一种免疫增强型外泌体水凝胶复合物及其制备方法和应用
文献发布时间:2023-06-19 11:24:21
技术领域
本发明公开了一种免疫增强型外泌体水凝胶复合物及其制备方法和应用,属于水凝胶复合物技术领域。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类健康,现有治疗方案如手术、化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗均存在一定局限性。尽管化疗+免疫的肿瘤联合治疗已为常用手段,但其多采用系统性给药方案,存在肿瘤选择性低、免疫应答效率弱、毒副作用大等缺点,限制了临床应用。
近年来,肿瘤局部给药作为系统性治疗的一个有效改善方案,成为抗肿瘤领域研发热点之一。外泌体是一种由细胞分泌的具双层脂质膜结构的纳米囊泡,作为一种极具应用前景的药物递送载体,具有低毒、无免疫原性、渗透性好等优点。研究证实,M1型巨噬细胞具有肿瘤及肿瘤炎症趋向性,可用于抗肿瘤药物的靶向递送。值得关注的是,M1型巨噬细胞外泌体具有与M1型巨噬细胞类似的膜结构,与未极化的巨噬细胞分泌的外泌体相比,具有更显著的肿瘤靶向性。尽管如此,局部给药后的载药外泌体仍存在稳定性低和滞留性差等缺陷,阻碍了其作为局部缓释载体的应用。
另一方面,水凝胶作为肿瘤局部递药载体具有独特优势:(1)独特的三维网络结构利于多种药物的高效包载和缓控释药;(2)选用适宜凝胶材料可实现微创、良好的生物相容性和生物可降解特性;(3)肿瘤局部注射利于药物的高肿瘤蓄积特性和低全身毒性。然而,基于肿瘤及肿瘤微环境的复杂特性,肿瘤局部递药水凝胶的设计仍面临极大的挑战,如凝胶在肿瘤区域的非响应释药,药物从凝胶释放后是否能进一步特异性靶向蓄积至肿瘤组织,凝胶材料的不可注射性、低肿瘤黏附性、无免疫增强活性等。
透明质酸为细胞基质的重要组分,具有优越的生物相容性和可降解性,特别地,透明质酸与肿瘤细胞高表达的CD
发明内容
发明目的:为解决上述技术问题,本发明提供了一种免疫增强型外泌体水凝胶复合物及其制备方法和应用,该水凝胶复合物为一种全新的化疗+免疫增强剂组合方案,可克服载药外泌体稳定性差、靶向效率低、滞留性弱等缺点及普通水凝胶肿瘤黏附性低、不可注射、非响应释药等缺点,提高药物在肿瘤及肿瘤炎症环境的有效蓄积浓度,降低全身毒副作用,发挥协同杀伤作用,对各类实体瘤均具有显著的治疗效果。
技术方案:为了实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种免疫增强型外泌体水凝胶复合物,所述复合物是由M1型巨噬细胞外泌体包载药物形成药物-M1型巨噬细胞外泌体,然后通过甘露聚糖肽和透明质酸的化学交联形成水凝胶,将所述药物-M1型巨噬细胞外泌体负载在所述水凝胶中,所形成的水凝胶递药系统。
作为优选,所述药物选自阿霉素、紫杉醇、姜黄素、灵芝酸A、人参皂苷、槲皮素、紫草素或鱼腥草素。
所述化学交联是先将透明质酸氧化,然后与甘露聚糖肽在溶液中进行反应,使氧化透明质酸的醛基和甘露聚糖肽的氨基进行化学交联,优选室温反应15s-2min,进一步优选30s。
所述的免疫增强型外泌体水凝胶复合物的制备方法,包括以下步骤:
S1:M1型巨噬细胞外泌体的提取、纯化;
S2:药物-M1型巨噬细胞外泌体的制备;
S3:药物-M1型巨噬细胞外泌体的甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶的制备:
将步骤S2中的药物-M1型巨噬细胞外泌体与甘露聚糖肽溶液混合后,再加入氧化透明质酸溶液混合均匀,室温反应,形成负载药物-M1型巨噬细胞外泌体的甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶。
作为优选,步骤S1中,包括诱导巨噬细胞M1极化,然后从M1极化的巨噬细胞培养液中提取外泌体,最后采用超速离心法得到M1极化的巨噬细胞外泌体,即为所述M1型巨噬细胞外泌体。
具体的,包括:使用LPS和IFN-γ诱导小鼠巨噬细胞M1极化,从M1极化的巨噬细胞培养液中提取外泌体,采用超速离心法得到M1极化的巨噬细胞外泌体,重悬于1×PBS中,-80℃保存备用。优选,所述的小鼠巨噬细胞为RAW264.7细胞、骨髓来源巨噬细胞。
作为优选,步骤S2中,采用电穿孔法制备药物-M1型巨噬细胞外泌体,M1型巨噬细胞外泌体(以蛋白计)与药物的质量比为1:1~5,进一步优选1:1~2,更优选为1:2。
具体的,包括:避光条件下,将药物溶液与M1型巨噬细胞外泌体混合均匀,使用电穿孔仪,按照设定参数进行载药。所得样品超速离心2次,去除游离药物,所得载药外泌体沉淀用1×PBS重悬备用。优选,电穿孔仪设定参数为:电压300~1000V,放电时间1~10ms,放电次数:1次。进一步优选为:电压700~1000V,放电时间5~10ms,放电次数:1次,更优选为:电压1000V,放电时间5ms,放电次数1次。
作为优选,步骤S3中,使用高碘酸钠氧化透明质酸,制备氧化透明质酸,透明质酸的分子量为50~1000kDa,进一步优选为100~200kDa。
作为优选,步骤S3中,所述的氧化透明质酸溶液的浓度为5~20%(W/V),进一步优选为6~8%(W/V);甘露聚糖肽的分子量为40~90kDa,进一步优选为51~72kDa;甘露聚糖肽溶液的浓度为5~20%(W/V),进一步优选为6~10%(W/V);甘露聚糖肽溶液与氧化透明质酸溶液的体积比为1:1~3,室温反应15s-2min,进一步优选30s。
本发明最后还提供了所述的免疫增强型外泌体水凝胶复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
作为优选,所述肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、皮肤癌、肝癌、胃癌、脑癌或卵巢癌。
所述免疫增强型外泌体水凝胶复合物中,药物在复合物中的含量为0.1~5mg/mL。该复合物可以通过肿瘤原位注射或瘤周局部注射的方式进行给药,给药剂量为1~20mL/kg。
甘露聚糖肽,即α-甘露聚糖肽,是从33#链球菌代谢产物中分离出的一种糖蛋白,具有提升外周白细胞水平,增强网状内皮系统吞噬功能,活化巨噬细胞及淋巴细胞,诱导胸腺淋巴细胞产生活性物质,改善和增强机体免疫功能和应激能力等功能。本发明的复合物中,甘露聚糖肽作为免疫增强剂,用于肿瘤辅助治疗。此外,甘露聚糖肽由甘露聚糖链和碱性多肽构成,碱性多肽富含的氨基可与氧化透明质酸中的醛基交联成席夫碱型凝胶,且甘露聚糖与肿瘤微环境高度浸润的巨噬细胞表面甘露糖受体具有亲和力,具有肿瘤微环境黏附性和滞留性。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有以下优势:
(1)甘露聚糖肽增强凝胶的肿瘤黏附性:甘露聚糖肽中的甘露聚糖与肿瘤细胞及周边大量浸润的巨噬细胞均过表达的甘露糖受体具有极高亲和力,透明质酸与肿瘤细胞CD
(2)甘露聚糖肽增强巨噬细胞外泌体的分散稳定性:同样得益于甘露聚糖肽与巨噬细胞外泌体表面甘露糖受体的亲和力,显著提升外泌体在凝胶中的分散稳定性。在极低凝胶质量浓度时,本发明即可实现在巨噬细胞外泌体在体系中分散均匀、长期不聚沉。
(3)甘露聚糖肽凝胶化有助于药物在肿瘤的局部控释:利用甘露聚糖肽的结构中碱性多肽链的氨基设计制备席夫碱型水凝胶,不仅具有酸敏降解、可注射、自愈合等优点,可以在肿瘤微酸性环境自降解,缓释甘露聚糖肽和阿霉素-外泌体,从而克服了甘露聚糖肽和阿霉素-外泌体局部注射时药物分布不均匀、代谢快等缺陷。
(4)巨噬细胞外泌体M1极化进一步增强肿瘤靶向渗透性:与未极化的巨噬细胞外泌体相比,M1型巨噬细胞外泌体具有显著的肿瘤与肿瘤炎症趋向性,可协助其包载的药物阿霉素进一步靶向渗透至肿瘤中心区域。
(5)外泌体凝胶复合物显著增强抗肿瘤疗效:基于上述特性,外泌体凝胶复合物在肿瘤原位给药后,可酸敏降解,缓释甘露聚糖肽和药物-M1型巨噬细胞外泌体,靶向渗透至肿瘤及肿瘤炎症区域,激活肿瘤免疫,协同杀伤肿瘤。
附图说明
图1为本发明中外泌体凝胶复合物的结构示意图;
图2为本发明中外泌体凝胶复合物的制备示意图;
图3为本发明中外泌体凝胶复合物的可注射性能展示图;
图4为本发明中M1型巨噬细胞外泌体的TEM图;
图5为本发明中阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体的TEM图;
图6为本发明中M1型巨噬细胞外泌体和阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体的粒径示意图;
图7为本发明中流变仪验证甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶的胶体性质;
图8为本发明中SEM显示甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶具有疏松多孔的网状结构;
图9为本发明中外泌体水凝胶复合物的分散稳定性;
图10为本发明中空白甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶对不同细胞系的毒性;
图11为本发明中阿霉素各制剂(DOX、DOX@exos、DOX@M1-exos-HA-gel和DOX@M1-exos-OHA/Man gel)对4T1细胞的细胞毒性;
图12为本发明中甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶的降解曲线;
图13为本发明中甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶中外泌体的释放曲线;
图14为本发明中甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶的肿瘤黏附性实验;
图15为本发明中甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶中甘露聚糖肽对巨噬细胞NO产生量的作用;
图16为本发明中甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶中甘露聚糖肽对巨噬细胞吞噬率的影响;
图17为本发明中阿霉素各制剂在肿瘤局部注射不同时间点的肿瘤组织的阿霉素蓄积情况图;
图18为本发明中经各制剂治疗后不同时间点小鼠的肿瘤体积变化图;
图19为本发明中经各制剂治疗后不同时间点小鼠的体重曲线;
图20为本发明中经各制剂治疗后小鼠肿瘤组织的HE切片;
图21为本发明中经各制剂治疗后小鼠肿瘤组织的Ki67切片;
图22为本发明中经各制剂治疗后小鼠肿瘤组织的CD31切片;
图23为本发明中经各制剂治疗后小鼠心脏组织的HE切片;
图24为本发明中经各制剂治疗后小鼠肝脏组织的HE切片;
图25为本发明中经各制剂治疗后小鼠肾脏组织的HE切片;
图26为本发明中经各制剂治疗后小鼠肾脏指标血尿素氮(BUN)值;
图27为本发明中经各制剂治疗后小鼠肾脏指标肌酐(CRE)值;
图28为本发明中经各制剂治疗后小鼠肝脏指标血谷草转氨酶(AST)值;
图29为本发明中经各制剂治疗后小鼠肝脏指标谷丙转氨酶(ALT)值。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
以上附图和以下实施例中,DOX表示阿霉素;Man表示甘露聚糖肽;M1-exos表示M1型巨噬细胞外泌体;HA表示透明质酸,OHA表示氧化透明质酸,DOX@M1-exos表示阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体;DOX@exos表示阿霉素-巨噬细胞外泌体;DOX@M1-exos-HA gel表示负载阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体的交联透明质酸凝胶;DOX@M1-exos-OHA/Man gel表示负载阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体的甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶;OHA/Man gel表示空白甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶;HA gel表示交联透明质酸凝胶;CS gel表示壳聚糖-戊二醛水凝胶;OHA/CS gel表示氧化透明质酸-壳聚糖水凝胶。
实施例1:负载阿霉素-M1型RAW264.7巨噬细胞外泌体的甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶的制备与表征
(1)10%胎牛血清的高糖DMEM培养基和1%双抗条件下,在含5%CO
(2)避光条件下,将阿霉素超声溶解于1×PBS中,按质量比1:2与M1-巨噬细胞外泌体混合均匀,加入电穿孔比色杯,使用电穿孔法,按照设定参数(电压1000V,放电时间5ms,放电次数1次)进行载药。所得样品置于细胞培养箱孵育60min后,150000g超速离心90min,沉淀用1×PBS重悬;150000g离心90min,沉淀用100μL 1×PBS悬起,得阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体(DOX@M1-exos),酶标仪测定阿霉素载药量。
(3)配制2%(W/V)的透明质酸(分子量100kDa)溶液,缓慢滴加4.4%(W/V)的高碘酸钠溶液,搅拌均匀,室温避光反应24h。加入2mL乙二醇搅拌1h以终止氧化反应。将上述混合液加入透析袋(截留分子量3500Da),透析1周,冻干得氧化透明质酸(OHA)。将阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体与6%(W/V)甘露聚糖肽(分子量72kDa)溶液混合后,再加入与甘露聚糖肽溶液等体积的6%(W/V)氧化透明质酸溶液混合均匀,室温反应30s,形成载阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体的甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶(DOX@M1-exos-OHA/Man gel),结构示意图见图1,形成示意图见图2,可注射性能演示图见图3。
(4)使用透射电镜(TEM)证明步骤1所得M1-巨噬细胞外泌体(图4)和步骤2所得的阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体(图5)具有典型的外泌体囊泡型结构,酶标仪测定外泌体中DOX载药量为8.79%。使用粒径仪测定步骤1所得M1-巨噬细胞外泌体和步骤2所得的阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体的粒径(图6),粒径在70~100nm范围。
(5)使用流变仪证明步骤(3)所得物具有胶体性质(图7),证明本发明成功合成席夫碱水凝胶;使用扫描电子显微镜(SEM)对水凝胶进行微观成像(图8),可见水凝胶具有疏松多孔的微观结构。
实施例2:负载阿霉素-M1型骨髓来源巨噬细胞外泌体的甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶的制备与表征
(1)取4~6周龄小鼠腿骨,PBS缓冲液冲出骨髓,离心;使用ACK裂解红细胞,DMEM培养基离心。以高糖DMEM培养基(10%胎牛血清,M-CSF 20ng/ml)1.5ml六孔板培养3天,洗去漂浮细胞,更换新培养基,得到贴壁的小鼠骨髓来源巨噬细胞。10%胎牛血清的高糖DMEM培养基和1%双抗条件下,在含5%CO
(2)避光条件下,将阿霉素超声溶解于1×PBS中,按质量比1:1与M1-巨噬细胞外泌体混合均匀,加入电穿孔比色杯,使用电穿孔法,按照设定参数(电压700V,放电时间10ms,放电次数1次)进行载药。所得样品置于细胞培养箱孵育60min后,150000g超速离心90min,沉淀用1×PBS重悬;150000g离心90min,沉淀用100μL 1×PBS悬起,得阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体,酶标仪测定DOX载药量。
(3)配制2%(W/V)的透明质酸(分子量200kDa)溶液,缓慢滴加4.4%(W/V)的高碘酸钠溶液,搅拌均匀,室温避光反应24h。加入2mL乙二醇搅拌1h以终止氧化反应。将上述混合液加入透析袋(截留分子量3500Da),透析1周,冻干得氧化透明质酸(OHA)。将阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体与10%(W/V)甘露聚糖肽(分子量51kDa)溶液混合后,再加入与甘露聚糖肽溶液等体积的8%(W/V)氧化透明质酸溶液混合均匀,室温反应30s,形成载阿霉素-M1型巨噬细胞外泌体的甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶。
实施例3:外泌体凝胶复合物的分散稳定性、生物安全性、降解性能和释药曲线
(1)将实施例1中制备的阿霉素-M1型RAW264.7巨噬细胞外泌体超声分散于市售交联透明质酸凝胶(HA gel,华熙生物,货号TL100,中国专利ZL2015101091144)中,制备DOX@M1-exos-HA gel。为考察DOX@M1-exos在甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶和普通交联透明质酸凝胶的分散稳定性,将配置好的DOX@M1-exos-HA-gel和DOX@M1-exos-OHA/Man gel置于4℃冰箱,分别于0d和7d观察样本情况,如图9所示,7d后普通交联透明质酸凝胶中的DOX@M1-exos出现聚集和沉淀现象,而甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶中的DOX@M1-exos分散均匀,推测由于巨噬细胞外泌体表面甘露糖受体与凝胶中的甘露聚糖具有良好的亲和性,显著增加了DOX@M1-exos在凝胶中的分散稳定性。
(2)将6%(W/V)甘露聚糖肽溶液与6%(W/V)氧化透明质酸溶液混合均匀,室温反应一定时间,制备空白甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶(OHA/Man gel)。为考察空白甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶细胞毒性,将4T1细胞、RAW264.7细胞分别接种于96孔板上,贴壁后分别给予不同质量的空白甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶,孵育48h,用MTT法测定细胞存活率。该实施例的结论请参阅图10,如图10所示,空白凝胶对细胞也没有明显毒性,体现了凝胶良好的生物安全性。
(3)考察游离DOX、DOX@exos、DOX@M1-exos-HA-gel和DOX@M1-exos-OHA/Man gel对4T1细胞的毒性,将4T1细胞接种于96孔板上,贴壁后分别给予上述制剂组,孵育48h,用MTT法测定细胞存活率。该实施例的结论请参阅图11,如图11所示,DOX@M1-exos-OHA/Man gel对4T1细胞具有明显的细胞毒性,IC
(4)考察甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶和普通交联透明质酸凝胶在不同pH条件下的降解性能,将上述两种水凝胶分别浸泡于不同pH的PBS溶液中,于不同时间点称重并记录,并定期更换PBS溶液。质量损失率(mass loss ratio)的计算公式如下:η
(5)为了评价本发明所述的甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶在体外生理条件下释放外泌体的能力,以Dir标记外泌体,采用transwell小室考察外泌体释放。将实施例1中制备的凝胶外泌体置于上室,以100mL的pH 7.4的PBS缓冲液为释放介质。在37℃、100r/min条件下释放,酶标仪测定各时间点下室外泌体荧光含量,该实施例结论请参阅图13,如图13所示,甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶具备明显的酸敏释药和缓释特征,pH5.0时,外泌体在7d内几乎完全释放。
(6)为了评价本发明所述的甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶的体内肿瘤黏附性,首先参考文献合成了2种基于席夫碱的自组装凝胶:壳聚糖-戊二醛水凝胶(CS-gel)和氧化透明质酸-壳聚糖水凝胶(OHA CS gel)。CS-gel配方为3%wt壳聚糖和3%wt戊二醛,OHA/CS gel配方为3%wt壳聚糖和6%wt氧化透明质酸,进一步制备Dir修饰的水凝胶。将4T1细胞(10
实施例4:外泌体凝胶复合物对巨噬细胞活性的影响
(1)为考察空白甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶对巨噬细胞产生NO的影响,以RPMI1640培养基冲洗小鼠腹腔,收集腹腔巨噬细胞,细胞铺板后6h洗去未贴壁细胞,加入各制剂组后(甘露聚糖肽浓度200μg/mL)培养24h,采用Griess反应测定NO生成量,该实施例结论请参阅图15,如图15所示,空白凝胶可能诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO,增强巨噬细胞活性。
(2)为考察空白甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶对巨噬细胞吞噬功能的影响,SPF小鼠皮下注射各制剂组,7d后,每只小鼠腹腔注射2%鸡红细胞悬液1mL,30min后颈椎脱臼处死小鼠,固定于鼠板上,正中剪开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水2mL,轻轻转动鼠板1min,然后吸出腹腔溶液1mL,分滴于2片载玻片上,放于垫有湿纱布的搪瓷盒内37℃孵育30min,生理盐水漂洗、晾干,以1:1丙酮甲醇溶液固定,Giemsa染液染色3min,再以蒸馏水漂洗、晾干,用空白甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶高倍镜观察并记录吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数及被吞噬的鸡红细胞数,计算吞噬率。该实施例结论请参阅图16,如图16所示,空白甘露聚糖肽-透明质酸水凝胶可通过增强巨噬细胞的吞噬功能来调节机体的免疫。
实施例5:外泌体凝胶复合物的体内肿瘤蓄积评价
将4T1细胞(10
实施例6:外泌体凝胶复合物的体内治疗学实验
将4T1细胞(10
最后应说明的是,以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明上述技术方案的前提下,还可以做出若干改进或同等替换,这些改进和等同替换也应视为本发明的保护范围。
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