.

微生物可以包含一或多种编码路径中催化甲酸向丁二烯转化的酶的多核苷酸。在一些实施例中，一或多种编码路径中催化甲酸向丁二烯转化的酶的多核苷酸可以包括(但不限于)：

-一或多种编码路径中催化CO

-一或多种编码路径中催化丙酮酸酯和CoA向乙酰CoA和甲酸转化的酶(例如乙酰CoA:甲酸C-乙酰转移酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化甲酸向甲酰CoA转化的酶(例如甲酰CoA转移酶或合成酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化2乙酰CoA向乙酰乙酰CoA转化的酶(例如乙酰乙酰COA硫解酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化乙酰乙酰CoA和甲酰CoA向3,5-酮戊酰CoA转化的酶(例如3,5-酮戊酰CoA硫解酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化3,5-酮戊酰CoA向(R)或(S)-5-羟基-3-酮戊酰CoA转化的酶(例如3,5-酮戊酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化(R)或(S)-5-羟基-3-酮戊酰CoA向(R)或(S)-3,5-二羟基戊酰CoA转化的酶(例如5-羟基-3-酮戊酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化(R)或(S)-3,5-二羟基戊酰CoA向(R)或(S)3-羟基-4-戊烯酰CoA转化的酶(例如3,5-羟基戊酰CoA脱水酶)的多核苷酸；

-一或多种编码路径中催化(R)或(S)-3-羟基-4-戊烯酰CoA向3-羟基-4-戊烯酸转化的酶(例如3-羟基-4-戊烯酰CoA水解酶、转移酶或合成酶)的多核苷酸；和/或

-一或多种编码路径中催化3-羟基-4-戊烯酸向丁二烯转化的酶(例如3-羟基-4-戊烯酸脱羧酶)的多核苷酸。

在一些实施例中，微生物进一步包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向丙酮酸酯转化的酶的多核苷酸。

在一些实施例中，提供一种微生物，其包含一或多种以上多核苷酸，包括所有的以上多核苷酸。

将甲酸转化为丁二烯的例示性酶以及其作用的底物和其制造的产物呈现于下表3中。表3中表示的酶编号与图3中所用的酶编号有关，所述图示意地表示可发酵碳源经由甲酸中间物向丁二烯的酶促转化。

表3：经由甲酸中间物制造丁二烯.

还提供一种微生物，其包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源向乙酰CoA和丙酰CoA转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化乙酰CoA和丙酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸，其包括(但不限于)：一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向丙酮酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向甲基丙二酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化甲基丙二酰CoA向丙酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向丙烯酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙烯酰CoA向丙酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙酰CoA和丙酰CoA向酮戊酰CoA转化的酶(例如硫解酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化酮戊酰CoA向(R)或(S)3-羟基戊酰CoA转化的酶(例如羟基戊酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化(R)或(S)3-羟基戊酰CoA向2-戊烯酰CoA转化的酶(例如羟基戊酰CoA脱水酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化2-戊烯酰CoA向2-戊烯酸转化的酶(例如戊烯酰CoA水解酶、戊烯酰CoA转移酶或戊烯酰CoA合成酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化2-戊烯酸向4-戊烯酸转化的酶(例如移位C＝C键异构酶)的多核苷酸；和/或一或多种编码路径中催化4-戊烯酸向丁二烯转化的酶(例如4-戊烯酸脂肪酸脱羧酶或2-戊烯酸脱羧酶)的多核苷酸。在一些实施例中，提供一种微生物，其包含一或多种以上多核苷酸，包括所有的以上多核苷酸。

还提供一种微生物，其包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源向乙基-丙二酰CoA转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化乙基-丙二酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸，其包括(但不限于)：一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向丙酮酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向乙酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙酰CoA向乙酰乙酰CoA转化的酶(例如乙酰乙酰COA硫解酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙酰乙酰CoA向3-羟基丁酰CoA转化的酶(例如3-羟基丁酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化3-羟基丁酰CoA向巴豆酰CoA转化的酶(例如巴豆酸酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向乙基-丙二酰CoA转化的酶(例如巴豆酰CoA羧化酶/还原酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向丁酸转化的酶(例如丁酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丁酸向乙基-丙二酰CoA转化的酶(例如丁酰CoA:二氧化碳连接酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙基-丙二酰CoA向2-(甲醛)丁酸转化的酶(例如乙基-丙二酰CoA还原酶(形成醛))的多核苷酸；一或多种编码路径中催化2-(甲醛)丁酸向2-(羟甲基)丁酸转化的酶(例如2-(甲酰基)丁酸还原酶(形成醇))的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙基丙二酰CoA向2-(羟甲基)丁酸转化的酶(例如乙基-丙二酰CoA还原酶(形成醇))的多核苷酸；一或多种编码路径中催化2-(羟甲基)丁酸向2-(磷烷氧基甲基)丁酸转化的酶(例如2-(羟甲基)丁酸激酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化2-(磷烷氧基甲基)丁酸向2-(二磷烷氧基甲基)丁酸转化的酶(例如2-(磷烷氧基甲基)丁酸激酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化2-(二磷烷氧基甲基)丁酸向[(E)-丁-2-烯氧基]-磷烷基-膦转化的酶(例如2-(二磷烷氧基甲基)丁酸脱羧酶)的多核苷酸；和/或一或多种编码路径中催化[(E)-丁-2-烯氧基]-磷烷基-膦向丁二烯转化的酶(例如丁二烯合成酶)的多核苷酸。在一些实施例中，提供一种微生物，其包含一或多种以上多核苷酸，包括所有的以上多核苷酸。

还提供一种微生物，其包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源向4-羟基丁酰CoA和3-羟基丁酰CoA转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化4-羟基丁酰CoA和3-羟基丁酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸，其包括(但不限于)：一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向PEP转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化PEP向草酰乙酸酯转化的酶(例如PEP羧激酶或PEP羧化酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化PEP向丙酮酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向乙酰CoA(例如丙酮酸脱氢酶或丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶)或草酰乙酸酯(例如PEP羧激酶或PEP羧化酶)转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙酰CoA向乙酰乙酰CoA转化的酶(例如乙酰乙酰CoA硫解酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙酰乙酰CoA向3-羟基丁酰CoA转化的酶(例如3-羟基丁酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化草酰乙酸酯向苹果酸酯转化的酶(例如苹果酸脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化苹果酸酯向富马酸酯转化的酶(例如富马酸酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化富马酸酯向琥珀酸酯转化的酶(例如富马酸还原酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化琥珀酸酯向琥珀酰CoA转化的酶(例如琥珀酰CoA转移酶或琥珀酰CoA合成酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化琥珀酰CoA向琥珀酰半醛转化的酶(例如琥珀酰CoA还原酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化琥珀酰半醛向4-羟基丁酸酯转化的酶(例如4-羟基丁酸脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化琥珀酸酯向4-羟基丁酸酯转化的酶(例如琥珀酸还原酶、磷酸泛酰巯基乙胺化酶或4-羟基丁酸脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化4-羟基丁酸酯向4-羟基丁酰CoA转化的酶(例如4-羟基丁酰CoA转移酶或4-羟基丁酰CoA合成酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化4-羟基丁酰CoA向巴豆酰CoA转化的酶(例如4-羟基丁酰CoA脱水酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化3-羟基丁酰CoA向巴豆酰CoA转化的酶(例如巴豆酸酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向巴豆醛转化的酶(例如巴豆醛脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化巴豆醛向巴豆醇转化的酶(例如醇脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向巴豆醇转化的酶(例如巴豆酰CoA还原酶(双官能))的多核苷酸；和/或一或多种编码路径中催化巴豆醇向丁二烯转化的酶(例如巴豆醇脱水酶)的多核苷酸。在一些实施例中，提供一种微生物，其包含一或多种以上多核苷酸，包括所有的以上多核苷酸。

还提供一种微生物，其包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源向丙烯酰CoA和乙酰CoA转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化丙烯酰CoA和乙酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸，其包括(但不限于)：一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向丙酮酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向乳酸酯转化的酶(例如乳酸脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乳酸酯向乳酰CoA转化的酶(例如乳酰CoA转移酶或合成酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乳酰CoA向丙烯酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向乙酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙烯酰CoA和乙酰CoA向3-酮基-4-戊烯酰CoA转化的酶(例如硫解酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化3-酮基-4-戊烯酰CoA向(R)或(S)3-羟基-4-戊烯酰CoA转化的酶(例如3-酮基-4-戊烯酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化(R)或(S)3-羟基-4-戊烯酰CoA向3-羟基-4-戊烯酸转化的酶(例如3-羟基-4-戊烯酰CoA转移酶、水解酶或合成酶)的多核苷酸；和/或一或多种编码路径中催化3-羟基-4-戊烯酸向丁二烯转化的酶(例如3-羟基-4-戊烯酸脱羧酶)的多核苷酸。在一些实施例中，提供一种微生物，其包含一或多种以上多核苷酸，包括所有的以上多核苷酸。

还提供一种微生物，其包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向乙酰CoA和3-羟基丙酰CoA转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化乙酰CoA和3-羟基丙酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸，其包括(但不限于)：一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向丙酮酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向乳酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乳酸酯向乳酰CoA转化的酶(例如乳酰CoA转移酶或合成酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乳酰CoA向丙烯酰CoA转化的酶(例如乳酰CoA脱水酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙烯酰CoA向3-羟基丙酰CoA转化的酶(例如丙烯酰CoA水合酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向3-羟基丙酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化3-羟基丙酸酯向3-羟基丙酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙酰CoA和3-羟基丙酰CoA向5-羟基-3-酮戊酰CoA转化的酶(例如硫解酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化5-羟基-3-酮戊酰CoA向(R)或(S)3,5-二羟基-戊酰CoA转化的酶(例如5-羟基-3-酮戊酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化(R)或(S)3,5-二羟基-戊酰CoA向(R)或(S)3-羟基-4-戊烯酰CoA转化的酶(例如3,5-羟基戊酰CoA脱水酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化(R)或(S)3-羟基-4-戊烯酰CoA向3-羟基-4-戊烯酸转化的酶(例如3-羟基-4-戊烯酰CoA水解酶、转移酶或合成酶)的多核苷酸；和/或一或多种编码路径中催化3-羟基-4-戊烯酸向丁二烯转化的酶(例如3-羟基-4-戊烯酸脱羧酶)的多核苷酸。在一些实施例中，提供一种微生物，其包含一或多种以上多核苷酸，包括所有的以上多核苷酸。

还提供一种微生物，其包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向乙酰乙酰CoA和甲酰CoA转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化乙酰乙酰CoA和甲酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸，其包括(但不限于)：一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向丙酮酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向乙酰CoA和甲酸酯转化的酶(例如丙酮酸甲酸裂解酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙酰CoA向乙酰乙酰CoA转化的酶(例如硫解酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化CO

还提供一种微生物，其包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向乙酰CoA和3-羟基丙酰CoA转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化乙酰CoA和3-羟基丙酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸，其包括(但不限于)：一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向丙酮酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向丙烯酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙烯酰CoA向3-羟基丙酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向3-羟基丙酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化3-羟基丙酸酯向3-羟基丙酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙酰CoA和3-羟基丙酰CoA向5-羟基-3-酮戊酰CoA转化的酶(例如硫解酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化5-羟基-3-酮戊酰CoA向(R)或(S)3,5-二羟基-戊酰CoA转化的酶(例如5-羟基-3-酮戊酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化(R)或(S)3,5-二羟基-戊酰CoA向3,5-羟基戊酸转化的酶(例如3,5-羟基戊酸激酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化3,5-羟基戊酸向3,5-羟基戊酸磷酸酯转化的酶(例如3,5-羟基戊酸激酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化3,5-羟基戊酸磷酸酯向3,5-羟基戊酸二磷酸酯转化的酶(例如3,5-羟基戊酸磷酸激酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化3,5-羟基戊酸二磷酸酯向1-丁烯基-4-二磷酸酯转化的酶(例如羟基戊酸二磷酸脱羧酶)的多核苷酸；和/或一或多种编码路径中催化1-丁烯基-4-二磷酸酯向丁二烯转化的酶(例如丁二烯合成酶)的多核苷酸。在一些实施例中，提供一种微生物，其包含一或多种以上多核苷酸，包括所有的以上多核苷酸。

还提供一种微生物，其包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向乙基-丙二酰CoA转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化乙基-丙二酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸，其包括(但不限于)：一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向丙酮酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向乙酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙酰CoA向乙酰乙酰CoA转化的酶(例如乙酰乙酰CoA硫解酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙酰乙酰CoA向3-羟基丁酰CoA转化的酶(例如3-羟基丁酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化3-羟基丁酰CoA向巴豆酰CoA转化的酶(例如巴豆酸酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向乙基-丙二酰CoA转化的酶(例如巴豆酰CoA羧化酶/还原酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向丁酸转化的酶(例如丁酰CoA脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丁酸向乙基-丙二酰CoA转化的酶(例如丁酰CoA:二氧化碳连接酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乙基-丙二酰CoA向2-羟甲基-丁酸转化的酶(例如乙基-丙二酰CoA还原酶、醇脱氢酶或醛脱氢酶))的多核苷酸；一或多种编码路径中催化2-羟甲基-丁酸向2-丁烯基4-二磷酸酯转化的酶(例如2-羟甲基-丁酸激酶、羟甲基丁酸-磷酸激酶或2-羟甲基丁酸-二磷酸脱羧酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化2-羟甲基-丁酸向2-丁烯基4-磷酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化2-丁烯基4-磷酸酯向丁二烯转化的酶的多核苷酸；和/或一或多种编码路径中催化2-丁烯基4-二磷酸酯向丁二烯转化的酶(例如丁二烯合成酶)的多核苷酸。在一些实施例中，提供一种微生物，其包含一或多种以上多核苷酸，包括所有的以上多核苷酸。

还提供一种微生物，其包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向乳酸酯和乙酰CoA和草乙酸酯转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化乳酸酯和乙酰CoA和草乙酸酯向丁二烯转化的酶的多核苷酸，其包括(但不限于)：一或多种编码路径中催化可发酵碳源(例如葡萄糖)向PEP转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化PEP向丙酮酸酯转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酮酸酯向乙酰CoA转化的酶的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乳酸酯向乳酰CoA转化的酶(例如乳酸CoA转移酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化乳酰CoA向丙烯酰CoA转化的酶(例如乳酰CoA脱水酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙烯酰CoA向丙酰CoA转化的酶(例如丙烯酰CoA氧化还原酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化丙酰CoA向酮戊酰CoA转化的酶(例如硫解酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化酮戊酰CoA向2-戊烯酰CoA转化的酶(例如酮戊酰CoA脱水酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化2-戊烯酰CoA向2-戊烯酸转化的酶(例如戊烯酰CoA水解酶、转移酶或合成酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化2戊烯酸向丁二烯转化的酶(例如4-戊烯酸脱羧酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化2-戊烯酸向4-戊烯酸转化的酶(例如移位C＝C键异构酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化4-戊烯酸向丁二烯转化的酶(例如4-戊烯酸脱羧酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化草乙酸酯向苹果酸酯转化的酶(例如苹果酸脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化苹果酸酯向富马酸酯转化的酶(例如富马酸酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化富马酸酯向琥珀酸酯转化的酶(例如富马酸还原酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化琥珀酸酯向琥珀酰CoA转化的酶(例如琥珀酰CoA转移酶合成酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化琥珀酰CoA向琥珀酸酯半醛转化的酶(例如琥珀酰CoA还原酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化琥珀酸酯半醛向4-羟基丁酸酯转化的酶(例如4-羟基丁酸脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化4-羟基丁酸酯向4-羟基丁酰CoA转化的酶(例如4-羟基丁酰CoA转移酶或4-羟基丁酰CoA合成酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化4-羟基丁酰CoA向巴豆酰CoA转化的酶(例如4-羟基丁酰CoA脱水酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向巴豆醛转化的酶(例如巴豆醛脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向巴豆醇转化的酶(例如巴豆酰CoA还原酶或双官能醇脱氢酶)的多核苷酸；一或多种编码路径中催化巴豆醛向巴豆醇转化的酶(例如醇脱氢酶)的多核苷酸；和/或一或多种编码路径中催化巴豆醇向丁二烯转化的酶(例如巴豆醇脱水酶)的多核苷酸。

本文中提供的微生物中的任一者可以任选地包含一或多种编码允许可发酵碳源向丁二烯氧化还原平衡转化的酶的多核苷酸。

微生物可以是古细菌、细菌或真核生物。在一些实施例中，细菌是丙酸杆菌属、丙酸螺菌属、梭菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、暗杆菌属或乳杆菌属，包括例如丙酸暗杆菌(Pelobacter propionicus)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、乳杆菌属、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacteriumacidipropionici)或费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)。在一些实施例中，真核生物是酵母、丝状真菌、原生动物或藻类。在一些实施例中，所述酵母是酿酒酵母、运动发酵单胞菌或巴斯德毕赤酵母。

在一些实施例中，本发明涵盖本文中提供的一或多种酶的修饰(例如工程化)。可以进行所述修饰以再设计酶的底物特异性和/或以修饰(例如降低)其针对其它底物的活性以便增加其对于既定底物的选择性。另外或或者，本文中提供的一或多种酶可以被工程化以改变(例如增强，包括例如增加其催化活性或其底物特异性)其一或多种性质。

酶中的任一者(例如编码酶的多核苷酸)可以通过本领域中已知的任何方法修饰(例如诱变化或多样化)以扩大或改变其底物特异性(例如将酶的底物特异性从一种底物变到另一底物)。所述方法包括(但不限于)EpPCR(普里查德(Pritchard)等人,理论生物学杂志(J.Theor.Biol.)234:497-509(2005))；易错滚环扩增(epRCA)(藤井(Fujii)等人,核酸研究(Nucleic Acids Res.)32:e145(2004)；和藤井等人,自然实验手册(Nat.Protoc.)1:2493-2497(2006))；DNA或家族改组(施特默尔(Stemmer),美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)91:10747-10751(1994)；和施特默尔,自然(Nature)370:389-391(1994))；交错延伸(StEP)(赵(Zhao)等人,自然生物技术(Nat.Biotechnol.)16:258-261(1998))；和/或随机引发重组(RPR)(邵(Shao)等人,核酸研究26:681-683(1998))。

用于诱变多核苷酸的其它例示性方法包括异双螺旋重组(沃尔科夫(Volkov)等人,核酸研究27:e18(1999)；和沃尔科夫等人,酶学方法(Methods Enzymol.)328:456-463(2000))；过渡模板随机嵌合(RACHITT)(科科(Coco)等人,自然生物技术19:354-359(2001))；截短模板重组延伸(RETT)(李(Lee)等人,分子催化杂志(J.Molec.Catalysis)26:119-129(2003))；简并寡核苷酸基因改组(DOGS)(伯奎斯特(Bergquist)和吉布斯(Gibbs),分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)352:191-204(2007)；伯奎斯特等人,生物分子工程学(Biomol.Eng.)22:63-72(2005)；吉布斯等人,基因271:13-20(2001))；用于杂交酶产生的增量截短(ITCHY)(奥斯特迈尔(Ostermeier)等人,美国国家科学院院刊96:3562-3567(1999)；和奥斯特迈尔等人,自然生物技术17:1205-1209(1999))；用于杂交酶产生的硫代增量截短(THIO-ITCHY)(卢茨(Lutz)等人,核酸研究29:E16(2001))；SCRATCHY(卢茨等人,美国国家科学院院刊98:11248-11253(2001))；随机漂变诱变(RNDM)(伯奎斯特等人,生物分子工程学22:63-72(2005))；序列饱和诱变(SeSaM)(王(Wong)等人,生物技术杂志(Biotechnol.J.)3:74-82(2008)；王等人,核酸研究32:e26(2004)；和王等人,分析生物化学(Anal.Biochem.)341:187-189(2005))；合成改组(内斯(Ness)等人,自然生物技术20:1251-1255(2002))；核苷酸交换与切除技术NexT(穆勒(Muller)等人,核酸研究33:e117(2005))。其它例示性方法包括序列同源性非依赖性蛋白质重组(SHIPREC)(西贝尔(Sieber)等人,自然生物技术19:456-460(2001))；Gene Site Saturation Mutagenesis

在一些实施例中，蛋白质的序列比对和比较模型化可以用以改变一或多种本文中揭示的酶。同源性模型化或比较模型化是指从所要蛋白质的一级氨基酸序列构建其原子级分辨率模型和类似蛋白质的实验三维结构。此模型可以允许酶底物结合位点得以界定并且鉴别可以置换为其它天然氨基酸以便再设计其底物特异性的具体氨基酸位置。

与编码如本文中揭示的酶的多核苷酸具有实质一致性或同源性的变异体或序列可以用于实践本发明。所述序列可以称为变异体或被修饰的序列。就是说，多核苷酸序列可以被修饰然而仍维持编码展现所要活性的多肽的能力。所述变异体或被修饰的序列因此是等效物。一般来说，变异体或被修饰的序列可以包含与原生序列相比至少约40％-60％、优选地约60％-80％、更优选地约80％-90％并且甚至更优选地约90％-95％序列一致性。

在一些实施例中，微生物可以被修饰以表达(包括例如过表达)一或多种如本文中提供的酶。微生物可以通过遗传工程化技术(即重组技术)、传统微生物技术或所述技术的组合来修饰，并且还可以包括天然存在的基因变异体以制造被遗传修饰的微生物。一些所述技术一般揭示于例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人,1989,分子克隆：实验手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LabsPress)中。

微生物可以包括如下微生物，其中多核苷酸已经被插入、缺失或修饰(即突变；例如通过插入、缺失、取代和/或反转核苷酸)，以这种方式使得所述修饰提供一或多种如本文中提供的酶在微生物内的所要表达(例如过表达)作用。导致基因表达或功能增加的遗传修饰可以称为基因的扩增、过量产生、过表达、活化、增强、添加或上调。添加克隆的基因以增加基因表达可以包括将克隆的基因维持在复制质粒上或将克隆的基因整合到制造生物体的基因组中。此外，增加所要克隆的基因的表达可以包括使克隆的基因可操作地连接于天然或异源转录控制元件。

必要时，一或多种本文中提供的酶的表达在调节序列的控制下，所述调节序列在发酵反应期间以时间依赖性方式直接或间接控制酶的表达。

在一些实施例中，微生物用遗传媒介物转型或转染，所述遗传媒介物例如包含编码本文中提供的酶的外源多核苷酸序列的表达载体。

制备用于引入到原核或真核宿主中的多核苷酸构建体可以典型地(但并不总是)包含由宿主识别的复制系统(即载体)，包括编码所要多肽的预期多核苷酸片段，并且可以优选地(但不必须)还包括可操作地连接于多肽编码区段的转录和翻译起始调节序列。表达系统(表达载体)可以包括例如复制起点或自主复制序列(ARS)和表达控制序列、启动子、增强子和必需加工信息位点(例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点)、转录终止序列、mRNA稳定化序列、与宿主染色体DNA同源的核苷酸序列和/或多克隆位点。适当时还可以包括优选地来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号肽，其允许蛋白质穿过和/或固留在细胞膜中或由细胞分泌。

载体可以使用标准方法构建(参看例如萨姆布鲁克等人,分子生物学：实验手册,冷泉港,纽约州(N.Y.)1989；和奥苏贝尔(Ausubel)等人,当前分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology),格林出版公司(Greene Publishing,Co.)纽约州,1995)。

包括编码一或多种本文中揭示的酶的多核苷酸的本发明多核苷酸的操纵典型地在重组载体中进行。众多载体可公开获得，包括细菌质粒、噬菌体、人造染色体、游离型载体和基因表达载体，其全部能够使用。根据本发明有用的载体可经选择以适应具有所要大小的蛋白质编码序列。适合的宿主细胞在体外克隆操纵之后用载体转化。宿主细胞可以是原核的，例如许多细菌株中的任一者；或可以是真核的，例如酵母或其它真菌细胞、昆虫或两栖动物细胞、或哺乳动物细胞，包括例如啮齿动物、猿或人类细胞。每个载体含有各种功能性组分，其一般包括克隆位点、复制起点和至少一个可选择标记基因。如果既定载体是表达载体，那么它另外具有以下中的一或多者：增强子元件、启动子、转录终止和信号序列，各自定位在克隆位点附近，以使得其可操作地连接到根据本发明编码多肽文库成员的基因。

载体(包括克隆和表达载体)可以含有使得载体能够在一或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。举例来说，序列可以是使得载体能够独立于宿主染色体DNA而复制的序列，并且可以包括复制起点或自主复制序列。所述序列熟知用于多种细菌、酵母和病毒。举例来说，来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性(Gram-negative)细菌，2微米质粒起点适用于酵母，并且各种病毒起点(例如SV 40，腺病毒)适用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般来说，复制起点不为哺乳动物表达载体所需，除非其用于能够复制高水平的DNA的哺乳动物细胞(例如COS细胞)中。

克隆或表达载体可以含有也称为可选择标记的选择基因。此基因编码为在选择性培养基中生长的经转化宿主细胞存活或生长所需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞因此将不能在培养基中存活。典型选择基因编码赋予对抗生素和其它毒素(例如安比西林、新霉素、甲氨喋呤、潮霉素、硫链丝菌素、安普霉素或四环素)的抗性、补充营养缺陷型不足或供应生长培养基中不可获得的关键营养素的蛋白质。

载体的复制可以在大肠杆菌(例如菌株TB1或TG1、DH5α、DH10β、JM110)中进行。可以使用大肠杆菌可选择标记，例如赋予对抗生素安比西林的抗性的β-内酰胺酶基因。这些可选择标记可以获自大肠杆菌质粒(例如pBR322)或pUC质粒(例如pUC18或pUC19或pUC119)。

表达载体可以含有由宿主生物体识别的启动子。启动子可以可操作地连接于所关注的编码序列。这种启动子可以是诱导性或组成性的。多核苷酸当多核苷酸呈允许其以其预期方式起作用的关系时可操作地连接。

适合在原核宿主情况下使用的启动子可以包括例如α-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、红霉素启动子、安普霉素启动子、潮霉素启动子、次甲霉素启动子和杂交启动子(例如tac启动子)。此外，可以使用宿主组成性或诱导性启动子。用于细菌系统的启动子一般也将含有可操作地连接于编码序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列。

获自病毒基因组的病毒启动子包括来自以下的启动子：多形瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2或5)、单纯疱疹病毒(胸苷激酶启动子)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒(例如MoMLV或RSV LTR)、B型肝炎病毒、骨髓增生肉瘤病毒启动子(MPSV)、VISNA和猿猴病毒40(SV40)。异源哺乳动物启动子包括例如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克蛋白启动子。

SV40病毒的早期和晚期启动子宜以还含有SV40病毒复制起点的限制性片断形式获得(参看例如菲尔斯(Fiers)等人,自然,273:113(1978)；马利根(Mulligan)和伯格(Berg),科学,209:1422-1427(1980)；和帕夫拉基斯(Pavlakis)等人,美国国家科学院院刊,78:7398-7402(1981))。人类巨细胞病毒(CMV)的即刻早期启动子宜以Hind III E限制性片断形式获得(参看例如格里纳韦(Greenaway)等人,基因,18:355-360(1982))。广泛宿主范围启动子(例如SV40早期启动子或劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)LTR)适用于本发明表达载体中。

一般来说，强启动子可以用以提供所要产物的高水平转录和表达。已经被鉴别为用于高水平表达的强启动子的真核启动子中有SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列和人类巨细胞病毒即刻早期启动子(CMV或CMV IE)。在一实施例中，启动子是SV40或CMV早期启动子。

所用启动子可以是组成性的或可调节的，例如诱导性的。例示性诱导性启动子包括jun、fos和金属硫蛋白和热休克启动子。转录单位的一个或两个启动子可以是诱导性启动子。在一实施例中，GFP由组成性启动子表达，而诱导性启动子驱动编码一或多种如本文中揭示的酶的基因和/或可扩增可选择标记的转录。

高等真核生物中的转录调节区可以包含增强子序列。许多来自哺乳动物基因的增强子序列已知例如来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素基因。适合的增强子是来自真核细胞病毒的增强子。实例包括在复制起点晚期的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒即刻早期启动子的增强子(波沙特(Boshart)等人细胞(Cell)41:521(1985))、在复制起点晚期的多形瘤增强子和腺病毒增强子(还参看例如关于用于活化真核启动子的增强元件的雅尼夫(Yaniv),自然,297:17-18(1982))。增强子序列可以在所关注基因的位置5'或3'处引入到载体中，但优选地位于启动子的5'位点。

酵母和哺乳动物表达载体可以含有促进载体在细菌中繁殖的原核序列。因此，载体可以具有其它组分，例如复制起点(例如使得载体能够在一或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列)、用于在细菌中选择的抗生素抗性基因和/或可以允许翻译以遍读密码子的琥珀终止密码子。可以并入其它真核可选择基因。一般来说，在克隆载体中，复制起点是使得载体能够独立于宿主染色体DNA而复制的复制起点，并且包括复制起点或自主复制序列。所述序列是熟知的，例如细菌中的ColE1复制起点。各种病毒起点(例如SV40、多形瘤、腺病毒、VSV或BPV)适用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般来说，真核复制子不为在哺乳动物细胞中表达所需，除非预期染色体外(游离型)复制(例如典型地可以使用SV40起点，只是因为它含有早期启动子)。

为了促进编码如本文中揭示的酶的不同基因从构建体和表达载体的插入和表达，构建体可以设计有至少一个克隆位点用于插入编码本文中揭示的任何酶的任何基因。克隆位点可以是多克隆位点，例如含有多个限制位点。

质粒可以在细菌宿主细胞中繁殖以制备DNA储备物用于亚克隆步骤或用于引入到真核宿主细胞中。真核宿主细胞的转染可以是由本领域中熟知的任何方法进行的任何转染。转染方法包括脂质体转染、电穿孔、磷酸钙共同沉淀、氯化铷或聚阳离子介导的转染、原生质体融合和显微注射。优选地，转染是稳定转染。提供最优转染频率和构建体在具体宿主细胞系和类型中的表达的转染方法是有利的。适合的方法可以通过常规程序确定。对于稳定转染子来说，构建体是整合的以便稳定维持在宿主染色体内。

载体可以通过为本领域的技术人员所知的许多适合方法中的任一者引入到所选宿主细胞中。举例来说，载体构建体可以通过用于质粒载体的许多转型方法中的任一者引入到适当细胞。举例来说，标准氯化钙介导的细菌转型仍常用以将裸DNA引入到细菌(参看例如萨姆布鲁克等人,1989,分子克隆：实验手册,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州)，但可以使用电穿孔和结合(参看例如奥苏贝尔等人,1988,当前分子生物学实验指南,约翰威利父子公司,纽约,纽约州)。

为了将载体构建体引入到酵母或其它真菌细胞，可以使用化学转型方法(例如罗斯(Rose)等人,1990,酵母遗传学方法(Methods in Yeast Genetics),冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州)。转型的细胞可以在适合于所用可选择标记的选择性培养基上分离。或者或另外，板或从板提起的过滤器可以针对GFP荧光进行扫描以鉴别转型的无性系。

为了将包含差异性地表达的序列的载体引入到哺乳动物细胞，所用方法可以取决于载体的形式。质粒载体可以通过许多转染方法中的任一者引入，所述方法包括例如脂质介导的转染(“脂质体转染”)、DEAE-右旋糖酐介导的转染、电穿孔或磷酸钙沉淀(参看例如奥苏贝尔等人,1988,当前分子生物学实验指南,约翰威利父子公司,纽约,纽约州)。

适用于多种转型的和非转型的或初级细胞的过渡转染的脂质体转染试剂和方法是广泛可获得的，使得脂质体转染成为将构建体引入到培养物中的真核并且具体地说哺乳动物细胞的有吸引力的方法。举例来说，可用LipofectAMINE

宿主细胞可能能够表达编码所要蛋白质的构建体、加工蛋白质并且将分泌的蛋白质输送到用于分泌的细胞表面。加工包括翻译同时和翻译后修饰，例如前导肽裂解、GPI连接、糖基化、泛素化和二硫键形成。经受转染和体外细胞培养并且具有遗传工程化中典型地所用的种类的永生化宿主细胞培养物是优选的。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转型的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人类胚肾系(适合于生长于悬浮培养物中的293或293衍生物，格雷厄姆(Graham)等人,普通病毒学杂志(J.Gen Virol.),36:59(1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；DHFR-中国仓鼠卵巢细胞(ATCC CRL-9096)；dp12.CHO细胞，CHO/DHFR-的衍生物(1989年3月15日公开的EP307,247)；小鼠塞尔托利细胞(TM4，马瑟(Mather),繁殖生物学(Biol.Reprod.),23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(马瑟等人,纽约科学院年报(Annals N.Y.Acad.Sci.),383:44-68(1982))；PEER人类急性成淋巴细胞细胞系(拉维德(Ravid)等人国际癌症杂志(Int.J.Cancer)25:705-710(1980))；MRC 5细胞；FS4细胞；人类肝肿瘤系(Hep G2)、人类HT1080细胞、KB细胞、JW-2细胞、Detroit 6细胞、NIH-3T3细胞、融合瘤和骨髓瘤细胞。用于产生转基因动物的胚细胞也是适合的(例如接合子和胚胎干细胞)。

适用于在载体中克隆或表达多核苷酸(例如DNA)的宿主细胞可以包括例如原核生物、酵母或高等真核生物细胞。适用于此目的的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性(Gram-positive)生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans))和志贺氏菌属(Shigella)以及芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公开的DD 266,710中揭示的地衣芽孢杆菌41P))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa))和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但其它菌株(例如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)、大肠杆菌JM110(ATCC 47,013)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325))是适合的。

除了原核生物之外，真核微生物(例如丝状真菌或酵母)可以是适用于包含编码一或多种酶的多核苷酸的载体的克隆或表达宿主。在低等真核宿主微生物之中，最常用酿酒酵母或常见面包酵母。然而，本文中通常可获得并且使用许多其它属、物种和菌株，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦提克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主(例如沟巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

当酶糖基化时，适用于表达的宿主细胞可以衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴别了众多杆状病毒株和变异体和来自例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)(蚕蛾)的宿主的相应受纳昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株是可公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变异体和家蚕NPV的Bm-5病毒株，并且所述病毒可以用作本文中根据本发明的病毒，具体地说用于转染草地贪夜蛾细胞。

棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、烟草、浮萍和其它植物细胞的植物细胞培养物也可以用作宿主细胞。

有用的哺乳动物宿主细胞的实例是中国仓鼠卵巢细胞，包括CHOK1细胞(ATCCCCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，乌尔劳布(Urlaub)等人,美国国家科学院院刊77:4216(1980))；由SV40转型的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人类胚肾系(被亚克隆用于生长于悬浮培养物中的293或293细胞(格雷厄姆等人,普通病毒学杂志36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞尔托利细胞(TM4，马瑟,繁殖生物学23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(马瑟等人,纽约科学院年报383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人类肝肿瘤系(Hep G2)。

宿主细胞用用于制造一或多种如本文中揭示的酶的上述表达或克隆载体或用编码一或多种如本文中揭示的酶的多核苷酸转型或转染，并且在适当时被修饰用于诱导启动子、选择转型体或扩增编码所要序列的基因的常规营养培养基中进行培养。

含有编码所揭示的酶的所要核酸序列的宿主细胞可以在多种培养基中进行培养。例如以下的市售培养基适用于培养宿主细胞：Ham's F10(西格玛(Sigma))、最低必需培养基((MEM)，西格玛)、RPMI-1640(西格玛)和达尔伯克氏改良伊格尔培养基((DMEM)，西格玛)。另外，哈姆(Ham)等人,酶学方法58:44,(1979)；巴尔内斯(Barnes)等人,分析生物化学102:255(1980)；美国专利第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；或第5,122,469号；WO90103430；WO 87/00195；或美国专利参考第30,985号中所述的培养基中的任一者可以用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一者可以视需要补充有激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN

多核苷酸和编码的酶

编码能够催化酶促转化的酶或其变异体(包括例如如表1-3或图1-3中的任一者中陈列的酶)的任何已知多核苷酸(例如基因)预期用于本发明。所述多核苷酸可以被修饰(例如遗传工程化)以调节(例如增大或减小)编码的酶的底物特异性，或多核苷酸可以被修饰以改变编码的酶的底物特异性(例如编码对一底物具有特异性的酶的多核苷酸可以被修饰以使得酶对一替代性底物具有特异性)。优选的微生物可以包含编码如表1-3和图1-3中的任一者中陈列的酶的多核苷酸。

在一些实施例中，微生物可以包含氧化还原酶，例如羟基戊酰CoA脱氢酶、巴豆酰CoA还原酶(双官能)、巴豆醛脱氢酶、巴豆醇脱氢酶、3,5-酮戊酰CoA脱氢酶或如SEQ ID NO:103-123中陈列的氧化还原酶。在一些实施例中，微生物可以包含转移酶，例如戊烯酰CoA转移酶、戊-2,4-二烯酰CoA转移酶、甲酰CoA转移酶、3-羟基-4-戊烯酰CoA转移酶或如SEQ IDNO:1-28中陈列的转移酶。在一些实施例中，微生物可以包含水解酶，例如戊烯酰CoA水解酶、戊-2,4-二烯酰CoA水解酶、3-羟基-4-戊烯酰CoA水解酶或如SEQ ID NO:29-33中陈列的水解酶。在一些实施例中，微生物可以包含CoA合成酶，例如甲酰CoA合成酶或如SEQ ID NO:34-36中陈列的CoA合成酶。在一些实施例中，微生物可以包含酮硫解酶，例如硫解酶、乙酰CoA:甲酸C-乙酰转移酶、乙酰乙酰CoA硫解酶、3,5-酮戊酰CoA硫解酶或如SEQ ID NO:58-78中陈列的酮硫解酶。在一些实施例中，微生物可以包含脱氢酶，例如戊烯酰CoA脱氢酶、甲酸脱氢酶或如SEQ ID NO:124-139中陈列的脱氢酶。在一些实施例中，微生物可以包含脱水酶，例如羟基戊酰CoA脱水酶、巴豆醇脱水酶、3,5-羟基戊酰CoA脱水酶或如SEQ ID NO:37-55中陈列的脱水酶。在一些实施例中，微生物可以包含异构酶，例如移位C＝C键异构酶或如SEQ ID NO:99-102中陈列的异构酶。在一些实施例中，微生物可以包含脱羧酶，例如2-戊烯酸脱羧酶、4-戊烯酸脱羧酶、戊-2,4-二烯酸脱羧酶、3-羟基-4-戊烯酸脱羧酶或如SEQ IDNO:79-98中陈列的脱羧酶。

图1-3中用于催化转化的酶在表4中由酶学委员会(Enzyme Commission，EC)编号、功能和图1-3中的其催化转化的步骤分类(表4)。

表4：所用酶的EC编号

图1的步骤D和I以及图3中的步骤C和I可以由EC 2.8.3中的转移酶(包括例如催化CoA部分从一个分子可逆转移到另一分子的转移酶)催化。编码CoA转移酶的任何已知多核苷酸(包括例如下表5中陈列的那些多核苷酸)预期用于本发明。

表5：编码EC 2.8.3中的酶的例示性基因

图1的步骤D和I以及图3的步骤I可以由EC 3.1.2中的水解酶(包括例如具有广泛底物范围、能够将2-戊烯酰CoA、2,4-戊烯酰CoA和3-羟基戊烯酰CoA水解为其相应酸的水解酶)催化。编码水解酶的任何已知多核苷酸(包括例如下表6中陈列的那些多核苷酸)预期用于本发明。

表6：编码EC 3.1.2中的酶的例示性基因.

图3中的步骤C可以由EC 6.2.1.中的CoA合成酶(包括例如具有广泛底物范围、能够将甲酸活化为甲酰CoA的CoA合成酶)催化。编码CoA合成酶的任何已知多核苷酸(包括例如下表7中陈列的那些多核苷酸)预期用于本发明。

表7：编码EC 6.2.1中的酶的例示性基因.

双键的水合可以由EC 4.2.1中的水合酶催化，并且形成双键的水移除可以由EC4.2.1中的脱水酶催化。水合酶有时是可逆的并且也可以催化脱水。同样，脱水酶有时是可逆的并且也可以催化水合。从既定底物添加或移除水为图1中的步骤C、图2中的步骤D和图3中的步骤H所需。编码水合酶或脱水酶的任何已知多核苷酸(包括例如下表7中陈列的那些多核苷酸)预期用于本发明。

表8：编码EC 4.2.1中的酶的例示性基因.

来自解芳烃卡斯特兰尼氏菌株65Phen的沉香醇脱水酶-异构酶催化β-香叶烯立体特异性水合为(3S)-沉香醇、(3S)-沉香醇异构化为香叶醇，并且参与单萜β-香叶烯的厌氧降解的初始步骤。另外，此沉香醇脱水酶-异构酶催化逆反应，即香叶醇异构化为沉香醇和沉香醇脱水为香叶烯。在此方面，从香叶醇形成香叶烯可以视为单萜醇的解毒过程。其它脱水酶-异构酶包括4-羟基丁酰CoA脱水酶/乙烯基乙酰CoA-Δ异构酶。脱水酶/异构酶可以通过标准方法工程化以接受巴豆醇作为底物，因此代表适用于以下图2中的这些步骤D的候选物：

表9：可以被工程化为巴豆醇脱水酶的例示性基因.

图1的步骤A以及图3的步骤C、D和E需要乙酰CoA或乙酰乙酰CoA与甲酰CoA或丙酰CoA缩合。这种缩合可以用EC 2.3.1中陈列的酮硫解酶催化。然而，编码酮硫解酶的任何已知多核苷酸(包括例如下表10中陈列的那些多核苷酸)预期用于本发明。

表10：编码EC 2.3.1中的酶的例示性基因.

图1中的步骤E、G和J以及图2中的步骤J可以由如EC类别4.1.1中陈列的脱羧酶催化。众多脱羧酶已经被表征并且展示可使结构上类似的底物脱羧为2-戊烯酸、2,4-戊二烯酸(图1)和3-羟基戊烯酸(图3)。用于图1的步骤J的例示性酶包括如EC 4.1.1.16中陈列的山梨酸脱羧酶和乌头酸脱羧酶。用于图1的步骤G和E的例示性酶可以包括来自咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)的p450脂肪酸脱羧酶。用于图3的步骤J的例示性酶可以包括如EC4.1.1.33中陈列的那些酶，例如二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。然而，编码脱羧酶的任何已知多核苷酸(包括例如下表11中陈列的那些多核苷酸)预期用于本发明。

表11：编码EC 4.1.1中的酶的例示性基因.

图1的步骤F涉及如EC 5.3.3中陈列的异构酶。用于所述步骤的例示性酶包括异戊烯基-二磷酸Δ异构酶。然而，编码异构酶的任何已知多核苷酸(包括例如下表12中陈列的那些多核苷酸)预期用于本发明。

表12：编码EC 5.3.3中的酶的例示性基因.

图1的步骤B、图2的步骤A、B和C、以及图3的步骤F和G涉及使酮还原为醇并且可以由EC类别1.1.1中的氧化还原酶催化。然而，编码氧化还原酶的任何已知多核苷酸(包括例如下表13中陈列的那些多核苷酸)预期用于本发明。

表13：编码EC 1.1.1中的酶的例示性基因.

图1的步骤I和图3的步骤A涉及如EC 1.3.1或1.2.99中陈列的脱氢酶。然而，编码脱氢酶的任何已知多核苷酸(包括例如下表14中陈列的那些多核苷酸)预期用于本发明。

表14：编码EC 1.3.1或1.2.99中的酶的例示性基因.

制造丁二烯的方法

丁二烯(例如发酵产物)可以通过使一或多种本文中提供的被遗传修饰的微生物与可发酵碳源接触来制造。所述方法优选地可以包含使可发酵碳源与微生物在发酵培养基中接触(包括在充分条件下和持续适合时间段)，所述微生物包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源向表1-3或图1-3中提供的中间物中的任一者转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化表1-3或图1-3中提供的一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸；和使一或多种编码路径中催化可发酵碳源向表1-3或图1-3中提供的一或多种中间物转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化表1-3或图1-3中提供的一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸在微生物中表达，以制造丁二烯。在一些实施例中，可发酵碳源向丁二烯的转化是ATP阳性(例如每分子制造的丁二烯产生净ATP；产生ATP作为副产物)，并且当与NADH消耗路径组合时它可以提供丁二烯制造的厌氧工艺。举例来说，可发酵碳源(例如葡萄糖或果糖)向丁二烯的转化可以每一mol制造的丁二烯产生净的1mol ATP。

例示性可发酵碳源可以包括(但不限于)甘蔗汁、甘蔗糖蜜、水解淀粉、水解木质纤维素材料、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳酸酯、乳糖、木糖、丙酮酸酯或甘油，呈其任何形式或混合物形式。在一些实施例中，所述碳源是单糖、寡糖或多糖。

导致制造工业上重要化合物(例如丁二烯)的代谢路径涉及氧化还原(氧还)反应。举例来说，在发酵期间，葡萄糖在一系列酶促反应中氧化为较小分子，伴随有能量释放。释放的电子经由通用电子载体从一个反应转移到另一反应，所述电子载体例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD(P))，其充当氧化还原酶的辅因子。在微生物分解代谢中，葡萄糖由酶使用氧化形式的辅因子(NAD(P)+和/或NAD+)作为辅因子氧化，因此产生呈还原的辅因子形式的还原等效物(NAD(P)H和NADH)。为了使发酵持续，需要氧还平衡的代谢，即辅因子必须通过使微生物细胞代谢化合物还原而再生。在某一实施例中，本文中揭示的新颖路径由于其提供可发酵碳源经由将终点产物再分布以达到氧还平衡的路径向丁二烯的转化而是有利的。

通过一或多种如本文中揭示的被修饰的微生物使可发酵碳源有效发酵的一些关键参数包括：使微生物生长到更大细胞密度的能力、增加的所要产物产率、增加的容积生产率量、移除不期望的共代谢物、改进的对廉价碳和氮源的利用、调适以改变发酵器条件、增加的初级代谢产物产量、增加的次级代谢产物产量、增加的对酸性条件的耐受性、增加的对碱性条件的耐受性、增加的对有机溶剂的耐受性、增加的对高盐条件的耐受性和增加的对高或低温的耐受性。这些参数中的任一者的低效率可能会导致高制造成本、不能捕获或维持市场份额和/或无法使发酵最终产物进入市场。

本发明的方法可能适合于常规发酵生物反应器(例如分批、分批馈入、细胞再循环和连续发酵)。在一些实施例中，如本文中提供的微生物(例如被遗传修饰的微生物)在液体发酵培养基(即浸没培养物)中培养，其导致发酵产物排泄到发酵培养基中。发酵可以在被配置为搅拌槽、泡罩塔、气提反应器或本领域中已知的任何其它适合配置的生物反应器中进行。在一个实施例中，发酵最终产物可以使用本领域中已知的任何适合方法从发酵培养基分离。

在一些实施例中，发酵产物的形成可以在微生物的初始快速生长时期期间发生。在一个实施例中，发酵产物的形成可以在培养被维持在缓慢生长或非生长状态的第二时期期间发生。在一个实施例中，发酵产物的形成可以在微生物的一个以上生长时期期间发生。在所述实施例中，每单位时间形成的发酵产物的量一般来说随微生物的代谢活性、生理培养条件(例如pH、温度、培养基组成)和发酵工艺中存在的微生物的量而变化。

在一些实施例中，将发酵产物以分泌的代谢物形式从周质或培养基回收。在一个实施例中，例如当微生物缺乏对应于发酵产物的分泌信号时，将发酵产物从微生物萃取。在一个实施例中，使微生物破裂，并且将培养基或溶解物离心以移除微粒细胞碎片。然后可以在必要时分离膜和可溶性蛋白质部分。然后可以将所关注的发酵产物通过例如蒸馏、分馏、色谱、沉淀、过滤等由剩余上清液溶液或悬浮液纯化。在一个实施例中，将发酵产物通过以下中的一或多者萃取：蒸馏、反应性蒸馏、共沸蒸馏和萃取蒸馏。

本发明的方法优选地在厌氧条件下进行。产物的还原程度以及其合成的ATP需求两者确定了制造工艺能够好氧地还是厌氧地进行。为了经由厌氧微生物转化或至少通过使用氧消耗减少的工艺制造丁二烯，应避免氧还不平衡。几种类型的代谢转化步骤涉及氧还反应，包括如表1-3或图1-3中陈列的一些转化。所述氧还反应涉及由氧还辅因子(例如NADH、NADPH和铁氧还蛋白)的参与介导的电子转移。因为细胞中的氧还辅因子的量限于允许代谢过程持续，所以辅因子必须进行再生。为了避免所述氧还不平衡，可以使辅因子再生的替代性方法工程化，并且在一些情况下，可以提供其它的ATP产生来源。或者，氧化与还原过程可以在生物电化学系统中空间分离(拉贝(Rabaey)和罗森达尔(Rozendal),2010,自然综述：微生物学(Nature reviews,Microbiology),第8卷:706-716)。

在一些实施例中，可以通过使用氧化程度更大或还原程度更大的底物(例如可发酵碳源)来避免氧还不平衡。举例来说，如果利用一底物导致电子不足或过剩，那么可以分别通过使用还原或氧化程度更大的底物规避对氧的需求。举例来说，是生物柴油制造的主要副产物的甘油比糖的还原程度更大，并且因此更适用于合成其从糖的制造导致辅因子氧化的化合物(例如琥珀酸)。在一些实施例中，如果底物向产物的转化导致电子不足，那么可以添加充当电子供体的共底物(巴别塔(Babel)2009,生命科学工程学(Eng.Life Sci.)9,285-290)。厌氧使用共底物的重要准则在于其氧还电势高于NADH的氧还电势(吉尔特曼(Geertman)等人,2006,欧洲微生物学会联合会酵母研究(FEMS Yeast Res.)6,1193-1203)。如果底物向产物的转化导致电子过剩，那么可以添加充当电子受体的共底物。

从丁二烯制造聚丁二烯和其它化合物的方法

丁二烯在室温下或在发酵条件(20-45℃)下是气态的，并且其从发酵工艺的制造产生可能会聚结在发酵槽的顶部空间并且被虹吸和浓缩的气体。丁二烯可以通过溶剂萃取、低温工艺、蒸馏、分馏、色谱、沉淀、过滤等从气体(包括气态醇、CO

经由本文中揭示的工艺或方法中的任一者制造的丁二烯可以转化为聚丁二烯。或者，经由本文中揭示的方法制造的丁二烯可以与其它烯烃聚合以形成共聚物，例如丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、丙烯腈-丁二烯(ABR)或苯乙烯-丁二烯(SBR)共聚物、BR丁基橡胶(RB)、聚丁二烯橡胶(PBR)、丁腈橡胶和聚氯丁烯(氯丁橡胶(Neoprene))。那些合成橡胶或塑料弹性体应用包括制造轮胎、塑料材料、鞋底、鞋跟、技术物品、家庭用具、氯丁橡胶、纸张涂料、手套、密封垫和密封件。

在无进一步描述的情况下，据信本领域的普通技术人员可以使用以上描述和以下说明性实例制造和利用本发明的试剂并且实践所主张的方法。提供以下工作实例以促进本发明的实践，并且不应理解为以任何方式限制本发明的剩余部分。

实例

微生物(例如细菌)可以被遗传修饰以从可发酵碳源(包括例如葡萄糖)制造丁二烯。

在一例示性方法中，微生物可以通过本领域中已知的任何方法遗传工程化以包含：i.)一或多种编码路径中催化可发酵碳源向乙酰CoA和丙酰CoA转化的酶的多核苷酸，和/或一或多种编码路径中催化乙酰CoA和丙酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸；ii.)一或多种编码路径中催化可发酵碳源向巴豆酰CoA转化的酶的多核苷酸，和/或一或多种编码路径中催化巴豆酰CoA向丁二烯转化的酶的多核苷酸；或iii.)一或多种编码路径中催化可发酵碳源向甲酸转化的酶的多核苷酸，和/或一或多种编码路径中催化甲酸向丁二烯转化的酶的多核苷酸。

或者，缺乏一或多种使可发酵碳源向丁二烯转化的酶(例如一或多种催化活性的功能酶)的微生物可以被遗传修饰以包含一或多种编码微生物缺乏的路径中催化可发酵碳源向丁二烯转化的酶(例如功能酶，包括例如本文中揭示的任何酶)的多核苷酸。

如以上实例1中制造的被遗传修饰的微生物可以用以使碳源发酵以制造丁二烯。

在一例示性方法中，将包含可发酵碳源(例如9g/L葡萄糖，1g/L KH

在发酵期间，通过例如喷射氮气到培养基来维持厌氧条件。使用本领域中已知的任何方法维持适用于发酵的温度(例如约30℃)。通过例如自动添加氢氧化钠维持近似生理pH(例如约6.5)。在例如约50rpm下搅拌生物反应器。使发酵运行到完成。

然后使用常规方法从培养基回收制造的丁二烯。当通过蒸馏回收发酵产物时，可以任选地使丁二烯馏份聚合以形成聚丁二烯。可以使含有其它沿着丁二烯路径的中间物(如果有的话)的蒸馏馏份在生物反应器中进行后续发酵以制造额外丁二烯。

除非另外说明，否则本说明书和权利要求书中所用的表示成分量、例如分子量的性质、反应条件等的所有数字都应理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非与此相反地指示，否则本说明书和所附权利要求书中陈列的数值参数是近似值，其可以取决于试图通过本发明获得的所要性质而改变。最低限度并且并非试图限制权利要求书范围的等效物原则的应用地，至少应根据所报道有效数字的数值和通过应用普通舍入技术来理解每个数值参数。

尽管陈列本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但尽可能精确地报道具体实例中所陈列的数值。然而，任何数值固有地含有某些必然由其各别测试测量中所见的标准偏差产生的误差。

除非本文中另外说明或上下文明确矛盾，否则在描述本发明的情形下(尤其在以下权利要求书的情形下)所用的术语“一个/种(a/an)”、“所述(the)”和类似指示物应视为涵盖单数和复数两者。本文中值的范围的叙述仅旨在充当个别地提及处于所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外说明，否则每个个别格并入本说明书中，如同它在本文中个别地叙述一般。除非本文中另外说明或上下文明确矛盾，否则本文中描述的所有方法都可以按任何适合次序进行。使用本文中提供的任何和所有实例或例示性语言(例如“例如”)仅旨在较佳地说明本发明，并且不对另外主张的本发明的范围造成限制。本说明书中没有语言应视为指示实践本发明所必需的任何未主张要素。

本文中揭示的本发明的替代性要素或实施例的分组不应视为限制性。每个群组成员可以个别地或以与其它群组成员或本文中存在的其它要素的任何组合形式来提及和主张。预期出于便利性和/或专利性原因，可以将一或多个群组成员包括在一群组中或从一群组删去。当出现任何所述包括或删除时，将本说明书视为含有如修饰由此满足随附权利要求书中所用的所有马库西(Markush)群组的书面描述的群组。

本文中描述本发明的某些实施例，包括本发明人已知用于实现本发明的最佳方式。当然，对这些描述的实施例的改变对于本领域的普通技术人员来说在阅读以上描述后将变得显而易见。本发明人期望技术人士适当时使用所述改变，并且本发明人预期本发明与本文中具体描述不同地实践。因此，本发明包括随附于其的权利要求书中叙述的主题的如由适用法律准许的所有修改和等效物。此外，除非本文中另外说明或上下文明确矛盾，否则上述要素呈其所有可能变化形式的任何组合由本发明涵盖。

本文中揭示的具体实施例可以在权利要求书中使用由……组成和基本上由……组成语言来进一步限制。当用于权利要求书中时，无论是在申请时还是根据修正添加，过渡术语“由……组成”都排除权利要求书中未规定的任何要素、步骤或成分。过渡术语“基本上由……组成”将权利要求书的范围限制于规定的物质或步骤和不会本质上影响基础和新颖特征的那些。如此主张的本发明的实施例在本文中固有或明确地描述并且能够实现。

应理解，本文中揭示的本发明的实施例说明了本发明的原理。可以使用的其它修改在本发明的范围内。因此，举例来说(但非限制性地)，可以根据本文中的教示使用本发明的替代性配置。因此，本发明不限于如精确展示和描述者。

虽然本发明已经在本文中通过参考各种具体物质、程序和实例进行描述和说明，但应理解，本发明不局限于选择用于那个目的的物质和程序的具体组合。如本领域的技术人员将了解，可能意味着所述细节的众多改变。希望说明书和实例仅视为例示性，本发明的真实范围和精神由以下权利要求书指示。本申请案中提及的所有参考文献、专利和专利申请案都以全文引用的方式并入本文中。

序列表

<110> 布拉斯科南美公司

<120> 经修饰的微生物和使用其制造丁二烯的方法

<130> 0812275.00323

<160> 139

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 651

<212> DNA

<213> 大肠杆菌K12

<400> 1

atggatgcga aacaacgtat tgcgcgccgt gtggcgcaag agcttcgtga tggtgacatc 60

gttaacttag ggatcggttt acccacaatg gtcgccaatt atttaccgga gggtattcat 120

atcactctgc aatcggaaaa cggcttcctc ggtttaggcc cggtcacgac agcgcatcca 180

gatctggtga acgctggcgg gcaaccgtgc ggtgttttac ccggtgcagc catgtttgat 240

agcgccatgt catttgcgct aatccgtggc ggtcatattg atgcctgcgt gctcggcggt 300

ttgcaagtag acgaagaagc aaacctcgcg aactgggtag tgcctgggaa aatggtgccc 360

ggtatgggtg gcgcgatgga tctggtgacc gggtcgcgca aagtgatcat cgccatggaa 420

cattgcgcca aagatggttc agcaaaaatt ttgcgccgct gcaccatgcc actcactgcg 480

caacatgcgg tgcatatgct ggttactgaa ctggctgtct ttcgttttat tgacggcaaa 540

atgtggctca ccgaaattgc cgacgggtgt gatttagcca ccgtgcgtgc caaaacagaa 600

gctcggtttg aagtcgccgc cgatctgaat acgcaacggg gtgatttatg a 651

<210> 2

<211> 663

<212> DNA

<213> 大肠杆菌K12

<400> 2

atgaaaacaa aattgatgac attacaagac gccaccggct tctttcgtga cggcatgacc 60

atcatggtgg gcggatttat ggggattggc actccatccc gcctggttga agcattactg 120

gaatctggtg ttcgcgacct gacattgata gccaatgata ccgcgtttgt tgataccggc 180

atcggtccgc tcatcgtcaa tggtcgagtc cgcaaagtga ttgcttcaca tatcggcacc 240

aacccggaaa caggtcggcg catgatatct ggtgagatgg acgtcgttct ggtgccgcaa 300

ggtacgctaa tcgagcaaat tcgctgtggt ggagctggac ttggtggttt tctcacccca 360

acgggtgtcg gcaccgtcgt agaggaaggc aaacagacac tgacactcga cggtaaaacc 420

tggctgctcg aacgcccact gcgcgccgac ctggcgctaa ttcgcgctca tcgttgcgac 480

acacttggca acctgaccta tcaacttagc gcccgcaact ttaaccccct gatagccctt 540

gcggctgata tcacgctggt agagccagat gaactggtcg aaaccggcga gctgcaacct 600

gaccatattg tcacccctgg tgccgttatc gaccacatca tcgtttcaca ggagagcaaa 660

taa 663

<210> 3

<211> 1509

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032

<400> 3

atgtctgatc gcattgcttc agaaaagctg cgctccaagc tcatgtccgc cgacgaggcg 60

gcacagtttg ttaaccacgg tgacaaggtt ggtttctccg gcttcaccgg cgctggctac 120

ccaaaggcac tgcctacggc aatcgctaac cgggctaaag aagcacacgg tgcaggcaac 180

gactacgcaa tcgacctgtt cactggcgca tcgaccgccc ctgactgcga tggcgtactt 240

gcagaagctg acgctatccg ctggcgcatg ccatacgcat ctgatccaat catgcgtaac 300

aagatcaact ccggctccat gggatactcc gatatccacc tgtcccactc cggccagcag 360

gttgaagagg gcttcttcgg ccagctcaac gtagctgtca ttgaaatcac ccgcatcact 420

gaagagggct acatcatccc ttcttcctcc gtgggtaaca acgttgagtg gctcaacgct 480

gcagagaagg tcatcctcga ggttaactct tggcagtctg aagacctcga aggtatgcac 540

gacatctggt ctgttcctgc cctgccaaac cgcattgccg tgccaatcaa caagccaggc 600

gaccgcatcg gtaagaccta catcgagttc gacaccgaca aggttgttgc tgttgttgag 660

accaacaccg cagaccgcaa cgcaccattc aagcctgtcg acgacatctc taagaagatc 720

gctggcaact tcctcgactt cctggaaagc gaagttgctg caggtcgcct gtcctacgac 780

ggctacatca tgcagtccgg cgtgggcaac gtgccaaacg cggtgatggc aggcctgctg 840

gaatccaagt ttgagaacat ccaggcctac accgaagtta tccaggacgg catggtggac 900

ctcatcgacg ccggcaagat gaccgttgca tccgcaactt ccttctccct gtctcctgag 960

tacgcagaga agatgaacaa cgaggctaag cgttaccgcg agtccattat cctgcgccca 1020

cagcagatct ctaaccaccc agaggtcatc cgccgcgttg gcctgatcgc caccaacggt 1080

ctcatcgagg ctgacattta cggcaacgtc aactccacca acgtttctgg ctcccgcgtc 1140

atgaacggca tcggcggctc cggcgacttc acccgtaacg gctacatctc cagcttcatc 1200

accccttcag aggcaaaggg cggcgcaatc tctgcgatcg ttcctttcgc atcccacatc 1260

gaccacaccg agcacgatgt catggttgtt atctctgagt acggttacgc agaccttcgt 1320

ggtctggctc cacgtgagcg cgttgccaag atgatcggcc tggctcaccc tgattaccgc 1380

ccactgctcg aggagtacta cgctcgcgca acctccggtg acaacaagta catgcagacc 1440

cctcatgatc ttgcaaccgc gtttgatttc cacatcaacc tggctaagaa cggctccatg 1500

aaggcataa 1509

<210> 4

<211> 378

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032

<400> 4

atgaatggta tcggcggctc gggcgatttc acgcgtaacg cctttgcttc cacatttatc 60

tctccctcgg cagccaaagt tgatgcgatt tccgcgattg tgcctttcgc gtcccatatc 120

gatcacacgg aacatgatgc gatggttgtc attactgaat atggctacgc agacctgcgc 180

gggctatcgc caaaacaacg agtccccaaa atgattgcca tcgcccaccc ggactatcga 240

ccactgctgg aagcatactt tgaccgggcg ctgaacagtg ctgattccta tcagcacacc 300

ctgcatgatc tgcgcaccgc cttcgatttc cataatcgct tgaactcaca aggaaccatg 360

aaaatcgaaa aagcatag 378

<210> 5

<211> 657

<212> DNA

<213> 丙酮丁醇梭菌

<400> 5

atgaactcta aaataattag atttgaaaat ttaaggtcat tctttaaaga tgggatgaca 60

attatgattg gaggtttttt aaactgtggc actccaacca aattaattga ttttttagtt 120

aatttaaata taaagaattt aacgattata agtaatgata catgttatcc taatacaggt 180

attggtaagt taatatcaaa taatcaagta aaaaagctta ttgcttcata tataggcagc 240

aacccagata ctggcaaaaa actttttaat aatgaacttg aagtagagct ctctccccaa 300

ggaactctag tggaaagaat acgtgcaggc ggatctggct taggtggtgt actaactaaa 360

acaggtttag gaactttgat tgaaaaagga aagaaaaaaa tatctataaa tggaacggaa 420

tatttgttag agctacctct tacagccgat gtagcattaa ttaaaggtag tattgtagat 480

gaggccggaa acaccttcta taaaggtact actaaaaact ttaatcccta tatggcaatg 540

gcagctaaaa ccgtaatagt tgaagctgaa aatttagtta gctgtgaaaa actagaaaag 600

gaaaaagcaa tgacccccgg agttcttata aattatatag taaaggagcc tgcataa 657

<210> 6

<211> 666

<212> DNA

<213> 丙酮丁醇梭菌

<400> 6

atgattaatg ataaaaacct agcgaaagaa ataatagcca aaagagttgc aagagaatta 60

aaaaatggtc aacttgtaaa cttaggtgta ggtcttccta ccatggttgc agattatata 120

ccaaaaaatt tcaaaattac tttccaatca gaaaacggaa tagttggaat gggcgctagt 180

cctaaaataa atgaggcaga taaagatgta gtaaatgcag gaggagacta tacaacagta 240

cttcctgacg gcacattttt cgatagctca gtttcgtttt cactaatccg tggtggtcac 300

gtagatgtta ctgttttagg ggctctccag gtagatgaaa agggtaatat agccaattgg 360

attgttcctg gaaaaatgct ctctggtatg ggtggagcta tggatttagt aaatggagct 420

aagaaagtaa taattgcaat gagacataca aataaaggtc aacctaaaat tttaaaaaaa 480

tgtacacttc ccctcacggc aaagtctcaa gcaaatctaa ttgtaacaga acttggagta 540

attgaggtta ttaatgatgg tttacttctc actgaaatta ataaaaacac aaccattgat 600

gaaataaggt ctttaactgc tgcagattta ctcatatcca atgaacttag acccatggct 660

gtttag 666

<210> 7

<211> 1753

<212> DNA

<213> 罗斯氏菌种A2-183

<400> 7

agaaatctgc tacgaactgg gaacctattt tgtgggacag cgcgactacg cggaagcggt 60

tctctggttc tacaatgccg cctatgagac ggaaagcatc ctggacgttc acacaagcgg 120

ggatcttccg ctgctcggtc ttgtcgaatg ttacgagacg ctcctcgccg gggaggaagc 180

caaaattcct tccgacacag cgcttaccat ccagtacgaa atgatgctcg acaaataccg 240

ggaggcttcc agagactggc ggatgccgga ggagacctga tcttacaaat ctccggaaat 300

acgctccggc agggcttgta aaatacgaca taaagtgata ggatgaaact atggtaaaat 360

tttaacaatc ttttgtgtgg gaggtatttg agatggattt tcgtgaagaa tacaaacaga 420

agcttgtctc cgcagatgag gcggtaaagc tcatcaaatc cggagactgg gtagattacg 480

gctggtgcac caacaccgtt gacgcactgg atcaggctct cgcaaagcgc accgacgaac 540

tgacagacgt caagctgcgc ggcggtatcc tgatgaagcc gctggctgtt tttgcacgtg 600

aggatgcagg tgagcatttc tgctggaact cctggcatat gtccggtatc gagcgcaaga 660

tgataaacag aggcgtggct tactactgtc cgatccgcta ctccgagctg ccgcgctact 720

accgcgagct tgactgcccg gatgacgttg ccatgttcca ggttgctccg atggatgcgc 780

acggctactt taacttcggt ccgagtgcct cacatctggg tgcaatgtgc gagcgcgcaa 840

agcacatcat cgtagaagtc aatgaaaata tgccacgctg cctcggcggt accgagtgtg 900

gcatccacat ttccgatgtc acctacatcg tggaaggctc caacccgcca atcggtgaac 960

tgggtgcagg cggtcctgct acagatgtgg ataaggctgt cgcaaagctg atcgtcgatg 1020

agattccgaa cggtgcctgc ttacagctcg gtatcggcgg catgccaaac gctgtcggtt 1080

ccctgattgc agagtccgac ttgaaggatc tcggcgttca cactgagatg tacgtggatg 1140

catttgtcga tattgcaaag gcaggtaaga tcaacggttc caaaaagaat atcgaccgtt 1200

accgccagac ctacgctttc ggcgccggca ccaagaaaat gtacgattat ctggacgaca 1260

acccggaact gatgagcgct ccggtcgact acacgaacga catccgctcg atctccgcac 1320

tggataactt tatttccatc aacaatgccg tggatattga tctctatggt caggtaaatg 1380

cagagtctgc aggcatcaag cagatcagcg gcgcaggcgg acagcttgac ttcgtgctcg 1440

gagcttatct gtccaagggc ggcaagagct ttatctgctt atcctctacc ttcaagacca 1500

aggacggtca ggtgcagtcc cgtatccgcc cgacgctggc aaacggttcc atcgttaccg 1560

acgcaagacc gaatacacac tatgttgtaa ccgaatacgg caaggtgaac ttaaagggtc 1620

tgtctacctg gcagagagcc gaggctctga tctcgatcgc gcatcccgat ttccgcgacg 1680

acctcatcaa agaggcggag cagatgcaca tctggagaag aagcaaccgc tagtaccgga 1740

ggacgactga cgg 1753

<210> 8

<211> 1000

<212> DNA

<213> 丙酸梭菌

<400> 8

gaattcaaaa ttgctatcgt tgatgacgat ttggctcagg aatccagaca gattcgtgtt 60

gacgttctgg atggcgaagg tggccctctt tatagaatgg caaaagcttg gcagcaaatg 120

tacggttgct ctcttgcaac tgatacaaag aaaggccgcg gcagaatgct gatcaacaag 180

acaattcaga caggtgcaga tgctatcgtt gttgcgatga tgaaattctg tgatcctgaa 240

gaatgggatt accctgtaat gtacagagaa tttgaagaaa aaggcgttaa gagtctgatg 300

atcgaagttg atcaggaagt ttcttccttc gaacagatca agacaagact gcagtctttc 360

gtagaaatgc tgtaatttga acaatcgttt gctgaaaaac tgtacactgg ggtgggtgac 420

tgctccagtg tattgtaata agcaaataag caaaaatcga taagatttag gaggattttc 480

gacaatgaga aaggttccca ttattaccgc agatgaggct gcaaagctta ttaaagacgg 540

tgatacagtt acaacaagtg gtttcgttgg aaatgcaatc cctgaggctc ttgatagagc 600

tgtagaaaaa agattcttag aaacaggcga acccaaaaac attacatatg tttattgtgg 660

ttctcaaggt aacagagacg gaagaggtgc tgagcacttt gctcatgaag gccttttaaa 720

acgttacatc gctggtcact gggctacagt tcctgctttg ggtaaaatgg ctatggaaaa 780

taaaatggaa gcatataatg tatctcaggg tgcattgtgt catttgttcc gtgatatagc 840

ttctcataag ccaggcgtat ttacaaaggt aggtatcggt actttcattg accccagaaa 900

tggcggcggt aaagtaaatg atattaccaa agaagatatt gttgaattgg tagagattaa 960

gggtcaggaa tatttattct accctgcttt tcctattcat 1000

<210> 9

<211> 1554

<212> DNA

<213> 拜氏梭菌

<400> 9

gtgagaaaag taaaagtttt aacaagtcgc gaagcagtac aaatagtgaa ggatggagat 60

gtgttagtaa ctggcggatt tgttggtagt tgtgcacctg aaactcttag ttgtgcttta 120

gaaaaacgtt tcattgaaac aaatcatccg caaaatataa ctttatttca tgcagcagga 180

caaggcgata gtaaggggaa aggttcagat cattatgccc acgaaggctt acttaagaga 240

gtggttgcag gtcattataa tttagcaccg aaaattggaa agttaattaa tgaaaataaa 300

atagaagctt ataatctacc acaagggaca atttctcaat tatttagaga tattgcggga 360

aaaagaattg ggacaataac tcacgttgga ttgaatacat ttgtggatcc aagaattagt 420

ggtggaaaat taaatgaaaa aacaaaagaa gatctagtaa agctaataaa tatagaaggt 480

gaagaaaaat tattatacaa atcaattcca gttaatgtct gcttcttaag aggatctttt 540

gcagatgaat acggtaatgt atcattagaa aaagaaatag ctacacttga ggatacgtca 600

atagcccaag cttgtaagaa taatggcgga aaagtaatag ttcaagtaga aaaagtagtt 660

gaagcaggat ctttagaccc acgtcttata aaaattccag gtatatatgt agatgcggtt 720

gtaatctcaa ctcccgaaga gcatgaacaa tccttcgaat gcccatttaa tccagcagta 780

acaggtgaaa tgagaattcc attaaacagt gtagaaaaag ctccattaaa tgagagaaag 840

ataattgcga gaagagcagc tatggaatta aagaaagata cggtagtaaa tttaggtata 900

gggataccag aagttatttc tttagttgcg aatgaagaag gaattggtga atatatgaca 960

ttaactgtag aagccggtcc aataggaggt ataccacaag gatgcacagc ttttggagcg 1020

agtataaatc cagaagctat tatagatcag ccatatcaat ttgattttta tgatggtgga 1080

ggcgtcgata tagcattttt aggactagct caggttgatg aacatggaaa tttgaatgta 1140

agtaagtttg ggcctagaat tgctggatgt ggtggattca taaatataac tcaaaatgct 1200

aagaaagtgt tattttgtgg aacattcact gcaggaggct taaaagtagt aacaggagat 1260

ggcaaattag aaattaaaca agaaggaaaa gctaaaaaat tcattaagga tgtagagcaa 1320

attacattta gtggagatta tgcaagaagg atggatcaac aagttatgta tataactgag 1380

agagcagtat ttgagttaag gaaagatgga ttatacctta cagaaatagc gcctgggata 1440

gatctaaaaa aggatgtatt ggatttaatg gatttcaaac ctaaaatgga tggagtacct 1500

agactaatga atggaagaat attttatgat aagttgatgg gattaaggga gtaa 1554

<210> 10

<211> 687

<212> DNA

<213> 不动杆菌种ADP1

<400> 10

atgatagata aaagtgcagc gaccctaacg gaagcgctct cccagatcca cgacggtgcc 60

accatcctga ttggtggttt tggaacagcc ggccaacccg ccgagctgat tgacggactg 120

attgaactag gtcgcaagaa cctaaccatc gtcagcaaca acgccggcaa tggagactat 180

ggactggcca agctgctaaa aactggcgcc gtcaaaaaga tcatctgttc cttcccacgt 240

caggccgact cctacgtatt tgacgagcta taccgtgcgg gcaaaattga acttgaaatc 300

gtgccgcagg gcaatctggc ctgtcgtata caggccgccg gcatggggct ggggccgatc 360

tacaccccaa ccggttttgg cactttactc gcagaaggta aacctaccct gaactttgat 420

ggcaaagact acgtactgga aaacccgatc aaggccgact ttgccctgat caaagcctac 480

aagggcgacc gctggggcaa tctggtctat cgcaaatcag cacgaaactt cggcccgatc 540

atggccatgg ccgccaacgt gaccatcgca caagtgagcg aagtggtggc actaggagaa 600

ctcgacccgg aaaacgtggt gaccccaggc atctttgttc aacacgttgt accagtccaa 660

tctaccccag caagcgctgc accataa 687

<210> 11

<211> 654

<212> DNA

<213> 不动杆菌种ADP1

<400> 11

atgagttatc acaaactgac ccgtgaccag atcgcccagc gcgttgccca agacattccg 60

gaaggctcct atgtcaatct tggcattggc ctgccgacca agattgccag ctatctgcct 120

gccgacaaag acgtatttct acattcagaa aacggactgc tggcctttgg cccaccacca 180

gcggccggcg aagaagatcc ggaactgatc aacgcaggca aagaatacgt aaccatgctc 240

gaaggcggtt gcttctttca ccatggcgac tccttcgcca tgatgcgcgg tggacatctg 300

gatatctgcg tattaggcgc attccagatc gccgccaatg gagacctggc caactggcac 360

accggtgcac cggatgccat accgtcggtc ggtggagcca tggatcttgc ggttggggca 420

aaaaaagttt ttgtaaccac cgatcatgtc accaaaaaag gtgagccgaa gattgtagct 480

gaactgacgt atccagccac gggtcagaaa tgtgtcgacc ggatctacac cgacctgtgc 540

atcatcgatg tggtgccaga aggactgaaa gtgatcgaga aagtcgaagg cttaagcttt 600

gaagaactac aacgcctgac cggtgcaaca ctgatcgatg cgacacaagg ctaa 654

<210> 12

<211> 696

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 12

ttgatcaata aaacgtacga gtccatcgcc agcgcggtgg aagggattac cgacggttcg 60

accatcatgg tcggtggctt cggcacggct ggcatgccgt ccgagctgat cgatggcctc 120

attgccaccg gtgcccgcga cctgaccatc atcagcaaca acgccggcaa cggcgagatc 180

ggcctggccg ccctgctcat ggcaggcagc gtgcgcaagg tggtctgctc gttcccgcgc 240

cagtccgact cctacgtgtt cgacgaactg taccgcgccg gcaagatcga gctggaagtg 300

gtcccgcagg gcaacctggc cgagcgtatc cgcgccgcag gctccggcat tggtgcgttc 360

ttctcgccaa ccggctacgg caccctgctg gccgagggca aggaaacccg tgagatcgat 420

ggccgcatgt acgtgctgga aatgccgctg cacgccgact tcgcactgat caaggcgcac 480

aagggtgacc gttggggcaa cctgacctac cgcaaggccg cccgcaactt cggcccgatc 540

atggccatgg ctgccaagac cgccatcgcc caggtcgacc aggtcgtcga actcggtgaa 600

ctggacccgg aacacatcat caccccgggt atcttcgtcc agcgcgtggt cgccgtcacc 660

ggtgctgccg cttcttcgat tgccaaagct gtctga 696

<210> 13

<211> 642

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 13

atgaccatca ccaaaaagct ctcccgcacc gagatggccc aacgcgtggc cgcagacatc 60

caggaaggcg cgtatgtaaa cctgggtatc ggcgcaccaa ccctggtggc caactacctg 120

ggcgacaagg aagtgttcct gcacagcgaa aacggcctgc tgggcatggg cccaagccct 180

gcgccgggcg aggaagacga tgacctgatc aacgccggca agcagcacgt caccctgctg 240

accggtggtg ccttcttcca ccatgccgat tcgttctcga tgatgcgtgg cggccacctg 300

gacatcgccg tactgggtgc cttccaggtg tcggtcaagg gcgacctggc caactggcac 360

acgggtgccg aaggttcgat cccggccgta ggcggcgcaa tggacctggc caccggcgcc 420

cgccaggtgt tcgtgatgat ggaccacctg accaagaccg gcgaaagcaa gctggtgccc 480

gagtgcacct acccgctgac cggtatcgcg tgcgtcagcc gcatctacac cgacctggcc 540

gtgctggaag tgacaccgga agggctgaaa gtggtcgaaa tctgcgcgga catcgacttt 600

gacgaactgc agaaactcag tggcgtgccg ctgatcaagt aa 642

<210> 14

<211> 717

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 14

atgggaaaag tgctgtcatc aagcaaggaa gctgcgaaac tgattcatga tggggatacg 60

ctgatcgcgg gagggtttgg gctgtgcggc atccctgaac agctcatttt gtctataaga 120

gatcagggag taaaggattt aaccgttgtc agcaataact gcggagtcga tgactggggg 180

cttggtttgc ttctggctaa caagcaaatc aagaaaatga tcgcttccta tgtcggtgaa 240

aataaaattt ttgagcggca gtttttaagc ggagagcttg aggtagagct tgttccccaa 300

ggaacgctcg ctgagagaat tcgtgcaggc ggtgcaggca taccgggatt ttatacggcg 360

acaggcgtcg gcacctccat agccgaggga aaagaacata aaacattcgg cggccggact 420

tatgtgctgg agcgaggcat taccggcgat gtggcgatcg tcaaagcgtg gaaagcggac 480

accatgggca atttgatttt taggaaaacg gcgagaaatt tcaatcccat tgccgccatg 540

gcaggcaaga tcacgattgc cgaggcggaa gaaatcgtgg aagcaggaga gctcgatcca 600

gatcacatcc atacgccggg aatttacgta cagcatgtcg tgcttggcgc gagccaagaa 660

aaacggattg aaaaacgaac agttcagcaa gcatcgggaa agggtgaggc caagtga 717

<210> 15

<211> 651

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 15

gtgaaggaag cgagaaaacg aatggtcaaa cgggctgtac aagaaatcaa ggacggcatg 60

aatgtgaatc tcgggattgg aatgccgacg cttgtcgcaa atgagatacc cgatggcgtt 120

cacgtcatgc ttcagtcgga aaacggcttg ctcggaattg gcccctatcc tctggaagga 180

acggaagacg cggatttgat caatgcggga aaggaaacga tcactgaagt gacaggcgcc 240

tcttattttg acagcgctga gtcattcgcg atgataagag gcgggcatat cgatttagct 300

attctcggcg gaatggaggt ttcggagcag ggggatttgg ccaattggat gatcccgggc 360

aaaatggtaa aagggatggg cggcgccatg gatctcgtca acggggcgaa acgaatcgtt 420

gtcatcatgg agcacgtcaa taagcatggt gaatcaaagg tgaaaaaaac atgctccctt 480

ccgctgacag gccagaaagt cgtacacagg ctgattacgg atttggctgt atttgatttt 540

gtgaacggcc gcatgacact gacggagctt caggatggtg tcacaattga agaggtttat 600

gaaaaaacag aagctgattt cgctgtaagc cagtctgtac tcaattctta a 651

<210> 16

<211> 1617

<212> DNA

<213> 克氏梭菌

<400> 16

atgagtaaag ggataaagaa ttcacaattg aaaaaaaaga atgtaaaggc tagtaatgtg 60

gcagaaaaga ttgaagagaa agttgaaaaa acagataagg ttgttgaaaa ggcagctgag 120

gttacagaaa aacgaattag aaacttgaag cttcaggaaa aagttgtaac agcagatgtg 180

gcagctgata tgatagaaaa cggtatgatt gttgcaatta gcggatttac tccttccggg 240

tatcctaaag aagtacctaa agcattgact aaaaaagtta atgccttaga ggaagaattc 300

aaggtaacac tttatacagg ttcatctaca ggagccgata tagacggaga atgggcaaaa 360

gcaggaataa tagaaagaag aattccatat cagacaaatt ctgatatgag gaaaaaaata 420

aatgatggtt ctattaagta tgctgatatg catttaagcc atatggctca atatattaat 480

tattctgtaa ttcctaaagt agatatagct ataatagagg cagtagctat tacagaagaa 540

ggggatatta ttccttcaac aggaattgga aatacagcta cttttgtgga aaatgcagat 600

aaggtaatag tggaaattaa tgaggctcaa ccgcttgaat tggaaggtat ggcagatata 660

tatacattaa aaaaccctcc aagaagagag cccataccta tagttaatgc aggcaatagg 720

atagggacca catatgtgac ctgtggttct gaaaaaatat gcgctatagt gatgacaaat 780

acccaggata aaacaagacc tcttacagaa gtgtctcctg tatctcaggc tatatccgat 840

aatcttatag gatttttaaa taaagaggtt gaagagggaa aattacctaa gaacctgctt 900

cctatacagt caggagttgg aagtgtagca aatgcagttt tggccggact ttgtgaatca 960

aattttaaaa atttgagttg ttatacagaa gttatacagg attctatgct gaagcttata 1020

aaatgtggta aagcagatgt ggtgtcaggc acttccataa gtccttcacc ggagatgttg 1080

cctgagttca taaaggacat aaatttcttt agagaaaaga tagtattaag accacaggaa 1140

ataagtaata atccagagat agcaagaaga ataggagtta tatccataaa cactgctttg 1200

gaagtagata tatatggtaa tgtaaactcc actcatgtta tgggaagcaa aatgatgaat 1260

ggtataggcg gttctggaga ctttgccaga aatgcatatt tgactatatt cactacagag 1320

tctatcgcca aaaaaggaga tatatcatct atagttccta tggtatccca tgtggatcat 1380

acagaacatg atgtaatggt aattgttaca gaacagggag tagcagattt aagaggtctt 1440

tctcctaggg aaaaggccgt ggctataata gaaaattgtg ttcatcctga ttacaaggat 1500

atgcttatgg aatattttga agaggcttgt aagtcatcag gtggaaatac accacataat 1560

cttgaaaaag ctctttcctg gcatacaaaa tttataaaaa ctggtagtat gaaataa 1617

<210> 17

<211> 1290

<212> DNA

<213> 克氏梭菌

<400> 17

atggagtggg aagagatata taaagagaaa ctggtaactg cagaaaaagc tgtttcaaaa 60

atagaaaacc atagcagggt agtttttgca catgcagtag gagaacccgt agatttagta 120

aatgcactag ttaaaaataa ggataattat ataggactag aaatagttca catggtagct 180

atgggcaaag gtgaatatac aaaagagggt atgcaaagac attttagaca taatgcttta 240

tttgtaggcg gatgtactag agatgcagta aattcaggaa gagcagatta tacaccttgt 300

tttttctatg aagtgccaag tttgtttaaa gaaaaacgtt tgcctgtaga tgtagcactt 360

attcaggtaa gtgagccaga taaatatggc tactgcagtt ttggagtttc caatgactat 420

accaagccag cagcagaaag tgctaagctt gtaattgcag aagtgaataa aaacatgcca 480

agaactcttg gagattcttt tatacatgta tcagatattg attatatagt ggaagcttca 540

cacccattgt tagaattgca gcctcctaaa ttgggagatg tagaaaaagc cataggagaa 600

aactgtgcat ctttaattga agatggagct actcttcagc ttggaatagg tgctatacca 660

gatgcggtac ttttattctt aaagaacaaa aagaatttag gaatacattc tgagatgata 720

tcagatggtg tgatggaact ggtgaaggca ggggttatca ataacaagaa aaagaccctc 780

catccaggca aaatagttgt aacattttta atgggaacaa aaaaattata tgattttgta 840

aacaataatc caatggtaga aacttattct gtagattatg taaataatcc actggtaatt 900

atgaaaaatg acaatatggt ttcaataaat tcttgtgttc aagtagactt aatgggacaa 960

gtatgttctg aaagtatagg attgaaacag ataagtggag tgggaggcca ggtagatttt 1020

attagaggag ctaatctatc aaagggtgga aaggctatta tagctatacc ttccacagct 1080

ggaaaaggaa aagtttcaag aataactcca cttctagata ctggtgctgc agttacaact 1140

tctagaaatg aagtagatta tgtagttact gaatatggtg ttgctcatct taagggcaaa 1200

actttaagaa atagggcaag agctctaata aatatcgctc atccaaaatt cagagaatca 1260

ttaatgaatg aatttaaaaa gagattttag 1290

<210> 18

<211> 1314

<212> DNA

<213> 克氏梭菌

<400> 18

atggttttta aaaattggca ggatctttat aaaagtaaaa ttgttagtgc agacgaagct 60

gtatctaaag taagctgtgg agatagcata attttaggca atgcttgtgg agcatctctt 120

acacttttag atgccttggc tgcaaataag gaaaagtata agagtgtaaa gatacacaat 180

cttatactta attataaaaa tgatatatat actgatccgg aatcagaaaa gtatattcat 240

ggaaatactt tctttgtaag tggaggtaca aaggaagcag ttaattgtaa tagaacagat 300

tatactccat gcttttttta tgaaatacca aaattattaa aacaaaagta tataaatgca 360

gatgtagctt ttattcaagt aagtaagcct gatagccatg gatactgtag ctttggagta 420

tcaaccgatt attcacaggc aatggtacag tctgcaaagc ttataattgc agaagtaaac 480

gatcagatgc caagagtttt aggagacaat tttatacaca tttctgatat ggattacata 540

gtagaaagtt cacgtccaat tctagaattg actcctccta aaataggaga agtagagaag 600

acaataggaa aatactgtgc atctcttgta gaagatggtt ctacacttca gcttggaata 660

ggagctattc cagatgcagt acttttattc ttgaaggata aaaaggattt gggtatacat 720

tcagaaatga tatccgatgg tgttgttgaa ttagttgaag caggggtaat tacaaataag 780

aaaaagtccc ttcatccagg aaaaataatt attacattct taatgggaac taagaaatta 840

tatgatttca taaatgataa tcctatggta gaaggatacc ctgtagatta tgtaaatgat 900

cctaaggtta ttatgcaaaa ttctaagatg gtatgtataa actcctgtgt agaagtggat 960

ttcacaggac aagtgtgtgc tgaaagtgta ggatttaaac aaataagcgg tgtaggtgga 1020

caagttgatt acatgagagg agctagcatg gctgatggag gaaaatcaat tcttgctata 1080

ccatctactg cagctggcgg caaaatttca agaatagttc ctattttaac tgaaggagcg 1140

ggggttacta cttcaagata tgatgttcaa tatgttgtta cagaatatgg tattgcactt 1200

ctcaagggca aatccataag agaaagagct aaggagctta taaaaattgc acatcctaaa 1260

tttagggaag aattaacagc tcaatttgaa aaaagattca gttgtaagct ttaa 1314

<210> 19

<211> 963

<212> DNA

<213> 发酵氨基酸球菌

<400> 19

ttgagtaaag taatgacgtt aaaagacgca atcgccaagt atgtgcacag tggtgatcac 60

attgctctgg gtggttttac gacggaccgt aaaccctatg cggctgtgtt cgaaatcctg 120

agacagggta tcacggatct gaccggtctg ggcggcgctg ccggcggcga ctgggatatg 180

ctgatcggca acggccgtgt gaaagcctac atcaactgct acaccgccaa ctccggtgtg 240

accaacgttt ccagacggtt cagaaaatgg ttcgaagccg gcaaactgac catggaagac 300

tattcccagg atgttatcta catgatgtgg catgccgccg ctctgggcct gcccttcctg 360

cctgtaaccc tgatgcaggg ctccggcctg accgatgaat ggggcatcag caaggaagtc 420

cgtaaaaccc tggacaaagt tcctgatgac aaattcaaat acatcgacaa ccccttcaaa 480

ccgggtgaaa aagtcgtggc tgttcctgtt ccgcaggttg atgtggccat catccatgcc 540

cagcaggctt ctcccgatgg caccgttcgc atctggggcg gcaaattcca ggatgtggat 600

attgctgaag cagccaaata caccatcgtt acctgcgaag aaatcatttc tgatgaagaa 660

atcagaagag atcccaccaa gaacgatatc cccggcatgt gcgtagatgc tgttgtcctg 720

gctccttacg gtgcacatcc ttctcagtgc tatggcctgt acgactacga caatccgttc 780

ctgaaagtct atgacaaggt ctccaagacc caggaagact tcgatgcctt ctgcaaggaa 840

tgggtgttcg acctgaagga tcatgacgaa tacctgaaca aactgggtgc cactcgtctg 900

atcaacctga aggttgttcc tggtctgggc taccacatcg acatgacgaa ggaggacaaa 960

taa 963

<210> 20

<211> 963

<212> DNA

<213> 发酵氨基酸球菌

<400> 20