一种重组人神经生长因子的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程范畴，涉及用基因工程方法制备高纯度、高活性、无修饰的重组人神经生长因子。

背景技术

Oxervate(cenegermin，重组人神经生长因子，rhNGF)是意大利制药商Dompé原研的一款滴眼液，是一种用于中度至重度神经营养性角膜炎(neurotrophic keratitis，NK)成人患者的治疗的孤儿药，目前已在欧盟和美国上市。另外，其用于治疗阿尔兹海默症的适应症也在研发中。

为了制备重组人神经生长因子，原研厂商首先表达proNGF包涵体，然后再变复性，纯化proNGF复性液，酶切纯化得到重组人神经生长因子。然而，该方法需要酶切，酶切后还需要纯化，步骤较多，过程较为繁琐。

因此，研究人员一直希望找到一种简单的、能够直接变复性的方法。Collins,etal.(US5,986,070)发明了一种rhNGF直接变复性的方法，其采用Tris作为缓冲液，在8M尿素条件下变性，在8M尿素条件下复性，这种方法获得了高活性的rhNGF。但是，这种方法获得的rhNGF经质谱测定，有许多分子量与rhNGF接近的杂质，这些杂质可能是rhNGF的修饰产物。由于修饰后的rhNGF和未修饰的rhNGF的分子量和性质都非常接近，这给后续分离纯化造成了困难，常规方法很难分开，即使分开，收率也较低。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种高纯度、高活性、无修饰的重组人神经生长因子的制备方法。本申请的发明人在对rhNGF的长期研究中发现，当采用碳酸氢铵(NH

为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

本发明提供了一种重组人神经生长因子的制备方法，包括以下步骤：

(a)在大肠杆菌中表达并分离重组人神经生长因子的包涵体；

(b)使用包涵体洗涤液洗涤所述包涵体；

(c)加入变性液溶解所述包涵体；

(d)加入复性液进行包涵体复性；

(e)纯化获得重组人神经生长因子；

其中，所述步骤(d)采用碳酸氢铵作为缓冲液。

重组人神经生长因子的包涵体可以采用商业化的或已知的大肠杆菌蛋白表达系统进行表达并分离。根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(a)包括以下步骤：人神经生长因子氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，全基因合成人神经生长因子基因，插入载体，转化大肠杆菌，表达，碎菌，离心，收集沉淀。根据本发明的一个优选实施方式，所述载体为pET28a，所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)plyss，所述表达为IPTG诱导表达，所述碎菌为超声碎菌或匀浆机破碎等。

在分离重组人神经生长因子的包涵体后，可以使用包涵体洗涤液洗涤包涵体以去除杂质，本申请的发明人对包涵体的洗涤液的组合进行了各种尝试以筛选特别适用于本发明的重组人神经生长因子的包涵体的洗涤方案。根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(b)包括以下步骤：使用包涵体洗涤液A重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，其中，所述包涵体洗涤液A包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，0.5-3％Triton X-100，pH8.0-8.5；使用包涵体洗涤液B重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，其中，所述包涵体洗涤液B包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，1-4M尿素，pH 8.0-8.5；再使用包涵体洗涤液C重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，其中，所述包涵体洗涤液C包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，pH 8.0-8.5。更优选的，所述步骤(b)包括以下步骤：使用包涵体洗涤液A重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，重复该洗涤步骤一次，其中，所述包涵体洗涤液A包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100，pH8.5；使用包涵体洗涤液B重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，重复该洗涤步骤一次，其中，所述包涵体洗涤液B包括50mMTris，100mM NaCl，5mM EDTA，2M尿素，pH 8.5；再使用包涵体洗涤液C重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，重复该洗涤步骤一次，其中，所述包涵体洗涤液C包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5。

在纯化重组人神经生长因子的包涵体后，需要对包涵体进行变性和复性步骤以获得具有正确折叠形式和生物活性的目的蛋白。

根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(c)包括以下步骤：在包涵体中加入变性液，所述变性液包括8M尿素和15-25mM柠檬酸，pH 2.8-3.2，所述包涵体与所述变性液按照湿重：体积为1：20-30比例加入变性液，溶解后离心去除沉淀。根据本发明的一个优选实施方式，所述变性液包括8M尿素和20mM柠檬酸，pH 3.0，所述包涵体与所述变性液按照湿重：体积为1：25比例加入变性液。

根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(d)包括以下步骤：在变性液中加入1/4体积0.8-1.0M碳酸氢铵pH8.0-9.0和8M尿素溶液，加入DTT至终浓度为5-10mM，25-37℃30-60min；再加入氧化型谷胱甘肽至终浓度为20-40mM，25-37℃10-15min；再加入19倍体积稀释缓冲液，所述稀释缓冲液包括50-150mM Na

在包涵体变性和复性后，可以采用已知的层析系统纯化目的蛋白。根据本发明的一个实施方式，所述步骤(e)包括SP纯化和C4反相层析的步骤。

本发明的有益效果：

1、操作简单，不需要酶切，步骤较少，所得产品杂质少，纯度高；

2、本发明的方法没有破坏目标蛋白的生物活性，所得产品可以作为候选药物。

本发明提供了一种重组人神经生长因子的制备方法，杂质少，纯度高，生物活性好，可以作为治疗药物，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明表达产物的SDS-PAGE图谱，其中，M表示蛋白Marker，US和UP分别表示未诱导表达的菌株的上清和沉淀，IS和IP分别表示IPTG诱导表达的菌株的上清和沉淀。

图2为本发明IPTG诱导表达产物的SDS-PAGE图谱，其中，M表示蛋白Marker。

图3为本发明目标蛋白质谱图谱，其中，rhNGF分子量为13261.65。

图4为本发明目标蛋白质谱图谱，其中，rhNGF分子量为13261.71。

图5为本发明目标蛋白促进TF1细胞繁殖图谱，其中，NGF表示商品化rhNGF促进TF1细胞生长图谱，NH

具体实施方式

以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，但不以任何形式限制本发明。

除特别注明外，以下实施例中使用的原料组分皆市售可得。

实施例1：rhNGF包涵体的制备

1.1rhNGF表达菌株构建

人神经生长因子成熟肽NGF去掉C端两个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，按照大肠杆菌密码子偏好优化密码子，全基因合成人神经生长因子基因，其基因序列如SEQID NO:2所示，插入pET28a多克隆位点(MCS)XbaⅠ和XhoⅠ，构建质粒hNGFpET28a。利用强启动子T7表达蛋白。将质粒hNGFpET28a用42度热激转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)plyss(购于promega公司)，对两个菌落进行IPTG诱导表达，超声碎菌，离心12000rpm×5min，表达产物上清和沉淀的SDS-PAGE图谱如图1所示。将种子菌液加入15％甘油制备甘油菌于-80度保存。

1.2IPTG诱导表达

将甘油菌种按体积比为1：1000比例接种含抗性培养基，37度，180rpm培养过夜；将种子液按照体积比为1：100比例接种含抗性培养基，37度，180rpm培养到OD600为0.3-0.8；加入IPTG使终浓度为1mM，25度，170rpm，继续培养18小时；离心8500rpm×10min，去除上清，收集菌体；取样，超声碎菌，沉淀进行SDS-PAGE检测，诱导表达产物的SDS-PAGE图谱如图2所示。

1.3包涵体的分离

菌体与碎菌液(2mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5)按照湿重：体积为1：5-1：10比例加入碎菌液，超声2s间隔3s，功率(power)80％，5min，重复超声步骤四次，4℃离心12000rpm×15min，收集沉淀。

1.4包涵体的纯化

使用包涵体洗涤液A(50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100，pH8.5)重悬包涵体，超声2s间隔3s，功率(power)80％，5min，重复超声步骤一次，4℃离心12000rpm×15min，收集沉淀。重复该洗涤步骤一次。

使用包涵体洗涤液B(50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，2M尿素，pH 8.5)重悬沉淀，超声2s间隔3s，功率(power)80％，5min，重复超声步骤一次，4℃离心12000rpm×15min，收集沉淀。重复该洗涤步骤一次。

再使用包涵体洗涤液C(50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5)重悬沉淀，超声2s间隔3s，功率(power)80％，5min，重复超声步骤一次，4℃离心12000rpm×15min，收集沉淀。

实施例2：rhNGF包涵体在碳酸氢铵中变复性及纯化

2.1包涵体的变性

将实施例1中的包涵体沉淀与变性液(8M尿素，20mM柠檬酸，pH 3.0)按照湿重：体积为1：25比例加入变性液，溶解后离心去除沉淀。

2.2包涵体的复性

在变性液中加入1/4体积1M碳酸氢铵pH8.5和8M尿素溶液，加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为5mM，25℃30-60min；再加入氧化型谷胱甘肽至终浓度为20mM，25℃10-15min；再加入19倍体积稀释缓冲液(100mM Na

同时设立对照样品，区别在于在变性液中加入1/4体积1M Tris pH8.5和8M尿素，其他条件均相同。

2.3纯化

2.3.1SP纯化

SP柱：SP XL 1ml GE公司

上样：缓冲液组成20mM NaAc pH 5.0，电导4.5

洗脱条件：梯度洗脱

A：20mM NaAc pH 5.0

B：20mM NaAc 2M NaCl pH 5.0

A到B 20min。

2.3.2C4反相层析

上样前蛋白用3K膜超滤浓缩至rhNGF终浓度为0.8-1.2/ml。

C4柱：Vydac 214TP 10μm C4 250×10mm

A：0.1％三氟乙酸H

B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液

层析条件：流速5ml/min

2.4质谱检测

质谱条件如下：

Waters公司UPLC-XEVO G2 Q-TOF液质联用系统。系统液相部分配置为：BSM二元高压混合泵，SM样品管理器，TUV紫外检测器；质谱部分配置为：ESI源，Q-TOF检测器。数据处理分析采用Masslynx V4.1及BiopharmaLynx分析软件(Version：1.2)。

液相条件

色谱柱：Mass PREPTM Micro Desalting Column 2.1×5mm(完整蛋白分子量分析)，柱温：80℃；

流动相A：0.1％FA-H

流动相B：0.1％FA-CAN

Seal Wash溶液：10％IPA

质谱清洗液：50％ACN

质谱IntelliStart阀清洗液：50％MeOH

进样体积：10μL

样品室温度：10℃

梯度洗脱条件：

质谱条件

MS数据均采用轮廓图(continuum)模式，在Resolution模式下采集；LockSpray采集模式为：实时采集并不应用校准。

校准溶液：实时校准(LockSpray)溶液：2ng/μL LE溶液；

质量轴的校正溶液：2μg/μL碘化钠溶液。

质谱参数

使用Tris缓冲液的对照样品制备的rhNGF质谱如图3所示，其中有许多与rhNGF分子量接近的杂质峰。而使用本发明的NH

实施例3：rhNGF生物活性测定

将实施例2中制备的rhNGF以及商品化的的rhNGF(购于义翘神州)通过TF1细胞增殖法测定生物活性。

实验步骤如下：

1.处于对数生长期的TF1细胞(ATCC@CRL-2003

2.计数TF1细胞，用含10％FBS的1640培养基悬浮到适当密度，接种到96孔板中，10000个/150μl/孔；

3.在96孔板中用1640培养基梯度稀释rhNGF样品，以三倍连续稀释9个梯度；将稀释好的样品加入96孔细胞培养板中，50μl/孔；96孔周围用200μl/孔的蒸馏水补齐；

4.在37℃、5％CO

5.3天后96孔细胞培养板每孔加入20μl CCK-8溶液，在37℃孵箱中继续培养8h；

6.混匀后酶标仪读OD450值，GraphPad Prism6进行数据分析，作图并计算EC50。

结果如图5所示，使用Tris缓冲液制备的rhNGF以及使用本发明的碳酸氢铵缓冲液制备的rhNGF和商品化的rhNGF一样可以使TF1细胞增殖，说明本发明方法制备的rhNGF具有优良的生物活性，可以作为候选药物。

序列表

<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司

<120> 一种重组人神经生长因子的制备方法

<130> 2019

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo

<400> 1

Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp

1 5 10 15

Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys

20 25 30

Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val

35 40 45

Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val

50 55 60

Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln

85 90 95

Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Ala Val Arg

115

<210> 2

<211> 407

<212> DNA

<213> Homo

<400> 2

tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac catgagtagc agccatccga 60

ttttccatcg cggcgagttt agcgtgtgcg atagcgtgag cgtttgggtg ggcgataaaa 120

ccaccgccac cgacatcaaa ggcaaggaag tgatggtgct gggcgaagtg aatattaata 180

atagcgtgtt taaacagtac ttttttgaaa ccaaatgccg cgatccgaat ccggtggata 240

gcggttgccg cggcattgac agcaagcact ggaacagcta ctgcacaacc acccatacct 300

tcgtgaaagc tttaaccatg gatggcaaac aagctgcttg gcgctttatt cgtatcgata 360

ccgcttgtgt gtgcgtgctg agccgcaaag cagtgcgttg actcgag 407