一种利用放射菌酮调控动物卵母细胞细胞周期的方法

技术领域

本发明涉及细胞周期调控技术领域，尤其是涉及一种利用放射菌酮调控动物卵母细胞细胞周期的方法。可以广泛用于各种哺乳动物(包括人类)卵母细胞的体外成熟以及卵母细胞的长距离运输。

背景技术

动物的胚胎体外生产技术，也就是试管动物生产技术，主要包括卵母细胞的体外成熟、成熟卵母细胞的体外受精和体外受精后的胚胎体外培养三项部分组成。1978年世界上第一位“试管婴儿”的降生，这不仅为克服人类及哺乳动物的不孕与不育开辟了新的途径，而且也为在体外条件下研究观察卵母细胞的成熟，受精以及胚胎的发育提供了可能。因此，在过去的30多年里各种动物的胚胎体外生产技术有了飞速地发展。

但遗憾的是，30多年来动物胚胎体外生产的总效率并没有显著地提高，特别是在牛、羊和猪上。有很多因素可以影响动物体外胚胎的生产效率，如培养液的成份，培养条件与体内胚胎发育的条件相比还不完美、卵母细胞及精子的质量好坏等。但卵母细胞的质量不稳定是一个最主要的限制因素。卵母细胞的质量受细胞供体动物的影响很大，如品种、地理环境﹑营养条件、管理水平、季节、性周期等。不仅如此，由于卵母细胞主要来源于屠宰场废弃的动物卵巢上的卵泡，或是直接采自人类或活着动物卵巢上的卵泡。所以，这些卵母细胞在采集后处于不同的生长阶段，也就是说，这些细胞的发育阶段是不同期的，具有不同的发育潜力。另外，由于目前的成熟培养液，特别是激素的使用，使一部分卵母细胞在成熟过程中卵母细胞的核与质成熟不同期。一般情况下，卵母细胞细胞质的成熟往往要滞后于细胞核的成熟，即卵母细胞细胞核与质的成熟不同期，从而导致卵母细胞无法正常受精。综上所述，除了影响卵母细胞质量的外部因素以外，采集卵母细胞群体发育期的不同期和单个卵母细胞核与质成熟不同期是令全世界科学家伤脑的两大难题，同时也是制约动物卵母细胞成熟效率的主要因素。因此，解决这两大难题就意味着找到了提高动物体外胚胎生产效率的“金钥匙”。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用放射菌酮调控动物卵母细胞细胞周期的方法，操作简单，可以改善细胞同期化，提高受精效果。

为实现上述目的，本发明提供了一种利用放射菌酮调控动物卵母细胞细胞周期的方法，其中，调控溶液由1-50微克/毫升放射菌酮组成。

优选的，一种利用放射菌酮调控动物卵母细胞细胞周期的方法，步骤如下：

S1、将40-50枚卵母细胞培养在含有500微升调控溶液中，进行培养；

S2、预处理的培养完成后，将卵母细胞转入正常的、不含放射菌酮，但添加促卵泡素(FSH)，促黄体素(LH)及雌二醇(E2)的成熟液中培养18-22小时，即可。

优选的，成熟液由M199培养液与10％体积的血清或牛血清白蛋白，或其它类似替代物组成。

优选的，成熟液中不含有FSH和LH激素。

优选的，培养条件为在38.5℃、5％CO

因此，本发明采用上述一种利用放射菌酮调控动物卵母细胞细胞周期的方法，具有如下技术效果：

(1)可以使卵母细胞的细胞周期同期化，同时改善单个卵母细胞的核和细胞质的同期化。与传统卵母细胞体外成熟方法相比，绝大多数卵母细胞经过CHX预处理后，到达成熟(马属动物第一次减熟分裂的中期，MI；其它哺乳动物包括人类，第二次减熟分裂的中期，MII)的时间明显提前。

(2)提高体外生产胚胎的总效率，改善胚胎质量，提高试管动物生产的总效率。

(3)便于运输卵母细胞。目前，卵母细胞冷冻保存技术仍处于研究阶段，而卵母细胞的寿命是有限的。因此，长时间运输会引卵母细胞受损，寿命减短，成熟率下降。本发明通过让卵母细胞的细胞周期停滞，相当于让细胞“休眠”，在运输的24小时之内，不仅不会造成卵母细胞的受损，而且还有利于提高卵母细胞的质量。另外，卵母细胞在运输的过程中不需要保存在低温的条件。只要需保持在25°-37℃温度即可。

(4)可以调整工作时。如果是在不适宜的时间得到卵母细胞，又必须要做体外成熟时，可以先把卵母细胞放入含有CHX溶液中保存，在24小时之内的任何时间，可以自由选择卵母细胞开始成熟的时间，从而避免在不适宜的时间工作，如周末、生病、节假日或临时有事。

(5)从科学的角度，这个方法使我们可以更好地了解卵母细胞成熟所需要的条件。因为体内卵母细胞发育的时间要少于体外成熟所需要的时间。这个方法使卵母细胞体外和体内成熟所需要时间的差距缩短，而且并影响卵母细胞的质量。为今后研究卵母细胞的体外成熟提供了一个新的思路，而目前大多数研究停留在如何改善卵母细胞的成熟液上。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1是在体外不同时间下、不同处理的卵母细胞成熟率示意图；

图2是不同处理下，卵母细胞体外受精后48小时的受精率示意图；

图3是卵母细胞体外受精48小时后，不同处理组的受精细胞分裂情况；

图4是不同处理下囊胚率的示意图；

图5是不同处理下平均每枚胚胎所含的细胞数。

具体实施方式

以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例一

(一)一种利用放射菌酮调控动物卵母细胞细胞周期的方法，步骤如下：

S1、将40-50枚羊卵母细胞培养在含有500微升，其中含有1-50微克/毫升放射菌酮，的成熟液中进行培养；

其中，成熟液由M199培养液与10％体积的血清组成，成熟液中不含有FSH和LH激素。

培养条件为在38.5℃下、5％CO

S2、预处理的培养完成后，将卵母细胞转入正常的、不含放射菌酮，但添加促卵泡素(FSH)，促黄体素(LH)及雌二醇(E2)的成熟液中培养18-22小时。

(二)当卵母细胞成熟完成后，将卵母细胞转入正常的受精液中。

S1、冷冻精子在40℃水浴中解冻10-l5秒，在受精液中稀释后，1500转/分钟，离心10分钟，去上清，混匀试管底部的精子后小心加入到45％、90％Percoll分离液的上层，进行密度梯度离心1500转/分钟10分钟。

取试管底部的精子，小心加入含有卵母细胞的液滴中，使有效精子的终浓度达到1*10

S2、24小时后，将卵母细胞在改进型SOF(输卵管合成液+氨基酸)液清洗2-4次，然后加入新鲜的改进型SOF培养液，于38.5℃、5％CO

改进的SOF培养液为在原有的SOF培养液中加入了1％必需和非必需氨基酸。

48小时的分裂率是分裂的细胞数/培养细胞的总数*100％，囊胚率％＝第8天所观察的囊胚数/48小时分裂细胞的总数*100％。

对比例一

将卵母细胞中涉及的调控液及成熟液按照现有技术进行处理，其他操作同实施例一。

调控液为20微克/毫升放射菌酮，成熟液中包括M199培养液、10％体积的血清、5-10国际单位(IU)/毫升FSH激素、5国际单位(IU)/毫升LH激素。

试验测试

将对比例一作为对照组(Control)，实施例一作为处理组(CHX)，分别进行受精试验，每个试验做3个重复，并取平均值，其结果如下。

其中，IVM20h为对照组在体外成熟20h、IVM24h为对照组在体外成熟24h；CHX+20h为处理组在体外成熟20h、CHX+24h为处理组在体外成熟24h。

如图1，卵母细胞体外成熟效果图中可以发现，处理组得到卵母细胞成熟的时间缩短，成熟率提高。

如图2，处理组在20小时后体外受精率明显高于对照组(P<0.05)，而在24h后处理组与对照组的受精率接近，二者没有统计学上的差异(P>0.05)。

如图3，2-cell、4-cell、8-cell分别指含有2个细胞、4个细胞、8个细胞的胚胎。

经CHX处理的卵母细胞受精后48小时有更多的细胞发育至4-8细胞阶段。

如图4，a和b、b和c之间有显著性差异(P<0.05)，而a和c之间存在极显著性差异(P<0.01)。

CHX+20h组的囊胚率明显高于其它组(P<0.05)。在成熟24小时组，CHX处理组和正常的对照组之间囊胚率没有明显地差别(P>0.05)。

如图5，CHX+20h组的平均胚胎的细胞数显著高于其它组(P<0.05)，而24小时的两组中没有差别(P>0.05)，但它们的平均细胞数要高于20小时的对照组(P<0.05)。

在做体外受精生产胚胎时，采用的卵母细胞通常采自屠宰场废弃的卵巢上的卵泡，或者通过超声波探头从人或活动物体内的卵巢上卵泡上获取。由于人、母畜取卵时，或母畜被屠宰时，由于年龄、性周期处于不同的时期，造成获得的卵母细胞处于不同的生长时期。而这些处于不同时期的卵母细胞经过同样的成熟培养过程，会出现一部分卵母细胞到达受精时间，而一部分细胞已经老化，还有一部分细胞还未成熟。因此，由于卵母细胞的不同期化导致体外受精以及受精后的胚胎发育的效率不稳定。

本发明的细胞周期调控方法将卵母细胞停留在细胞周期的一个固定点上，这样处于不同的生长期的卵母细胞只要到达这个点就停下来，等待后续的其他细胞。在经过一段时间CHX处理后，所有的卵母细胞都可以站在同一个“起跑线”上。当所有的卵母细胞离开CHX处理后，它们就可以重新“起跑”。经过同样的时间处理，就会有更多的卵母细胞处于最佳的状态，可以被受精。有意思的是，这些卵母细胞到达最佳的成熟时间与传统体外成熟的方法相比，大大提前了。这也意味着在同样的培养时间內，本发明产生的胚胎效率和质量都有了显著性的提高。

放射菌酮(cycloheximide，简称CHX)是一种被广泛应用的、可逆的、低毒的、蛋白质的合成抑制剂，具有抑制细胞蛋白质的合成作用。CHX可以抑制细胞蛋白质的合成，但并不抑制细胞RNA的合成。然而，任何一个细胞的细胞周期只能使用新合成的蛋白质，这就构成了本发明调控卵母细胞细胞周期同期化的理论基础，其理论应该适用绝大多数哺乳动物包括人类的卵母细胞。

本发明的细胞周期调控方法在卵母细胞进入成熟之前，采用CHX预先处理不同期的卵母细胞，使这些细胞停留在细胞周期的特定点上，使细胞群体达到同期化，同时对单个卵母细胞而言，由于细胞停留在细胞周期的特定点时，但卵母细胞仍然可以合成RNA，这为卵母细胞的成熟积累更多所需的RNAs，包括对卵母细胞成熟有重要影响的基因如GDF9、BMP15、PCNA和C-kit基因的RNAs与对照组相比有明显地提高。这也意味着每个卵母细胞的质量经过CHX的处理后，理论上都应该有所提高。因此，CHX预处理卵母细胞，可以起到“一箭双雕”的作用。

本发明使用的CHX药物的浓度比现有技术低几倍到十几倍，而高浓度的CHX药物对卵母细胞可能有副作用。尽管，有很多关于CHX对卵母细胞的成熟的研究，但至今还没有任何有利的报道。其中，没有意识到，激素如FSH和LH与CHX对卵母细胞核的成熟作用正好相反，从而影响受精效果，可能是一个原因。另外，值得注意得是，CHX处理后卵母细胞在成熟24小时受精，其48小时的分裂率与24小时对照组没有差异。这个结果说明，CHX处理的卵母细胞成熟的时间提前了，如果推迟受精，可能导致成熟的卵母细胞老化，从而造成受精率及后来的胚胎发育率下降。这也是导致很多类似试验失败的原因之一。

因此，本发明采用上述一种利用放射菌酮调控动物卵母细胞细胞周期的方法，操作简单，不仅可以显著促进卵母细胞细胞同期化，而且也明显地改善了受精率以及体外胚胎生产的效率。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。