用于细胞培养监测的过程中装置和方法

技术领域

本发明涉及用于例如在免疫疗法细胞培养领域中通过细胞成像对细胞密度和细胞活力(viability)的过程中监测的装置。

背景技术

通常模仿其体内状态的细胞生长的重要参数当前通常是公认的，以及对于特定细胞系(例如用来表达单克隆抗体的细胞系)，其细胞培养参数能够基于先前经验相当准确地预测。因此，甚至具有连续馈送分批（batch）培养的细胞培养也能够容易优化。但是，在例如单批自体同源免疫疗法细胞培养中的细胞培养批的种子细胞的特性很多未知或者多变的情况下，则在某个程度上，细胞培养参数必须基于培养过程期间的培养取样来调整，以便优化那个过程。

各种传感器是市场销售的，以检测过程中细胞培养参数，例如检测CO2、O2和N2气体的浓度以及温度，并且这些能够用来提供已知令人满意的培养条件。但是，对于未知细胞特性，所产生细胞活性而不是准确输入参数是重要的，因此监测输入参数的效果更为重要。有效细胞培养条件的已知量度是：细胞密度——流体的所定义面积或体积中的细胞数量(随时间提供细胞分裂率的指示)；细胞活力——例如在流体的所定义面积或体积中观测的健康细胞的数量；代谢物和养分，例如葡萄糖、乳酸盐和铵浓度；某些蛋白质的表达(例如用来确定杀伤性和辅助T细胞的比率并且确定功能活性细胞)；以及抗原决定簇(表位的发展)。因此，细胞密度和/或细胞活力和/或细胞形态是所使用细胞培养参数的成功与否的良好指示符（indicator）。如果观测到不可接受或未达最佳细胞密度和/或细胞活力，则能够进行参数的调整。

虽然已知监测这些细胞条件，但是按常规，它们的监测涉及从细胞培养来获取样本并且在处于实验室工作台的显微镜下检查样本(例如如US73696969中所述)或者使用样本的比色、荧光测定或光谱分析。每次获取样本时，存在污染细胞培养的风险。免疫疗法中至关重要的是，没有或很少病原体被注射到患者，并且因此降低细胞培养期间的污染的风险极为重要。以更少步骤的更频繁监测以及细胞培养输入中的自动校正变更在比采用常规多条件确定将会是可能的时间要少的时间来提供产生有效治疗细胞培养的更好时机。这对于敏感干细胞培养尤其重要。

此外，本发明人已经认识到，客户可能不愿意对处置的生物处理设备花费大量金额，因此必要的是在可能的情况下降低成本，这意味着低成本监测装置是合乎需要的，其中产品的更高费用特征是可再用的。

上述问题通过落入本文中的权利要求书的范围之内的本文所述和所图示的本发明的实施例来解决。

发明内容

在本文中的独立权利要求中提出本发明的方面，其中优选特征在从属权利要求中提出。

本发明的更多优点和有益效果将是本领域的技术人员考虑到以下详细描述而容易明白的。虽然在权利要求中提出本发明的技术特征，但是本发明可扩展到本文所述特征的任何组合，而不一定是要求保护的那些特征。此外，本发明可以通过与来自一个或多个其他权利要求的特征的全部或者一部分相组合的任何一项权利要求中的特征的仅一部分来限定。

附图说明

现在将参照附图更详细描述本发明，其中：

图1示意示出采用过程中细胞培养监测装置的细胞培养设备；

图2示出按照本发明的细胞监测装置的截面图；

图3和图3a示出与图2中所示的监测装置类似的监测装置的部分的透视图和截面图；

图4、图5和图6各自示出图3中所示部分的备选方案的截面平面图；以及

图7示出由监测装置所捕获的细胞的图像。

具体实施方式

图1示出细胞培养设备10，其在本例中包括：细胞培养容器12，其在这个实施例中由柔性袋所形成；细胞培养混合物14，该细胞培养混合物14根据细胞培养的长度是哺乳动物细胞(所述哺乳动物细胞具有聚集在一起的趋势)和液体细胞培养介质(包括已知细胞生长介质)的混合物。设备10进一步包括摇摆（rocking）平台16，该摇摆平台16在摇摆的同时缓和地混合细胞混合物14。平台16被支承在基座18上。

细胞培养混合物14可由监测装置100监测，所述监测装置100在本例中被附连到袋12的外部，并且具有与袋12的内部并且因此与细胞培养混合物14进行流体连通的入口和出口(下面更详细描述)。装置100进一步包括临时管缆（umbilical）102，该临时管缆102在这个实施例中包括电功率供应和信号线路(电和/或光纤)。

基座18包括：互补微控制器和关联硬件20，其用于控制对装置的电供应；以及数据存储器，其用于缓冲来自装置100的数据，它们全部经由互补临时管缆22和连接器24连接到装置，所述连接器24在装置的临时管缆102的端部与互补连接器104配合。总之，微控制器用来控制装置的机能，并且从装置接收数据。虽然微控制器及其关联硬件20优选地位于基座18中，但是它们可位于其他位置。互补连接器24/104用于便于组装。

图2通过截面更详细示出监测装置100。监测装置100包括基座140和盖（cap）120。基座140支承小显微镜110，该小显微镜110又提供在盖120中形成的监测通道122的内容的图像。基座140和盖120包括互补（complimentary）形成部125，所述互补形成部125围绕柔性袋12夹持，从而提供围绕在袋12中形成的开口的气密密封。可热熔密封部125是优选的，但是备选地或另外第，能够采用粘合剂或机械夹具。

在使用中，流动通道122被暴露于培养混合物14，使得流体(包括细胞)能够经过通道122在箭头F的方向上流动。盖120由透明或半透明材料(例如，PMMA塑料，例如丙烯酸塑料)来形成，并且包括部分球形部分128，该部分球形部分128面向显微镜110，该部分球形部分128又具有将光聚焦在通道122的中心区域130处的作用，使得从显微镜110的LED 112所发射的光被聚焦在焦点区域130处，以及从那个焦点所发射的光在显微镜110中在图像阵列114处捕获。

基座140包括内螺纹146，该内螺纹146接纳在显微镜110的外表面上形成的互补螺纹126。因此，显微镜相对于基座140围绕轴线的旋转能够调整焦点区域130的位置。

盖120可分成两半以便使通道122的形成更容易，以及基座140预计形成连同柔性袋12的组合件。由于组合件预计是一次性的，所以可移除显微镜110则是优选的，以便能够再使用显微镜。因此，虽然已经图示互补螺纹126和146，但是可采用基座140与显微镜110之间的其他易于可释放的紧固。例如，可采用卡口式组装件或者简单推入配合（simple pushfit）。

图3示出监测装置100的外部示图。如上所述，盖120至少在穹顶球形部分128处预计是透光的，以及由于更加便于将盖120浇铸为整体形成部或者分成两半，所以如本图示中所示，整个盖则是透明的。因此，通道122’在这个图示中是可见的。如在图2中能够看到，通道122’包括两个开口121和123，其中根据流动方向，一个用作入口而一个用作出口。开口121和123在其端部处向外展开，使得通道122’的中部提供对流的限制。这个限制又阻塞流，并且因此降低焦点区域130处的流率，以及改进在那个点处所得到的图像的质量，因为细胞更缓慢地移动。

图3a是图3中可见的平面P-P中的截面图。在这个视图中能够看到，通道120’在区域130处更窄，并且与图2的更平行通道122有所不同。在这种情况下，更窄通道用来使流体汇集（act funnel）通过通道，以产生通过光学监测区域130的被阻塞但更长的被监测流。

将会理解，可采用其他流路剖面。图4、图5和图6各自通过平面图示出备选流部分的截面剖面。在图4中，图示备选盖420，该盖420包括流动通道422，其略宽于图3中所图示的流动通道122。在这种情况下，流动通道422的深度X(参见图3)可能小于通道122的深度，以便保持与通道122的通道截面面积类似的通道截面面积。另外，通道422的剖面与图2中所示的剖面类似。能够看到，其中显微镜将查看流的区域130的截面面积为X(图2)乘以Z(图3)，其中Z是显微镜的视场的宽度，所述宽度不一定是通道的宽度。为了更容易计算，使那个截面面积对于盖120和420是恒定的。

备选盖520在图5中示出。在这种情况下，所图示的通道522包括入口521和出口523，显而易见的是，入口具有比出口要大的截面面积，以便限制液体在箭头F的方向上的流动，以增强所得图像的质量。

将会显而易见的是，在流能够被成像而与它经过盖流动的方向无关的意义上，图3和图4中所示的盖是双向的。此外，将会显而易见的是，图5中所示的盖520在箭头F的方向上预计用于单向流动。另外的备选盖620在图6中图示。在这里，盖620提供全向监测，换言之，流能够进入和离开盖，而与其接近方向无关。中心室630用来提供细胞图像。

通道122、422、522和622的截面尺寸无需是准确的，但是已经发现1至3 mm的深度(X)提供相当良好结果。换言之，细胞在生物反应器袋12来回摆动时在重力的影响下穿过这类通道，并且以允许它们被成像的速度行进。在全部情况下，通道具有一般平行顶壁和底壁，其不具有其中流体能够汇集或者达到尽头（dead end）的区域。这意味着，监测器中的流体不断奔流（flush），而没有停滞。这特别优于现有细胞取样技术，现有细胞取样技术要求通常沿尽头提取细胞悬浮液的等分部分（aliquot），该尽头造成停滞并且引起萎缩和后续污染的来源。提供跨监测区域130的通道的均匀深度(X)以获得一致结果是重要的但不是必要的。在流被阻塞(例如如在图5所示的通道522中将发生)的情况下，则能够采取恒定流动速度。

图7示出从监测区域130的显微镜110所得到的典型图像，其中在本例中，类成淋巴细胞200是可见的。连续图像能够用来确定细胞经过流动通道的速率。但是，由于通道具有较小截面面积，所以经过通道的流则可被阻塞，从而引起无需持续被确定的一般一致的流率。图像分析软件还能够确定图像中的细胞的数量，以及如果显微镜查看区的截面面积和通道中的流率为已知，则能够确定包含细胞并且经过通道的流体的体积。此外，如果细胞培养14的总体积为已知，并且例如能够通过了解培养14的质量(又从内置于基座18中的秤盘的读数所得出)来确定，则能够同时基于对于经过通道的查看区域的流体的给定体积经过通道的细胞的数量进行细胞培养14中的细胞的总数的估计。

图像分析软件能够用来对图像中新出现的细胞的数量进行计数，由此提供在某个时间段内的细胞的计数。该时间段还能够用来确定所成像流体的总体积，因为图像处的流的截面面积也是已知的。

此外，图像的分析能够确定所计数细胞的活力。例如，本发明人已经观察到，健康细胞具有明确定义的细胞壁，使得捕获通道中的细胞的图像提供细胞壁与流体悬浮液之间的清楚对比度。而死亡或不健康细胞提供不太明显的对比度。细胞相对于其背景的对比度的图像分析能够给出所述的细胞的活力的指示。实际上，光密度值能够被指配给来自显微镜图像阵列114的阵列的连续像素，以及如果细胞壁区的密度值的变化率充分大，则那个细胞能够被确定为健康。备选地，在密度值的变化率低的情况下，则那是关于细胞壁不健康并且细胞可能不可存活的指示。因此，通过连续细胞图像分析，能够得到细胞活力(例如作为按照上述方法所计数的细胞的数量的百分比)的相当准确的确定。

在操作中，细胞计数和细胞活力的评定能够由计算机执行，所述计算机被连接到微控制器20。这种监测能够在细胞培养过程期间连续地、周期地或者随机地执行，并且能够用来影响细胞培养的参数，或者确定细胞密度何时具有充分幅值以结束细胞培养。这在自体细胞疗法(其中种子细胞的特性是未知的)中是特别有用的。由于通道是没有流体袋(所述流体在被倾斜时无法排出)的简单平坦通道，所以则没有死滞袋或池能够形成，这意味着监测器自排放而不是萎缩或污染的来源。因此能够看到，监测通道应当具有充分大小和形状，以允许通道在它被搅动或倾斜之后的自排放，但是实际上流体的残余可遗留。但是，这种残余例如在低循环次数(即，不超过9或10个循环)之后最终将被冲走。

按照上述技术的监测和确定能够重复多次，细胞培养过程由装置来监测，并且其确定用来向控制器反馈，所述控制器能够调整细胞培养的参数，例如增加或减少养分供应或灌注速率并且确定活细胞密度已经达到预期水平的时间。一旦细胞培养完成，则细胞袋12和附连装置能够被丢弃，但是显微镜能够被释放并且随下一个袋12再使用。

本发明不是要被看作被上述实施例限制，而是如本领域的技术人员清楚知道的那样能够在所附权利要求书的范围之内改变。例如，优选的是，盖120被定位在细胞培养14的底部，因为细胞倾向于聚集在悬浮流体的底部处。此外，许多细胞培养开始于小体积的悬浮流体，并且随着培养进行而增加流体体积。因此，便利地，盖被定位在细胞培养14的底部处。但是，只要能够使细胞的流经过通道，则盖能够被定位在任何位置，以提供适当结果。因此，在备选实施例中，能够在探头的端部上提供盖120或者包括流动通道的类似布置，该探头能够在生物反应器内重新定位。这种探头能够被插入到细胞培养容器中，其中显微镜优选地保留在容器外部。只要监测细胞的代表性样本，则将包括如上所述的监测通道的探头的端部的监测通道能够被定位在容器中的任何位置。

在图2中所图示的实施例中，照明光由LED 112提供，该LED 112被定位在显微镜110中，并且经由临时管缆102被供电。因此，显微镜(包括LED灯)能够是可再用的，而更低成本塑料部件(盖1