一种玉米内生不动杆菌ACZLY512及其应用

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，特别是涉及一种玉米内生不动 杆菌ACZLY512及其应用。

背景技术

固氮微生物是能够还原分子态氮为氨态氮的微生物，全球固氮微 生物每年固氮总量超过5000万吨。联合固氮是指固氮菌定植在植物 体表面或内部，以宿主植物产生的碳水化合物为能源物质，在条件适 宜时进行生物固氮作用，为宿主植物提供氮源，使二者形成良好的互 利共生关系。利用联合固氮菌能够实现非豆科农作物的自主生物固氮， 在减少或不使用化肥用量的条件下，满足农作物健康生长所需要的氮 营养需求，因此，开发联合固氮菌是当前全球农业技术研究的热点， 将为解决人类所面临的化肥过量施用、能源危机、生态环境安全等重 大问题带来新思路。但是不同于豆科植物的根瘤菌，联合固氮菌不会 形成“根瘤”这样的特殊结构，使得联合固氮菌与宿主植物之间保持 一种比较松散的状态，固氮过程更容易受到外界条件影响，例如氧分 压和氨浓度等，导致固氮效率不高。

联合共生固氮菌主要分为两大类，生长在植物体表面的附生固氮 菌和生长在植物内部的内生固氮菌。其中，内生固氮菌为好氧微生物， 通过有氧呼吸作用提供能量；然而，固氮过程又是一个严格的厌氧过 程，高浓度分子氧对固氮酶的合成和活性有严重的抑制作用。因此， 如何解决内生固氮菌厌氧固氮过程和好氧呼吸作用之间的矛盾，是内 生固氮菌研究的关键问题，也是当前很多固氮菌株在实际应用中效果 不佳的重要原因之一。

目前，虽然固氮微生物的挖掘和利用是全球微生物研究的重点和 热点之一，但是由于研究人员致力于筛选高效固氮菌株，而忽略了非 固氮菌对固氮菌的协同增效作用。以往研究，主要通过无氮培养基对 固氮菌进行选择筛选，这意味着筛选的第一步就将一些重要的非固氮 菌排除在外。因此，目前本领域对非固氮菌对固氮菌协同增效方面的 研究还几乎处于空白状态。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米内生不动杆菌ACZLY512及其应用， 以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种玉米内生不动杆菌ACZLY512， 所述玉米内生不动杆菌ACZLY512于2021年05月06日保藏在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22268。

本发明还提供一种所述的玉米内生不动杆菌ACZLY512在提高固 氮菌固氮功能中的应用。

本发明还提供一种所述的玉米内生不动杆菌ACZLY512在制备提 高固氮菌固氮功能的产品中的应用。

进一步的，所述固氮菌为玉米内生固氮菌。

进一步的，所述提高固氮菌固氮功能具体为提高固氮菌的固氮酶 活性。

进一步的，所述固氮菌为复合固氮菌系或固氮菌单菌。

本发明还提供一种提高固氮菌固氮功能的方法，所述方法为目标 固氮菌与所述的玉米内生不动杆菌ACZLY512以1-9∶1的比例混合培 养。

本发明公开了以下技术效果：

(1)生物固氮是减少农业氮肥施用的关键技术手段，然而氧气 对固氮酶活性的抑制作用是固氮菌实际应用过程中效果不佳的重要 原因之一。本发明提供了一株在有氧或微氧条件下均提高固氮菌固氮 效率的配套菌株ACZLY512，因此，本发明为增强固氮微生物环境适 应性和提高固氮效率提供了关键配套材料。

(2)固氮微生物的挖掘和利用是全球微生物研究的重点和热点 之一，研究人员致力于筛选高效固氮菌株，而忽略了非固氮菌对固氮 菌的协同增效作用。以往研究，主要通过无氮培养基对固氮菌进行选 择筛选，这意味着筛选的第一步就将一些重要的非固氮菌排除在外。 因此，本发明对今后固氮菌的挖掘和利用工作具有重要的启示作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面 将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描 述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来 讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的 附图。

图1为不动杆菌ACZLY512在R2A固体培养基上的菌落形态；

图2为1％微氧条件下以固氮菌∶非固氮菌＝1∶1的比例添加非固氮 菌菌株对玉米内生固氮复合菌系固氮酶活性的影响；其中，F为克雷 伯氏菌(Klebsiella sp.)MNAZ1050、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.) MNAZ1397和假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228等比例混合组成 的固氮复合菌系F；a、b、c、d、e分别为非固氮不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ACZLY512、克吕沃尔氏菌(Kluyvera sp.) AZ981、大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC19374、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ACCC10190；*代表该处理与固氮复合菌系F有显著差异(p<0.05)；

图3为1％微氧条件下以固氮菌∶非固氮菌＝3∶1的比例添加非固氮 菌菌株对玉米内生固氮复合菌系固氮酶活性的影响；其中，F为克雷 伯氏菌(Klebsiella sp.)MNAZ1050、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.) MNAZ1397和假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228等比例混合组成 的固氮复合菌系F；a、b、c、d、e分别为非固氮不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ACZLY512、克吕沃尔氏菌(Kluyvera sp.) AZ981、大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC19374、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ACCC10190；*代表该处理与固氮复合菌系F有显著差异(p<0.05)；

图4为1％微氧条件下以固氮菌∶非固氮菌＝9∶1的比例添加非固氮 菌菌株对玉米内生固氮复合菌系固氮酶活性的影响；其中，F为克雷 伯氏菌(Klebsiella sp.)MNAZ1050、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.) MNAZ1397和假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228等比例混合组成 的固氮复合菌系F；a、b、c、d、e分别为非固氮不动杆菌 (Acinetobacter sp.)ACZLY512、克吕沃尔氏菌(Kluyvera sp.) AZ981、大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC19374、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ACCC10190；*代表该处理与固氮复合菌系F有显著差异(p<0.05)；

图5为21％正常空气含氧量条件下以固氮菌∶非固氮菌＝1∶1的比 例添加非固氮菌菌株对玉米内生固氮复合菌系固氮酶活性的影响；其 中，F为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)MNAZ1050、柠檬酸杆菌 (Citrobacter sp.)MNAZ1397和假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228 等比例混合组成的固氮复合菌系F；a、b、c、d、e分别为非固氮不 动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512、克吕沃尔氏菌(Kluyvera sp.) AZ981、大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC19374、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) ACCC10190；**代表该处理与固氮复合菌系F有极显著差异(p<0.01)；

图6为21％正常空气含氧量条件下以固氮菌∶非固氮菌＝3∶1的比 例添加非固氮菌菌株对玉米内生固氮复合菌系固氮酶活性的影响；其 中，F为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)MNAZ1050、柠檬酸杆菌 (Citrobacter sp.)MNAZ1397和假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228 等比例混合组成的固氮复合菌系F；a、b、c、d、e分别为非固氮不 动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512、克吕沃尔氏菌(Kluyvera sp.) AZ981、大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC19374、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) ACCC10190；**代表该处理与固氮复合菌系F有极显著差异(p<0.01)；

图7为21％正常空气含氧量条件下以固氮菌∶非固氮菌＝9∶1的比 例添加非固氮菌菌株对玉米内生固氮复合菌系固氮酶活性的影响；其 中，F为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)MNAZ1050、柠檬酸杆菌 (Citrobacter sp.)MNAZ1397和假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228 等比例混合组成的固氮复合菌系F；a、b、c、d、e分别为非固氮不 动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512、克吕沃尔氏菌(Kluyvera sp.) AZ981、大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC19374、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) ACCC10190；*代表该处理与固氮复合菌系F有显著差异(p<0.05)；

图8为1％微氧条件下以固氮菌∶非固氮菌＝1∶1的比例添加非固氮 菌菌株ACZLY512对玉米内生固氮菌单菌固氮酶活性的影响；其中，A 为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)MNAZ1050，B为柠檬酸杆菌 (Citrobacter sp.)MNAZ1397，C为假单胞菌(Pseudomonassp.) MNAZ228，a为不动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512；**代表添 加菌株ACZLY512后，对应的固氮菌固氮酶活性有极显著变化 (p<0.01)；

图9为1％微氧条件下以固氮菌∶非固氮菌＝5∶1的比例添加非固氮 菌菌株ACZLY512对玉米内生固氮菌单菌固氮酶活性的影响；其中，A 为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)MNAZ1050，B为柠檬酸杆菌 (Citrobacter sp.)MNAZ1397，C为假单胞菌(Pseudomonassp.) MNAZ228，a为不动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512；**代表添 加菌株ACZLY512后，对应的固氮菌固氮酶活性有极显著变化 (p<0.01)；

图10为1％微氧条件下以固氮菌∶非固氮菌＝9∶1的比例添加非固 氮菌菌株ACZLY512对玉米内生固氮菌单菌固氮酶活性的影响；其中， A为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)MNAZ1050，B为柠檬酸杆菌 (Citrobacter sp.)MNAZ1397，C为假单胞菌(Pseudomonassp.) MNAZ228，a为不动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512；*代表添 加菌株ACZLY512后，对应的固氮菌固氮酶活性有显著变化(p<0.05)；

图11为21％正常空气含氧量条件下以固氮菌∶非固氮菌＝1∶1的比 例添加非固氮菌菌株ACZLY512对玉米内生固氮菌单菌固氮酶活性的 影响；其中，A为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)MNAZ1050，B为柠 檬酸杆菌(Citrobacter sp.)MNAZ1397，C为假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228，a为不动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512；** 代表添加菌株ACZLY512后，对应的固氮菌固氮酶活性有极显著变化 (p<0.01)；

图12为21％正常空气含氧量条件下以固氮菌∶非固氮菌＝5∶1的比 例添加非固氮菌菌株ACZLY512对玉米内生固氮菌单菌固氮酶活性的 影响；其中，A为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)MNAZ1050，B为柠 檬酸杆菌(Citrobacter sp.)MNAZ1397，C为假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228，a为不动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512；** 代表添加菌株ACZLY512后，对应的固氮菌固氮酶活性有极显著变化 (p<0.01)；

图13为21％正常空气含氧量条件下以固氮菌∶非固氮菌＝9∶1的比 例添加非固氮菌菌株ACZLY512对玉米内生固氮菌单菌固氮酶活性的 影响；其中，A为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)MNAZ1050，B为柠 檬酸杆菌(Citrobacter sp.)MNAZ1397，C为假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228，a为不动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512；** 代表添加菌株ACZLY512后，对应的固氮菌固氮酶活性有极显著变化 (p<0.01)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方 案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部 分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普 通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结 合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1菌株ACZLY512的分离、筛选及鉴定

1.1菌株ACZLY512的分离和筛选

(1)菌株ACZLY512来源于掖单13号玉米品种茎部输导组织汁 液。选择玉米基部以上的第3节茎中央位置，用修枝剪将玉米茎截断， 由于玉米根压作用，玉米茎部输导组织汁液将从横切面处流出，利用 0.5g无菌脱脂棉球吸取该汁液，将脱脂棉球装入50ml无菌离心管， 放置于冰面带回实验室。

(2)在超净工作台中，向装有脱脂棉球的离心管中加入2mL 0.9％ 无菌生理盐水，摇床28℃，160rpm培养1小时，充分混匀。取培养 后的液体稀释10倍，取稀释液100μL涂布于R2A固体培养基，在 28℃培养2-4d。当培养基长出菌落后挑菌，用划线法对菌株进行3 次纯化，-70℃保存于30％甘油。

R2A固体培养基(g L

(3)菌株ACZLY512在R2A固体培养基上的菌落呈乳白色，半透 明，圆形凸起，边缘整齐(图1)。

(4)菌株ACZLY512的16S rDNA序列分析：利用细菌16S rDNA 通用引物F27/R1492进行PCR扩增。F27/R1492引物序列分别为 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO：1)和TACGGCTACCTTGTTACGACTT (SEQ ID NO：2)。PCR体系为25μL，包括12.5μL EasyTaq PCRSuperMix(北京全式金生物技术有限公司),F27/R1492引物各1μL (10μM)，10.5μL无菌水，用枪头直接将单菌落点入PCR体系中进 行扩张。PCR扩增条件为：94℃2分钟；94℃30秒，50℃40秒， 72℃1分钟，进行30个循环；最后72℃10分钟。经1％琼脂糖凝胶 电泳检测后，纯化产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。 测序结果表明，菌株ACZLY512为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)， 16S rDNA序列如SEQ ID NO：3所示。

SEQ ID NO：3：

GCCCTCTTTGCAGTTAGGCTAGCTACTTCTGGTGCACAAACTCCCATGGTGTGAC GGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACT AGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGATCGGCTTT TTGAGATTAGCATCCTATCGCTAGGTAGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTG TGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACTGGCAGTATCCTTAAAGTTCCCATCCGAAATGCTGGCAAGTAAGGAAAAGGGTT GCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAG CACCTGTATGTAGATTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTTCTACTATGTCA AGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGC GGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTAC TTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGCCTCAAAGGCCCCAACGGCTAGTAGACATCGTT TACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGCACCTCAG CGTCAGTGTTAGGCCAGATGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCA TTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCATCCTCTCCCACACTCTAGCCAACCAGTATCG AATGCAATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACATTTGACTTAATTGGCCGCCTACGC GCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCT GGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCGAGTAACGTCCACTCATCTTGGGTATTAAC CAAAAGAGCCTCCTCCTCGCTTAAAGTGCTTTACAACCATAAGGCCTTCTTCACACACG CGGCATGGCTGGATCAGGGTTCCCCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGT AGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCATCCTCTCAGACCCGCTACA GATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACTTAGGCTCATCT ATTAGCGCAAGGTCACAAGTGATCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAG CATCCCTTTCGAGATGTTGTCCCCCACTAATAGGCAGATTCCTAAGCATTACTCACCCG TCCGCCGCTAAGTGATAGTGCAAGCACCATCACTCCGCTCGA

1.2鉴定菌株ACZLY512是否为固氮菌

1.2.1利用无氮培养基进行验证

将菌株ACZLY512划线至Ashby固体无氮培养基，连续传代2次， 第一代表现为微弱生长，第二代表现为不生长，表明菌株ACZLY512 不能在无氮培养基上生长。

Ashby固体无氮培养基(g L

1.2.2利用固氮酶nifH基因PCR扩增验证

PCR前引物和后引物分别为Pol-F(TGCGAYCCSAARGCBGACTC(SEQ ID NO：4))和Pol-R(ATSGCCATCATYTCRCCGGA(SEQ ID NO：5))， PCR体系为25μL，包括12.5μL EasyTaq PCRSuperMix(北京全式 金生物技术有限公司)，1μL Pol-F前引物(10μM)，1μL Pol-R后 引物(10μM)，10.5μL无菌水，用枪头直接将单菌落点入PCR体系 中进行扩张。PCR扩增条件为：94℃2分钟；94℃30秒，55℃30 秒，72℃1分钟，进行30个循环；最后72℃10分钟。经1％琼脂糖凝胶电泳检测，菌株ACZLY512没有被扩增出nifH基因目的条带，表 明菌株ACZLY512无固氮酶nifH基因。

1.2.3利用乙炔还原法测定固氮酶活性验证

从R2A固体培养基上挑取待检测的ACZLY512单菌落，接种于4mL R2A液体培养基中，摇床160rpm，28℃过夜培养。次日菌液在4℃条 件下离心10min，5000rpm，去除上清液。用等量0.9％生理盐水重悬 洗涤菌体2次，在相同条件下离心10min，以去除残留的培养基、抗 生素以及菌体代谢产物。将洗涤之后的菌液OD600调至1.0。在无菌 的20mL顶空瓶中加入4.5mL DN无氮液体培养基和0.5mL OD600为 1.0的ACZLY512菌液，使得培养液初始OD600为0.1。每个样品做5 个试验重复。向每个顶空瓶用氩气置换4min，以排净瓶中空气。向 每个充好氩气的顶空瓶中分别注入占瓶内体积1％的氧气和占瓶内体 积10％的乙炔气体。将注完气的顶空瓶置于28℃摇床培养，160rpm。 记录时间，12小时后利用气相色谱仪检测乙烯含量，计算固氮酶活 性。结果显示菌株ACZLY512不能将乙炔转化为乙烯，表明无固氮酶活性。

DN无氮液体培养基(g L

1.2.4结论

综上所述，菌株ACZLY512为一株玉米内生非固氮不动杆菌，其 分类命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512，已于2021年 05月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)， 保藏编号为CGMCC No.22268。

实施例2与其他非固氮菌相比，菌株ACZLY512对内生固氮菌固 氮功能的促进作用

2.1用于固氮效果验证试验的固氮复合菌系F及其他4株非固氮 对比菌株

为了比较菌株ACZLY512和其他非固氮菌对内生固氮菌影响的差 异，选取3株固氮细菌，等比例混合组成固氮复合菌系F。另外，除 菌株ACZLY512外，再选取其他4株非固氮菌作为菌株ACZLY512的对 比菌株，研究添加非固氮菌对固氮复合菌系F固氮作用的影响。除氧 气加入量不同外，固氮酶活性验证方法同实施例1。

2.1.1固氮复合菌系F

固氮复合菌系F为：3株固氮细菌分别为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)MNAZ1050，保藏编号为CGMCC No.22270；柠檬酸杆菌 (Citrobacter sp.)MNAZ1397，保藏编号为CGMCCNo.22267；假单 胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228，保藏编号为CGMCC No.22266(三 株菌已于2021年05月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所)。

在1％微氧条件下，上述3株菌均能进行固氮作用，等比例混合 组成固氮复合菌系F。固氮复合菌系F在1％微氧条件下固氮酶活性为 1439.0nmol C

2.1.2其他4株非固氮对比菌株

其他4株非固氮对比菌株为：除本发明获得的菌株ACZLY512外， 本实施例另外选取其他4株非固氮菌作为对比菌株，分别为克吕沃尔 氏菌(Kluyvera sp.)AZ981(该菌株已于2021年05月06日保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳 区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.22269，图2-7中用b表示)、大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10 (购买自天根生化科技(北京)有限公司，图2-7中用c表示)、枯 草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC19374(中国农业微生物菌种 保藏管理中心，保藏编号为ACCC19374，图2-7中用d表示)、荧光 假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)ACCC10190(中国农业微生物 菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC10190，图2-7中用e表示)。 菌株ACZLY512在图2-7中用a表示。菌株ACZLY512和上述4株对比 菌株均无固氮酶nifH基因，无固氮酶活性，它们等比例混合组成的 复合菌系abcde固氮酶活性在有氧或微氧条件下均为0nmol C

2.2在1％微氧条件下

2.2.1以固氮菌∶非固氮菌＝1∶1的比例添加菌株ACZLY512

当固氮复合菌系F以1∶1的比例添加菌株ACZLY512后(F+a)， 其固氮酶活性高达1949.1nmol C

2.2.2以固氮菌∶非固氮菌＝3∶1的比例添加菌株ACZLY512

当固氮复合菌系F以3∶1的比例添加菌株ACZLY512后(F+a)， 其固氮酶活性高达1985.2nmol C

2.2.3以固氮菌∶非固氮菌＝9∶1的比例添加菌株ACZLY512

当固氮复合菌系F以9∶1的比例添加菌株ACZLY512后(F+a)， 其固氮酶活性高达1890.5nmol C

2.3在21％正常空气含氧量条件下

2.3.1以固氮菌∶非固氮菌＝1∶1的比例添加菌株ACZLY512

固氮复合菌系F以1∶1的比例添加菌株ACZLY512后(F+a)，其 固氮酶活性高达1006.9nmol C

2.3.2以固氮菌∶非固氮菌＝3∶1的比例添加菌株ACZLY512

固氮复合菌系F以3∶1的比例添加菌株ACZLY512后(F+a)，其 固氮酶活性高达913.8nmol C

2.3.3以固氮菌∶非固氮菌＝9∶1的比例添加菌株ACZLY512

固氮复合菌系F以9∶1的比例添加菌株ACZLY512后(F+a)，其 固氮酶活性达155.3nmol C

2.4结论

在微氧条件下(氧气含量1％)，当固氮复合菌系F以1∶1的比例 添加菌株ACZLY512后，固氮复合菌系F的固氮活性显著提高35.4％； 当固氮复合菌系F以3∶1的比例添加菌株ACZLY512后，固氮复合菌 系F的固氮活性显著提高38.0％；当固氮复合菌系F以9∶1的比例添 加菌株ACZLY512后，固氮复合菌系F的固氮活性显著提高31.4％。

在有氧条件下(氧含量21％，正常空气含氧量)，固氮复合菌系 自身的固氮作用受到氧气严重抑制，当固氮复合菌系F以1∶1的比例 添加菌株ACZLY512后，固氮复合菌系F的固氮活性显著提高9.8倍； 当固氮复合菌系F以3∶1的比例添加菌株ACZLY512后，固氮复合菌 系F的固氮活性显著提高8.8倍；当固氮复合菌系F以9∶1的比例添 加菌株ACZLY512后，固氮复合菌系F的固氮活性显著提高0.7倍。

实施例3菌株ACZLY512对固氮菌单菌固氮功能的促进作用

为了验证菌株ACZLY512对固氮菌单菌固氮功能的影响，分别选 取3株固氮细菌分别为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)MNAZ1050(图 8-13中用A表示)、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)MNAZ1397(图 8-13中用B表示)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228(图8-13 中用C表示)。

3.1在1％微氧条件下的固氮酶活性测定

3.1.1以固氮菌∶非固氮菌＝1∶1的比例添加菌株ACZLY512

克雷伯氏菌MNAZ1050(A)固氮酶活性为1261.6nmol C

固氮柠檬酸杆菌MNAZ1397(B)固氮酶活性为1092.5nmol C

固氮假单胞菌MNAZ228(C)固氮酶活性为971.9nmol C

3.1.2以固氮菌∶非固氮菌＝5∶1的比例添加菌株ACZLY512

克雷伯氏菌MNAZ1050(A)固氮酶活性为1261.6nmol C

固氮柠檬酸杆菌MNAZ1397(B)固氮酶活性为1092.5nmol C

固氮假单胞菌MNAZ228(C)固氮酶活性为971.9nmol C

3.1.3以固氮菌∶非固氮菌＝9∶1的比例添加菌株ACZLY512

克雷伯氏菌MNAZ1050(A)固氮酶活性为1261.6nmol C

固氮柠檬酸杆菌MNAZ1397(B)固氮酶活性为1092.5nmol C

固氮假单胞菌MNAZ228(C)固氮酶活性为971.9nmol C

3.2在21％正常空气含氧量条件下的固氮酶活性测定

3.2.1以固氮菌∶非固氮菌＝1∶1的比例添加菌株ACZLY512

固氮菌克雷伯氏菌MNAZ1050(A)固氮酶活性为22.9nmol C

固氮柠檬酸杆菌MNAZ1397(B)固氮酶活性为18.7nmol C

固氮菌假单胞菌MNAZ228(C)固氮酶活性为13.6nmol C

3.2.2以固氮菌∶非固氮菌＝5∶1的比例添加菌株ACZLY512

固氮菌克雷伯氏菌MNAZ1050(A)固氮酶活性为22.9nmol C

固氮柠檬酸杆菌MNAZ1397(B)固氮酶活性为18.7nmol C

固氮菌假单胞菌MNAZ228(C)固氮酶活性为13.6nmol C

3.2.3以固氮菌∶非固氮菌＝9∶1的比例添加菌株ACZLY512

固氮菌克雷伯氏菌MNAZ1050(A)固氮酶活性为22.9nmol C

固氮柠檬酸杆菌MNAZ1397(B)固氮酶活性为18.7nmol C

固氮菌假单胞菌MNAZ228(C)固氮酶活性为13.6nmol C

3.3结论

在微氧条件下(氧气含量1％)，以1∶1的比例添加菌株ACZLY512 能显著提高克雷伯氏菌MNAZ1050、柠檬酸杆菌MNAZ1397、假单胞菌 MNAZ228的固氮效率，固氮酶活性增加幅度在27.8％-45.3％之间；以 5∶1的比例添加菌株ACZLY512能显著提高克雷伯氏菌MNAZ1050、柠 檬酸杆菌MNAZ1397、假单胞菌MNAZ228的固氮效率，固氮酶活性增 加幅度在26.1％-38.6％之间；以9∶1的比例添加菌株ACZLY512能显 著提高克雷伯氏菌MNAZ1050、柠檬酸杆菌MNAZ1397、假单胞菌MNAZ228的固氮效率，固氮酶活性增加幅度在14.5％-28.1％之间。

在有氧条件下(氧含量21％，正常空气含氧量)，克雷伯氏菌 MNAZ1050、柠檬酸杆菌MNAZ1397、假单胞菌MNAZ228等固氮菌的固 氮作用受到氧气严重抑制，固氮酶活性均小于23nmol C

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本 发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普 通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本 发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120> 一种玉米内生不动杆菌ACZLY512及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1395

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccctctttg cagttaggct agctacttct ggtgcacaaa ctcccatggt gtgacgggcg 60

gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcattct gatccgcgat tactagcgat 120

tccgacttca tggagtcgag ttgcagactc caatccggac tacgatcggc tttttgagat 180

tagcatccta tcgctaggta gcaacccttt gtaccgacca ttgtagcacg tgtgtagccc 240

tggccgtaag ggccatgatg acttgacgtc gtccccgcct tcctccagtt tgtcactggc 300

agtatcctta aagttcccat ccgaaatgct ggcaagtaag gaaaagggtt gcgctcgttg 360

cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca gccatgcagc acctgtatgt 420

agattcccga aggcaccaat ccatctctgg aaagtttcta ctatgtcaag gccaggtaag 480

gttcttcgcg ttgcatcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa 540

ttcatttgag ttttagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gtctacttat cgcgttagct 600

gcgccactaa agcctcaaag gccccaacgg ctagtagaca tcgtttacgg catggactac 660

cagggtatct aatcctgttt gctccccatg ctttcgcacc tcagcgtcag tgttaggcca 720

gatggctgcc ttcgccatcg gtattcctcc agatctctac gcatttcacc gctacacctg 780

gaattctacc atcctctccc acactctagc caaccagtat cgaatgcaat tcccaagtta 840

agctcgggga tttcacattt gacttaattg gccgcctacg cgcgctttac gcccagtaaa 900

tccgattaac gcttgcaccc tctgtattac cgcggctgct ggcacagagt tagccggtgc 960

ttattctgcg agtaacgtcc actcatcttg ggtattaacc aaaagagcct cctcctcgct 1020

taaagtgctt tacaaccata aggccttctt cacacacgcg gcatggctgg atcagggttc 1080

cccccattgt ccaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt 1140

cccagtgtgg cggatcatcc tctcagaccc gctacagatc gtcgccttgg taggccttta 1200

ccccaccaac tagctaatcc gacttaggct catctattag cgcaaggtca caagtgatcc 1260

cctgctttct cccgtaggac gtatgcggta ttagcatccc tttcgagatg ttgtccccca 1320

ctaataggca gattcctaag cattactcac ccgtccgccg ctaagtgata gtgcaagcac 1380

catcactccg ctcga 1395

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgcgayccsa argcbgactc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atsgccatca tytcrccgga 20