植物外泌体用于显示对免疫系统细胞的调节作用的用途

技术领域

本发明涉及植物外泌体作为针对疾病的免疫系统增强剂、沉默剂和调节剂，对免疫系统的作用的用途。

背景技术

囊泡是小囊，其涉及细胞内的物质转运和贮存，并且通过至少一个脂质双层与细胞质液分开。外泌体是囊泡，其通过从原核生物到高等真核生物和植物的许多生物体释放，并且含有不同大小的脂质双层囊泡[1]。这些囊泡的重要性在于将信息传递给其它细胞，以便影响细胞功能的能力。经由外泌体的信号传递借助于许多不同范畴中的生物分子来进行，所述生物分子由蛋白质、脂质、核酸和糖组成[2]。

细胞外囊泡与细胞的功能性相互作用首先在1982年，通过实验确定从精浆中分离的囊泡增加精子运动后发现[3]。从那时起，直到今天已在许多不同的组织中进行关于囊泡分子机制相关进展的研究，并且将未知的问题暴露出来。

免疫系统是机体的防御机制，并且保护机体免受感染和疾病。免疫系统保护人免受许多微生物，例如病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫的影响及其有害效应，所述微生物(microorganism)被定义为微生物(microbe)。免疫系统的主要任务是防止这些生物体进入机体，破坏已进入的生物体，并且防止或延迟其扩散。免疫系统的主要成分是白血细胞。也称为白血球或白细胞的白血细胞在骨髓、淋巴结、脾脏和胸腺中产生。直径为20微米的白血细胞通过保护机体免受传染病和异物，构成了免疫系统的重要部分。白细胞分成两组。多核白细胞被定义为粒细胞，且单核白细胞被定义为淋巴细胞和单核细胞。每个白血细胞具有其自身的防御机制。嗜中性粒细胞破坏引起疾病的细胞，单核细胞破坏从死亡组织中残留的细胞，嗜酸性粒细胞破坏有毒物质、引起过敏的细胞和寄生虫，淋巴细胞构成机体的完整免疫系统并对其进行保护。在含有一百万个细胞的健康成年人的血液中，存在4 × 10

T细胞是一类白血细胞，其控制细胞异常和感染，并且在免疫系统的保护中起重要作用。体内少量T细胞的破坏效应在疾病如HIV/AIDS中是非常重要的。存在几种不同的T细胞。一般而言，它们可以分为两种不同的类型。首先，“CD8表面标记物阳性杀伤性T细胞”搜寻并破坏受感染的细胞或癌细胞。其次，“CD4表面标记物阳性辅助性T细胞”调节免疫系统的应答，并且在免疫系统的所有部分中起重要作用。

为了阐明T细胞在我们体内的功能，它们

● 就外来入侵者检查细胞内环境，

● 履行命令以直接杀死被病毒感染的细胞或被细菌感染的细胞，

● 努力破坏癌细胞，

● 帮助活化称为抗体的结构，所述抗体通过机体产生，以中和致病因子，和

● 记住多年前体内遇到的微生物，并且相应地采取预防措施。

T细胞还负责移植器官的排斥，免疫系统疾病如糖尿病和多发性硬化，以及免疫系统应答如过敏反应，例如麸质不耐受。低T细胞数目比高T细胞数目更常见。低T细胞数目通常指示免疫系统或淋巴结中的问题。在病毒诱导的感染例如流感，以及在免疫系统缺陷、辐射暴露、HIV和AIDS的情况下，以及在影响血液或淋巴结的疾病例如白血病中，可以看到低T细胞数目。化学疗法药物、放射疗法、免疫抑制药物可以影响T细胞的数目。

B细胞是在体液免疫应答中起主要作用的淋巴细胞。人体每天产生数百万个不同类型的B细胞，并且每种类型具有特异性受体蛋白，其可以与其膜中的特异性抗原结合。CD19作为标记物存在于整个B细胞膜中。在人体中，数百万个B细胞在血液和淋巴中循环，而不产生抗体。当任何B细胞遇到抗原并从辅助T细胞接收另外的信号时；它分化成下文描述的两种不同类型的B细胞之一。虽然B细胞可以直接转化成这些细胞类型之一，但它们也可以在中间步骤后被转化。

自然杀伤细胞是免疫系统的非专门防御细胞。自然杀伤细胞占血液中的淋巴细胞的约10%。它们缺乏编码在T和B淋巴细胞中发现的抗原受体的基因的重排。自然杀伤细胞并不攻击显示正常水平的MHC 1类分子的细胞，但杀死外来MHC，使得它们也杀死其MHC I表达降低或不存在的细胞。这在病毒感染和癌症中很常见。自然杀伤细胞可以在外周血中作为含有红色颗粒的大淋巴细胞检测到。CD56粘附分子是典型的自然杀伤细胞的标记物。

佐剂使用的一般目的如下：

− 为了增强其为重组的或通过彻底纯化获得的抗原的免疫原性，

− 在短时间段内产生更强和更持久的免疫应答，

− 降低实现初次免疫应答所需的抗原量或疫苗接种次数，且从而降低疫苗接种的成本，

− 增加疫苗在新生儿、老年人和具有免疫缺陷的人中的活性，

− 加强通过粘膜的抗原摄入(刺激粘膜免疫)，

− 刺激细胞免疫，

− 帮助防止组合疫苗中的抗原竞争性。

需要细胞免疫应答用于保护免受细胞内病原微生物的影响，并且需要体液免疫应答用于保护免受细胞外微生物的影响。铝盐是弱佐剂，因为它们仅通过刺激体液免疫应答来增加抗体应答。它们对于需要体液免疫应答用于保护的疾病(例如乙型肝炎和百日咳)是足够的。然而，它们没有刺激细胞毒性T淋巴细胞的活性(细胞免疫)。例如，在HIV疫苗中，目标不是产生抗体，而是刺激细胞毒性淋巴细胞。此外，铝化合物不适合于经口或鼻内施用。它们不能触发粘膜IgA应答。相反，它们可能通过增加IgE应答而在一些人中引起过敏反应。因此，由于免疫系统活性(例如细胞因子)而产生的许多化学物质、生化物质和蛋白质，近年来已开始作为潜在的佐剂进行调查。然而，在大多数这些物质中可见的局部和全身毒性，目前并不允许它们中的许多用作人疫苗中的佐剂。佐剂活性越高，副作用的发生率越高。由于佐剂可能发生局部副作用，例如疼痛、炎症、肿胀、在注射部位处的坏死、肉芽肿、无菌脓肿和淋巴腺病，以及全身性副作用，例如恶心、发烧、关节炎、葡萄膜炎、嗜酸性粒细胞增多、过敏性反应、变态反应、免疫抑制和自身免疫性疾病。在佐剂研究中，将毒性降到最低被视为最具挑战性的步骤。为此，仅铝佐剂已持续用作用于人疫苗的佐剂近一个世纪。

不管需要哪种类型的保护，无论是细胞还是体液的，理想的佐剂都应该提供所需的免疫；应该提供免疫记忆，即长期免疫；应该是安全的并且具有最低限度的副作用；不应该具有刺激自身免疫的任何效应；不应该是致突变的、致癌的、致畸的；应该是可生物降解的；并且应该是廉价的且具有长贮存期限。

皂苷是在植物、一些原始海洋生物体和细菌中发现的类固醇或三萜糖苷。它们在自然界中是丰富的。三萜皂苷在大豆、豆类、豌豆、茶、菠菜、甜菜、甘草、向日葵、七叶树和人参中可见，而甾体皂苷在燕麦、甜椒、茄子、番茄种子、洋葱、芦笋、番薯和人参中可见。三萜皂苷包含疏水核以及与其连接的碳水化合物链。含皂苷的佐剂刺激细胞免疫和体液免疫两者。低剂量对于佐剂活性是足够的。皂苷还增加CD8 (+)细胞毒性淋巴细胞应答，并且强化对粘膜抗原的免疫应答。然而，由于它们是表面活性试剂，因此它们已在体外研究中发现引起溶血。存在含有皂苷的广泛多样的佐剂。

免疫调节化学物质的使用在进行且维持细胞或器官移植的连续性方面非常重要，所述细胞或器官移植作为非常重要的治疗方法当今频繁地执行。尤其在实体器官移植和造血干细胞移植中发生，并且特征在于通过健康的T淋巴细胞介导的严重免疫反应的移植物抗宿主病(GVHD)，是其中广泛使用免疫调节剂的疾病之一。关于这点的最重要原因在于它是移植后过程中最重要的死亡率和发病率因素。可能在移植后的前三个月内发生的这种疾病，具有主要对皮肤、肝脏和肠道的显著作用。尽管从过去到现在借助于免疫抑制药物(如环孢菌素和氨甲蝶呤)在其预防方面取得了重大进展；但不幸的是，其治疗进展受到限制。一般而言，它根据造血干细胞移植后的发作时间分成两种，即急性和慢性GVHD。相应地，重要的是通过活组织检查确认诊断，因为在第3个月后发生的慢性GVHD的治疗涉及高剂量的免疫抑制药物，并且持续很长时间。另外，在治疗过程期间发生的感染是慢性GVHD患者中最常见的死亡原因之一。因此，在免疫抑制疗法期间，向这些患者施用预防性抗微生物药物已成为至关重要的需求。根据急性和慢性GVHD两者的发病机制的发现，关于开发不同预防和治疗方法的研究近年来正在进行中。

当免疫系统遇到抗原时，它的过度或不适当的反应被称为超敏反应。虽然健康个体的免疫系统可以对抗病原体而不对其细胞造成很大损害，但超敏个体的免疫应答对健康组织造成损害。过敏，也就是说，免疫系统对无害抗原的应答落入超敏反应的范围内。湿疹、过敏性哮喘和花粉症是最常见的慢性过敏。

在超敏反应疾病的治疗中，使用广谱消炎药，抗细胞因子疗法，且特别是在更严重的情况下，降低体内淋巴细胞数目的治疗。脱敏疗法可以用于降低个体针对他们对其过敏的抗原的敏感性。通过在治疗期过程中，以受控剂量施用个体对其过敏的抗原，从而建立对该抗原的耐受性，来实现脱敏。

现有技术应用中确定的问题可以如下列出：

● 铝佐剂的一个重要问题在于其使用限于需要产生中和抗体的细菌和病毒疫苗，

● 铝佐剂可能由于增加的IgE产生而引起过敏和潜在的神经毒性的趋势，

● 铝中毒还与肌萎缩性侧索硬化和阿尔茨海默氏病相关，

● 因为含有植物衍生皂苷的佐剂是表面活性试剂，因此它们在体外研究中导致溶血，

● 免疫抑制药物例如环孢菌素和氨甲蝶呤使得患者在长期使用时易受传染病影响，

● 积极用于治疗GVHD的环孢菌素引起明显的肾毒性和高血压[4]，

● 在患有多发性硬化(MS)的患者中施用的干扰素β (IFNB)的皮下注射，首先伴随脂膜炎，然后为在注射部位处的局部脂肪营养不良，

● 取决于使用的持续时间，用于免疫抑制目的的药物硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤，使机体暴露于肝炎、胰腺炎和许多其它感染，

● 含有植物化学物质的各种植物提取物，例如黄酮类化合物、多糖、内酯、生物碱、二萜类化合物和糖苷，对免疫系统具有调节作用；然而，由于除活性成分之外还存在高比率的化学污染物，存在关于其有效使用和潜在的副作用的犹豫。

现有技术中已知的申请，韩国专利申请文件号KR20120002942公开了衍生自细胞的原生质体的微囊泡及其用途。这些细胞可以是细菌细胞、古细菌细胞、霉菌细胞、植物细胞或L型细菌。用于递送用于诊断或治疗疾病的材料或疫苗的组合物含有微囊泡。用于制造微囊泡的方法包括以下步骤：从细胞中去除细胞壁以制备原生质体，在含有原生质体的悬浮液体中制备微囊泡，以及从悬浮液体中分离微囊泡。

国际专利申请文件号WO2016166716公开了现有技术中已知的应用，公开了通过柠檬分离的纳米囊泡的抗肿瘤活性。用于从柑橘类植物获得纳米囊泡的方法包括以下步骤：a)在一个或多个连续循环中，对汁液进行离心和过滤；b)将步骤(a)中获得的汁液超速离心，因此获得上清液和含有纳米囊泡的沉淀，并回收囊泡。该方法可以进一步包括以下步骤：c)使回收的沉淀经受蔗糖梯度超速离心；d)分离密度在1.12和1.19g/ml之间的级分；e)任选地使级分经受超速离心；和f)任选地用生理溶液洗涤沉淀。

中国专利申请文件号CN102697812公开了现有技术中已知的应用，公开了用于从鸡胆汁中提取外泌体的方法，以及所述外泌体在免疫学中的应用。外泌体可以用作免疫反应的佐剂，用于免疫调节。

现有技术中已知的申请，国际专利申请文件号WO2016168680公开了用于开发基于外泌体的疫苗的方法。该发明的实施方案涉及用于制备免疫原性组合物的方法，以及使用此类免疫原性组合物治疗各种疾病的方法。

现有技术中的申请，土耳其专利申请文件号TR 2012/05117 (EP1267924B1)公开了免疫治疗方法和组合物。该发明涉及将化学实体引入抗原呈递细胞内的方法和组合物。所得到的所述抗原在抗原呈递细胞的表面上的呈递对免疫系统产生作用。该发明还涉及所得到的修饰的抗原呈递细胞和含有这些细胞的药物组合物。该发明公开了对佐剂性和佐剂制剂的新理解，包括一系列有关肽和掺入所述肽的磷脂囊泡。

现有技术中的申请，土耳其专利申请文件号TR 2016/08391 (EP2591802B1)公开了基于封装在脂质体中的sticholysin的疫苗组合物。所述发明涉及应用于人类健康的生物技术领域。此处描述了疫苗媒介物，其中来自真核生物体的毒素被封装到通过脱水-再水化程序获得的多层囊泡内，所述多层囊泡的脂质组成为以1:1摩尔比的二棕榈酰磷脂酰胆碱:胆固醇，用于皮下或肌内施用。这些组合物并不需要使用其它佐剂。所公开的组合物允许针对共封装到含有毒素的脂质体内的一种或几种抗原的CTL特异性免疫应答的调节。由于诱导的免疫应答的稳固性和功能性以及其免疫调节特性，所述发明的疫苗媒介物显示相对于通过先前技术公开的其它疫苗媒介物的优点。

编号为US9717733、WO2006007529、WO1999003499、WO2017004526和US20100092524的专利申请也是现有技术中的申请。

发明内容

本发明的目的是使用从植物裂解产物中分离的植物外泌体，作为针对源于免疫系统病症的疾病的免疫系统增强剂、沉默剂和调节剂。

本发明的另一个目的是提供与通过得自类似活化剂的物质和目前用于抑制血细胞活化的化学物质获得的相比更高的抑制。

本发明的一个进一步目的是提供与通过得自类似活化剂的物质和目前用于增强血细胞活化的化学物质获得的相比更高的活化。

本发明的另一个目的是提供免疫调节试剂，因为它完全是植物起源的，所以不像其它药物那样对肝脏和其它器官发挥毒性效应。

附图说明

在附图中示出了为实现本发明的目的而开发的“植物外泌体用于显示对免疫系统细胞的调节作用的用途”，在所述附图中，

图1. 显示了在本发明的范围内，从疣叶大黄(Warty-Leaved Rhubarb)植物中分离的外泌体的表征的图解表示。

图2. 显示了在本发明的范围内，从芹菜中分离的外泌体的表征的图解表示。

图3. 显示了在本发明的范围内，从石榴中分离的外泌体的表征的图解表示。

图4. 显示了在本发明的范围内，从韭葱(Leek)中分离的外泌体的表征的图解表示。

图5. 显示了在本发明的范围内，从辣根中分离的外泌体的表征的图解表示。

图6. 显示了在本发明的范围内，从姜中分离的外泌体的表征的图解表示。

图7. 显示了在本发明的范围内，疣叶大黄外泌体对白血细胞的作用的图解表示。

图8. 显示了在本发明的范围内，疣叶大黄外泌体对IL2活化的白血细胞的作用的图解表示。

图9. 显示了在本发明的范围内，疣叶大黄外泌体对PHA活化的白血细胞的作用的图解表示。

图10. 显示了在本发明的范围内，疣叶大黄外泌体对螨过敏原活化的白血细胞的作用的图解表示。

图11. 显示了在本发明的范围内，疣叶大黄外泌体对花粉过敏原活化的白血细胞的作用的图解表示。

图12. 显示了在本发明的范围内，芹菜外泌体对白血细胞的作用的图解表示。

图13. 显示了在本发明的范围内，芹菜外泌体对IL2活化的白血细胞的作用的图解表示。

图14. 显示了在本发明的范围内，芹菜外泌体对PHA活化的白血细胞的作用的图解表示。

图15. 显示了在本发明的范围内，芹菜外泌体对螨过敏原活化的白血细胞的作用的图解表示。

图16. 显示了在本发明的范围内，芹菜外泌体对花粉过敏原活化的白血细胞的作用的图解表示。

图17. 显示了在本发明的范围内，石榴外泌体对白血细胞的作用的图解表示。

图18. 显示了在本发明的范围内，石榴外泌体对IL2活化的白血细胞的作用的图解表示。

图19. 显示了在本发明的范围内，石榴外泌体对PHA活化的白血细胞的作用的图解表示。

图20. 显示了在本发明的范围内，石榴外泌体对螨过敏原活化的白血细胞的作用的图解表示。

图21. 显示了在本发明的范围内，石榴外泌体对花粉过敏原活化的白血细胞的作用的图解表示。

图22. 显示了在本发明的范围内，韭葱外泌体对白血细胞的作用的图解表示。

图23. 显示了在本发明的范围内，韭葱外泌体对IL2活化的白血细胞的作用的图解表示。

图24. 显示了在本发明的范围内，韭葱外泌体对PHA活化的白血细胞的作用的图解表示。

图25. 显示了在本发明的范围内，韭葱外泌体对螨过敏原活化的白血细胞的作用的图解表示。

图26. 显示了在本发明的范围内，韭葱外泌体对花粉过敏原活化的白血细胞的作用的图解表示。

图27. 显示了在本发明的范围内，辣根外泌体对白血细胞的作用的图解表示。

图28. 显示了在本发明的范围内，辣根外泌体对IL2活化的白血细胞的作用的图解表示。

图29. 显示了在本发明的范围内，辣根外泌体对PHA活化的白血细胞的作用的图解表示。

图30. 显示了在本发明的范围内，辣根外泌体对螨过敏原活化的白血细胞的作用的图解表示。

图31. 显示了在本发明的范围内，辣根外泌体对花粉过敏原活化的白血细胞的作用的图解表示。

图32. 显示了在本发明的范围内，姜外泌体对白血细胞的作用的图解表示。

图33. 显示了在本发明的范围内，姜外泌体对IL2活化的白血细胞的作用的图解表示。

图34. 显示了在本发明的范围内，姜外泌体对PHA活化的白血细胞的作用的图解表示。

图35. 显示了在本发明的范围内，姜外泌体对螨过敏原活化的白血细胞的作用的图解表示。

图36. 显示了在本发明的范围内，姜外泌体对花粉过敏原活化的白血细胞的作用的图解表示。

具体实施方式

本发明的主题是使用从植物裂解产物中分离的植物外泌体，作为针对影响免疫系统的疾病的免疫系统增强剂、沉默剂和调节剂。本发明的植物外泌体是植物衍生的外泌体，其通过活化、抑制和调节免疫系统细胞，使得能够预防和治疗疾病。

本发明的植物外泌体对免疫系统的作用是基于对免疫系统细胞分裂的作用。活化免疫系统的植物外泌体刺激免疫系统细胞，使得其能够增殖，从而强化免疫应答。另一方面，抑制性植物外泌体使得免疫系统细胞对分裂不敏感，从而抑制了免疫系统应答。本发明中讨论的外泌体的这些效应在数据中显示，所述数据呈现为被施用外泌体的免疫系统细胞的表面蛋白质(CD 8、CD 19和CD 56)的变化。

在本发明的范围内，植物外泌体主要作为免疫系统增强剂、抑制剂或需要时执行前两种功能的调节剂，用于自身免疫性疾病，以及细胞、组织、器官移植和移植物抗宿主病中。

在本发明的范围内，植物外泌体得自选自以下的植物的至少一部分：整个植物、果实、叶、种子、根或分化组织如植物的组织培养基、干细胞、废料、壳或韧皮部。植物组织培养物作为获得植物外泌体的来源是优选的，以便产生浓度为得自相似植物的外泌体高达5倍的外泌体，并且将所产生的外泌体的含量和特性维持很长时间，从而防止其受到农场、收获、运输等的影响。

转染本发明的植物外泌体，以使得植物组织培养物中的细胞能够产生增强、抑制或调节免疫系统的蛋白质。转染是外部基因转移到细胞中。在植物培养物中的细胞转染可以使得它们能够产生靶蛋白，并且通过这些细胞分泌的外泌体因此可以含有这些蛋白质。

在本发明的范围内，通过选自以下的分离方法来分离植物外泌体：通过两相液体系统的分离、分级离心、超滤、层析法、基于聚合物的分离和通过微珠的分离。其中，最高纯度的外泌体分离通过用两相液体系统的分离来实现，并且因此这种分离方法在本申请的范围内是优选的。

本发明的植物衍生的外泌体主要作为免疫系统增强剂、抑制剂或需要时执行前两种功能的调节剂，用于自身免疫性疾病，以及细胞、组织、器官移植，移植物抗宿主病和其中免疫系统受到影响的疾病中，所述疾病例如类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬化、干燥综合征、1型糖尿病、过敏性哮喘、韦格纳肉芽肿病、多发性硬化、克罗恩氏病、牛皮癣、格雷夫斯氏病、乳糜泻、斑秃(脱发)、中枢神经系统血管炎、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、古德帕斯彻氏综合征、自身免疫性溶血性贫血、格巴二氏综合征、结节性多动脉炎、特发性血小板减少性紫癜、颞动脉炎、原发性胆汁性肝硬化、爱迪生氏病、强直性脊柱炎、莱特氏综合征、高安氏动脉炎和白癜风。植物衍生的外泌体经口、鼻内、静脉内、肌内、真皮内、局部、腹膜内和通过注射进行施用，用于向患者施用有效剂量的所选植物外泌体，以治疗免疫系统介导的疾病。它们还用于携带免疫调节药物的目的，用作用于疫苗接种应用的佐剂，以及用作营养补充剂用于调节免疫系统的目的。

经由用于分离在本发明的范围内使用的植物外泌体的两相液体系统的分离方法包括下述步骤：

- 通过搅拌器将其外泌体待分离的植物分解，以获得其裂解产物，

- 以2,000 g至10,000 g的搅拌速率离心5-20分钟，用于从植物裂解产物中分离外泌体，

- 在离心后，通过过滤去除大小220 nm及超过220 nm的颗粒，

- 将通过离心获得的外泌体-蛋白质混合物转移到含有PEG相和DEX相的两相液体系统内，用于其分离，

- 通过利用PEG相对于蛋白质的化学趋势以及DEX相对于磷脂结构化膜的化学趋势，从外泌体中去除非外泌体蛋白、细胞脂肪和其它杂质，

- 获得分离的外泌体。

本发明用于利用植物外泌体作为针对疾病的免疫系统增强剂、沉默剂和调节剂，对免疫系统的作用。在本发明的范围内，植物外泌体的免疫调节效应主要作为免疫系统增强剂、抑制剂或需要时执行前两种功能的调节剂，用于自身免疫性疾病，以及细胞、组织、器官移植和疾病如移植物抗宿主病中。植物外泌体的效应可以根据外泌体由其分离的植物而不同。尽管它们可以是整个植物、果实、叶、种子和根，但它们也可以是分化组织如植物的组织培养基、干细胞、废料、壳或韧皮部。植物外泌体可以通过许多方法进行分离，所述方法例如通过两相液体系统的分离、分级离心、超滤、层析法、基于聚合物的分离和通过微珠的分离。在本发明的范围内进行的研究中使用的外泌体是从表1中公开的植物中分离的。

表1：在本发明的范围内用于分离外泌体的植物。

对于从植物裂解产物中分离的外泌体，通过在2000 g和10,000 g之间执行5-20分钟的离心，起因于植物分解的大尺寸颗粒，由于在两相分离方法过程中应用的离心及其重量，预期在沉淀时在右旋糖酐相中并不引起任何杂质。另外，确保过滤器不被堵塞，所述过滤器在为了去除尺寸220纳米及超过220纳米的颗粒而进行的过滤方法过程中使用。通过利用两相液体系统中PEG相对于蛋白质的化学趋势以及DEX相对于磷脂结构化膜的化学趋势，从外泌体中清除非外泌体蛋白、细胞脂肪和其它杂质。借助于溶液中使用的聚合物浓度形成的DEX相分离了外泌体。

实验研究

分离的外泌体通过由外泌体携带的表面标记物CD9、CD63和HSP70抗体进行标记，并且携带这些标记物的外泌体通过流式细胞术装置进行测量。同时，还测量了用ZetaSizer装置分离的外泌体的尺寸图1 -6。

执行白血细胞分离，以确定植物外泌体对血细胞的作用。引入含有EDTA或致使血液凝结的溶液的管内的血液，以按体积计1:1的比率与PBS混合。将它小心地倒入另一管中的聚蔗糖(ficoll)溶液上，而不使各相混合。将含有血液、PBS和聚蔗糖的管以大约3000RPM离心15分钟。在离心后，抽取上层血浆和聚蔗糖之间的含有白血细胞的白色中间相，且转移到干净的管中，并且通过在其上加入大约10 mL PBS，将它进行洗涤。细胞再次以1500RPM离心5分钟。去除细胞沉淀，并且在培养基中培养白血细胞。这些分离的白血细胞包括在免疫系统中起作用的细胞，例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞。

使在培养基中生长的细胞与IL2、PHA、螨过敏原和花粉过敏原一起温育，从而活化免疫系统细胞。将分离的植物外泌体递送至活化的和未活化的血细胞。为了证实植物外泌体对白血细胞的作用，通过流式细胞术装置测量由CD4、CD8、CD19和CD56抗体标记的血细胞的百分比。疣叶大黄外泌体对血细胞的作用显示于图7中，其对IL2活化的血细胞的作用显示于图8中，其对PHA活化的血细胞的作用显示于图9中，其对螨过敏原活化的血细胞的作用显示于图10中，并且其对花粉过敏原活化的血细胞的作用显示于图11中。芹菜外泌体对血细胞的作用显示于图12中，其对IL2活化的血细胞的作用显示于图13中，其对PHA活化的血细胞的作用显示于图14中，其对螨过敏原活化的血细胞的作用显示于图15中，并且其对花粉过敏原活化的血细胞的作用显示于图16中。石榴外泌体对血细胞的作用显示于图17中，其对IL2活化的血细胞的作用显示于图18中，其对PHA活化的血细胞的作用显示于图19中，其对螨过敏原活化的血细胞的作用显示于图20中，并且其对花粉过敏原活化的血细胞的作用显示于图21中。韭葱外泌体对血细胞的作用显示于图22中，其对IL2活化的血细胞的作用显示于图23中，其对PHA活化的血细胞的作用显示于图24中，其对螨过敏原活化的血细胞的作用显示于图25中，并且其对花粉过敏原活化的血细胞的作用显示于图26中。辣根外泌体对血细胞的作用显示于图27中，其对IL2活化的血细胞的作用显示于图28中，其对PHA活化的血细胞的作用显示于图29中，其对螨过敏原活化的血细胞的作用显示于图30中，并且其对花粉过敏原活化的血细胞的作用显示于图31中。姜外泌体对血细胞的作用显示于图32中，其对IL2活化的血细胞的作用显示于图33中，其对PHA活化的血细胞的作用显示于图34中，其对螨过敏原活化的血细胞的作用显示于图35中，并且其对花粉过敏原活化的血细胞的作用显示于图36中。

在本发明的范围内，使用植物外泌体作为针对疾病的免疫系统增强剂、沉默剂和调节剂，对免疫系统的作用的优点可以如下列出：

● 外泌体完全是植物来源的，

● 活化优于类似的活化剂(IL2)，并且比作为类似化学物质获得的物质更成功，

● 其可廉价地大量获得，

● 血细胞活化的抑制比率比作为类似化学物质获得的物质更成功，

● 因为它们完全是植物来源的，所以它们不具有其它药物对肝脏和其它器官具有的毒性效应。

● 它们是植物衍生的产物，其可以代替干细胞治疗来使用，所述干细胞治疗在组织和器官移植中用于抑制免疫系统，

● 由于它们不含植物、动物或化学来源的污染物，因此不会遇到由于上述污染物的副作用，

● 这些外泌体的使用替换了元素如铝的使用，已知在过度使用的情况下铝对机体是有害的。

参考文献

Ludwig, A. K.和B. Giebel (2012). "Exosomes: small vesiclesparticipating in intercellular communication."

Iraci, N., T. Leonardi, F. Gessler, B. Vega和S. Pluchino (2016). "Focus on Extracellular Vesicles: Physiological Role and Signalling Propertiesof Extracellular Membrane Vesicles."

Stegmayr, B.和G. Ronquist (1982). "Promotive effect on human spermprogressive motility by prostasomes."

Gupta A, Punatar S, Mathew L, Kannan S, Khattry N. Cyclosporine PlusMethotrexate or Cyclosporine Plus Mycophenolate Mofetil as Graft Versus HostDisease Prophylaxis in Acute Leukemia Transplant: Comparison of Toxicity,Engraftment Kinetics and Transplant Outcome.