导航：首页> 发电、变电或配电>转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列及其特异性鉴定方法

转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列及其特异性鉴定方法

文献发布时间：2023-06-19 11:40:48

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列及其特异性鉴定方法。

背景技术

棉花是世界上最主要的经济作物之一，是纺织、精细化工等工业的原料和重要的战略物资。短季棉（Short season cotton）作为我国重要的棉花品种资源，能够很好地解决粮棉争地矛盾，同时在优化农业产业结构方面起重要的作用。早熟性是短季棉育种中一个重要的目标性状，是一个关系复杂的数量性状，受生育期、植株生长发育状态等多种因素的影响。开花时间直接影响着作物熟性，而花芽分化则影响着开花时间。因此，克隆开花相关基因，对其进行表达分析和转基因功能验证，可以为短季棉育种提供优质的基因资源。

随着生物技术的发展，转基因技术是进行作物重要性状改良的新途径，转基因育种的优势在于可以实现跨物种的基因发掘，拓宽遗传资源的利用范围，实现已知功能基因的定向高效转移，使生物获得人类需要的特定性状，为高产、优质、高抗农业生物新品种培育提供了新的技术途径。中国农业科学院棉花研究所从棉花中克隆得到GhSOCL1基因，利用农杆菌介导法将GhSOCL1基因的cDNA序列导入棉花品种中棉所24（国家审定GS08001-1997）中，可以获得转基因棉花植株FJ334；对照非转基因棉花品种，转GhSOCL1基因棉花FJ334植株表现为赘芽数量明显大量减少、株高增高、单株铃数增加、单铃重量增加等特点。

由于对转基因事件及其衍生品系或品种特异性检测，是实现转基因植物有效监督管理，保障转基因产业健康发展的重要技术手段。外源插入片段的侧翼序列和根据此侧翼序列建立的检测方法，是对转基因植物及其产品进行有效监管的一个重要依据。目前虽然已经有相关专利和文献报道了转基因植物外源插入侧翼序列，但是，关于转GhSOCL1基因棉花外源插入侧翼序列相关的文章和专利报道尚未发现。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列，包括左侧翼序列和/或右侧翼序列；所述左侧翼序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，所述右侧翼序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；所述左侧翼序列的第1~912位点序列来源于中棉所24的基因组序列，所述左侧翼序列的第913~1348位点序列来源于转GhSOCL1基因棉花的外源插入片段序列；所述右侧翼序列的第1~466位点序列来源于转GhSOCL1基因棉花的外源插入片段序列，所述右侧翼序列的第467~1269位点序列来源于中棉所24的基因组序列。

本发明实施例的另一目的在于提供一种转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列的特异性鉴定引物，所述的引物是依据上述的侧翼序列进行设计的。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述的引物包括第一引物和/或第二引物；所述第一引物包括依据左侧翼序列的第1~912位点序列进行设计的第一正向引物以及依据左侧翼序列的第913~1348位点序列进行设计的第一反向引物；所述第二引物包括依据右侧翼序列的第1~466位点序列进行设计的第二正向引物以及依据右侧翼序列的第467~1269位点序列进行设计的第二反向引物。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的第一正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；所述的第一反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的第二正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；所述的第二反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列的特异性鉴定试剂盒，其包括聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）预混液以及上述的引物。

本发明实施例的另一目的在于提供一种转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列的特异性鉴定方法，其包括以下步骤：

获取待检测样品的基因组DNA，作为DNA模板；

将DNA模板、PCR预混液以及上述的引物进行混合，得到PCR反应液；

将PCR反应液进行PCR扩增反应，得到PCR反应产物；

对PCR反应产物进行凝胶电泳检测，以判断所述PCR反应产物中是否存在特异性条带；若所述PCR反应产物中存在特异性条带，则所述待检测样品中含有转GhSOCL1基因棉花的成分。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的步骤中，凝胶电泳检测为琼脂糖凝胶电泳检测。

与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：

本发明实施例通过先确定转GhSOCL1基因棉花的外源插入片段的侧翼序列，并根据侧翼序列设计特异性引物，便可根据该引物与待检测样品的PCR产物中是否含有特异性扩增条带来判断待检测样品中是否含有转GhSOCL1基因棉花成分，该方法简便且可准确地检测出转GhSOCL1基因棉花，从而便于对转GhSOCL1基因棉花进行有效的监督管理。

附图说明

图1为本发明实施例提供的转GhSOCL1基因棉花的转化载体pBI121-GhSOCL1的结构图谱。

图2为本发明实施例7得到的凝胶电泳图。

图3为本发明实施例8得到的凝胶电泳图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，下述实施例中所涉及的设备和试剂未经特别注明的话，均是采用市售的设备和试剂。

实施例1

该实施例提供了一种转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列，其包括左侧翼序列；所述左侧翼序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，其长度为1348bp；所述左侧翼序列的第1~912位点序列来源于中棉所24的基因组序列，所述左侧翼序列的第913~1348位点序列来源于转GhSOCL1基因棉花的外源插入片段序列。其中，左侧翼序列是指转GhSOCL1基因棉花的外源插入片段左边界侧翼序列。

实施例2

该实施例提供了一种转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列，其包括右侧翼序列；所述右侧翼序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，其长度为1269bp；所述右侧翼序列的第1~466位点序列来源于转GhSOCL1基因棉花的外源插入片段序列，所述右侧翼序列的第467~1269位点序列来源于中棉所24的基因组序列。其中，右侧翼序列是指转GhSOCL1基因棉花的外源插入片段右边界侧翼序列。

另外，上述实施例1~2所提供的左侧翼序列和右侧翼序列的获取方法如下：

（1）提取转GhSOCL1基因棉花植株的基因组DNA：取转GhSOCL1基因棉花植株的幼嫩叶片放入离心管，并随后将样品放入液氮中，在打样机器上进行震荡打碎，得到样品；接着，向样品中中加入800µL经过65℃预热的十六烷基三甲基溴化铵裂解液，并同时加入β-巯基乙醇防止氧化，混匀至不明显分层后，再置于65℃条件下水浴40分钟，且每10min缓慢颠倒混匀一次；水浴后，加入800µL的体积比为24:1的氯仿/异戊醇混合液，反复颠倒，至不分层为止；然后，置于4℃条件下，12000rpm离心10分钟；用无尖的枪头吸取上清液，约600µL，并转移至另一个2mL离心管；加入0.8倍体积的冰冷异丙醇，轻轻颠倒数次，直至有絮状DNA生成后，再经12000rpm离心1分钟，将冰冷异丙醇倒掉；再加入75%乙醇清洗3次，无水乙醇洗1次；倒掉无水乙醇，干燥后，加入200µL的ddH

（2）委托北京贝瑞和康生物技术有限公司对上述转GhSOCL1基因棉花植株的基因组DNA进行重测序分析，具体的，转GhSOCL1基因棉花植株的基因组DNA检测合格后，用机械打断的方法（超声波）将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq平台进行测序；将下机数据进行过滤得到Clean Data，然后把reads比对到指定的参考基因组棉花基因组数据库（http://www.cottonfgd.org/）中Gossypium hirsutum（AD1），NAU assembly数据库和插入序列上得到的Mapped Data，用于外源插入片段查找。具体查找方法为：首先，找到read当中既含有参考基因组和插入序列的junction reads；然后，根据junction reads的比对信息确定插入位置和方向；最后，对这些reads进行聚类确定插入位置和长度，以及是否存在成对的junction clusters。根据比对结果找出下列两类Paired_end reads：第一类为一端reads比对上参考基因组序列，另一端reads比对上插入序列；第二类为两端中任何一端reads一部分序列比对上参考基因组序列，另一部分比对上插入序列。采用BWA比对参考基因组，选取能比对上外源插入序列的全部reads，进行局部组装。根据组装的contig使用Blastn分别比对外源插入序列和参考基因组结果，选取contig序列比对到染色体的区域，并对这些区域的bwa比对结果进行IGV截图验证，获得外源插入片段插入位置信息。经验证，转GhSOCL1基因棉花的外源插入片段的插入位置为中棉所24的D07染色体30270907，并获得插入位点在参考棉花基因组中的上游和下游长度为1901bp的序列，其中棉所24的30270907~30270998位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

（3）根据转GhSOCL1基因棉花外源插入片段序列以及插入位点在棉花参考基因组中上、下游序列，设计PCR检测引物。其中，转GhSOCL1基因棉花左边界侧翼序列扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:4~5所示，分别为：5’-TGCTCTCGATATCGCACACT-3’和5’-AGATTGTCGTTTCCCGCCTT-3’；转GhSOCL1基因棉花右边界侧翼序列扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:6~7所示，分别为：5’-TGATGGTTCACGTAGTGGGC-3’和5’-ATGTTCGTGCCCGTGTAACT-3’。接着，以上述转GhSOCL1基因棉花植株的基因组DNA为DNA模板，分别利用上述两组引物进行PCR扩增反应，得到两组PCR扩增产物，其中，PCR反应体系（10uL）为：PCR预混液5µL；引物对0.8µL（2个引物各0.4µL）；DNA模板2µL；ddH

实施例3

该实施例提供一种转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列的特异性鉴定引物，所述的引物是依据上述实施例1提供的左侧翼序列进行设计的。具体的，该引物包括第一引物；所述第一引物包括依据左侧翼序列的第1~912位点序列进行设计的第一正向引物以及依据左侧翼序列的第913~1348位点序列进行设计的第一反向引物；其中，第一正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示，为：5’-TGCTCTCGATATCGCACACT-3’；所述的第一反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示，为：5’-AGATTGTCGTTTCCCGCCTT-3’。

实施例4

该实施例提供一种转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列的特异性鉴定引物，所述的引物是依据上述实施例2提供的右侧翼序列进行设计的。具体的，该引物包括第二引物；所述第二引物包括依据右侧翼序列的第1~466位点序列进行设计的第二正向引物以及依据右侧翼序列的第467~1269位点序列进行设计的第二反向引物；其中，所述的第二正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示，为：5’-TGATGGTTCACGTAGTGGGC-3’；所述的第二反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示，为：5’-ATGTTCGTGCCCGTGTAACT-3’。

实施例5

该实施例提供了一种转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列的特异性鉴定试剂盒，其包括PCR预混液以及上述实施例3提供的引物。其中，PCR预混液可采用现有市售的2*TaqMasterMix（Dye）。

实施例6

该实施例提供了一种转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列的特异性鉴定试剂盒，其包括PCR预混液以及上述实施例4提供的引物。其中，PCR预混液可采用现有市售的2*TaqMasterMix（Dye）。

实施例7

该实施例的提供了一种用于检测待检测样品中是否含有转GhSOCL1基因棉花的方法，该方法是利用上述实施例5提供的试剂盒进行检测的，具体包括以下步骤：

（1）按照上述转GhSOCL1基因棉花植株的基因组DNA的提取方法，提取待检测样品的基因组DNA，作为DNA模板。

（2）将2µL的DNA模板、5µL的PCR预混液、0.4µL的第一正向引物、0.4µL的第一反向引物以及2.2µL的ddH

（3）将PCR反应液置于PCR仪中进行PCR扩增反应，即可得到PCR反应产物；其中，PCR反应条件为：预变性94℃、2min，变性94℃、30S，退火55℃、30S，延伸72℃、30S，共30个循环；终延伸72℃、2min，4℃保存。

（4）对上述PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并利用核酸染料进行染色，以判断该PCR反应产物中是否存在特异性条带；若所述PCR反应产物中存在特异性条带，则所述待检测样品中含有转GhSOCL1基因棉花的成分。其中，这里的转GhSOCL1基因棉花的成分包括其亲本、衍生品系的植株、组织和种子等。

利用该方法分别对转GhSOCL1基因棉花的叶片、转GhSOCL1基因棉花的种子、转GhSOCL1基因棉花的种子的根、未转基因的中棉所24、中棉所50、玉米、小麦等样品进行检测，并以清水作阴性对照组，其检测得到的凝胶电泳图如附图2所示，图中，M为DNA分子量标准（DL5000），1为转GhSOCL1基因棉花的叶片，2为转GhSOCL1基因棉花的种子，3为转GhSOCL1基因棉花的根，4为未转基因的中棉所24，5为中棉所50，6为玉米，7为小麦，8为清水。从图中可以看到，只有转GhSOCL1基因棉花的叶片、种子和根的样品产生了长度为724bp的特异性扩增条带，其余样品均未产生特异性扩增条带，说明本发明实施例提供的检测方法可以准确地检测出样品中是否为转GhSOCL1基因棉花或者含有转GhSOCL1基因棉花成分。

实施例8

该实施例的提供了一种用于检测待检测样品中是否含有转GhSOCL1基因棉花的方法，该方法是利用上述实施例6提供的试剂盒进行检测的，具体包括以下步骤：

（1）按照上述转GhSOCL1基因棉花植株的基因组DNA的提取方法，提取待检测样品的基因组DNA，作为DNA模板。

（2）将2µL的DNA模板、5µL的PCR预混液、0.4µL的第二正向引物、0.4µL的第二反向引物以及2.2µL的ddH

利用该方法分别对转GhSOCL1基因棉花的叶片、转GhSOCL1基因棉花的种子、转GhSOCL1基因棉花的种子的根、未转基因的中棉所24、中棉所50、玉米、小麦等样品进行检测，并以清水作阴性对照组，其检测得到的凝胶电泳图如附图3所示，图中，M为DNA分子量标准（DL5000），1为转GhSOCL1基因棉花的叶片，2为转GhSOCL1基因棉花的种子，3为转GhSOCL1基因棉花的叶片的根，4为未转基因的中棉所24，5为中棉所50，6为玉米，7为小麦，8为清水。从图中可以看到，只有转GhSOCL1基因棉花的叶片、种子和根的样品产生了长度为502bp的特异性扩增条带，其余样品均未产生特异性扩增条带，说明本发明实施例提供的检测方法可以准确地检测出样品中是否为转GhSOCL1基因棉花或者含有转GhSOCL1基因棉花成分。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 转GhSOCL1基因棉花插入位点的侧翼序列及其特异性鉴定方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1901

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attacaatat cacatatact taccatttgg ctgaatttag accttcatat actcatatac 60

tttcatttac ctcatataaa ttttattatc acgattgaag taactaactt accttgatat 120

catgtattat tcaaccattg catacttgac ctatcatgta ctaaataatt ggtcgagacc 180

ataataaagt tgcacaatta gtgctctttc tcatctaacc aaattgctct cgatatcgca 240

cacttagtcc ctgttattca acatcatcat tttaatttcg cacacttagt gcccattatt 300

caacatcgtc attttagttt cgcacactta gtgtcgttca tatagctgta gctatcccat 360

actcgcacac ttagtgctaa atattgataa attcattcat gtctatttct actttccgac 420

taaaacatac tcagctatat atatatttgc atactttcat ttcggcatat ataagtaata 480

tttatttaga aattatagca tctatttgat tataatctta cctcggatag tgataaaccg 540

gaacagaacg atcaatcaac gactttattt tttccctgat ccaagttcga tttctttaat 600

tcatgatcta aacacattca aatttaactc attcaaacat aatttcatcc aatttcatcc 660

aaaaacacat aattgggtaa cttaccattt tacccctgat atttaacatt tttacaattc 720

agtccaaatt gcacaaaaca aaaaatattc caaattaatc acaatgtagt ttggtcggat 780

attccctagt ctcatatagg tccttgcatg tcgtttattt cacaatttag tccctcaatt 840

taatatttct tacaatttaa ctcaaaataa tcaaattcat caaaaattca aaaacaaaca 900

ttataatcta ttacatatct tttattttct accatcaacc aacaaaaatc acaaactatc 960

atcaatggca catcacaaaa tcgtcataaa ttccaaaaat taaagcatga attttgaaga 1020

acacgaagca ataatctcag aaacataaaa attataaaaa aacgattaaa aactaacctt 1080

aatttaagct caaccaaggc cgaatataac aaagcttcaa ctatttctat ttctttcaac 1140

attcggtgat ggtggatgaa caatccacta acatttttta ttttttatta ttataatata 1200

cgagcatgtg gcttggtcgt gtgacccaac ttcaaaagtt acacgggcac gaacataggc 1260

tgggacacgg ccgtgtgtct taggtcgtgt gtccctattt tgattgttac aaggcctaag 1320

acaagggtgt gtgtctcagc cgtgtgagtc acacagccta ggcacacgac cgtgtgaccc 1380

ctgcagttca aattttctaa atttttccag aactttttga atgattccaa tttagtccct 1440

aattgtttct aaagtgtttt tagggcatcg aaggctcgat taagggacta tatgcatgta 1500

gatgaactat ctatgccatg tttatgttga ggtactaaat gtatgtttta aagttaaaat 1560

tttatgataa tgctctgtga cactattttg acgatggata cggattaggg gtgttacaat 1620

tatattatag aggactaggt caaaaagacc taggaagtac aagtgattga aattgatgtg 1680

agagaggccc aaaacccctc atagaacatg aagggggagg aaaccctagt agaaatacaa 1740

gggtgggacg ttcacccctc tcctactcta agaaggatgt tgtttttctg tttaaaataa 1800

acttctacaa ctctacaagg gttctacctt ttattcctat aaatatctgg caccagtaga 1860

gctatttaca caacttttaa gcgattatca ttctatcgaa a 1901

<210> 2

<211> 1348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2