一种MMP-3试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物领域，尤其涉及一种MMP-3试剂盒及其制备方法和应用。

技术背景

基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3），是基质金属蛋白酶家族的一员。综合近年来关于MMP-3的文献及相关研究，发现MMP-3是优于各项传统指标，针对类风湿关节炎（RA）的早期诊断、病情活动监测、药物指导及预后方面存在着巨大的潜在价值，且血清MMP-3易于检测，无疑会在减轻患者负担的同时，也是帮助临床医生调整治疗决策的有力工具，应将其纳入类风湿关节炎（RA）人群的日常评估、监测和治疗中。此外，MMP-3属于基质溶解酶中的一种，能够降解多种基质成分，与肿瘤浸润与转移密切相关，不少研究发现MMP-3与神经胶质瘤、眼部肿瘤、乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、肝癌等十几种肿瘤有着密切的关系，监测血清MMP-3有望成为肿瘤早期诊断和监测复发的有效手段。

现有的MMP-3体外诊断试剂盒制备方法多为胶乳增强免疫比浊法，这种方法在操作时都会用到离心设备与超声设备，但是离心设备与超声设备的运用需要大量的时间与人力成本，，因此不利于工业化的应用。

发明内容

为了解决上述现有的技术问题，本发明专利提供了一种切向流过滤+均质机分散的制备方式，用于替代离心机和超声仪，可节省操作时间以及设备成本。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种MMP-3试剂盒，所述MMP-3试剂盒包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R2中的抗人MMP-3抗体胶乳颗粒制备方法包括：

S1：活化胶乳微球颗粒；

S2：加入抗人MMP-3抗体使其与活化后的胶乳颗粒结合；

S3：将已经结合了抗体的胶乳颗粒进行封闭，得到胶乳体系；

S4：使用切向流系统将所述胶乳体系进行换液；

S5：使用均质机对换液后产生聚集的胶乳颗粒进行分散。

应当理解，本发明的步骤并不限于上述步骤，在步骤S1之前、步骤S1和S2之间、步骤S2和S3之间、步骤S3和S4之间、步骤S4和S5之间，步骤S5之后还可以包括其他额外的步骤，且均在本发明的保护范围之内。

优选的，所述试剂R1包括三羟甲基氨基甲烷、电解质、高分子促聚剂、表面活性剂和保护剂。

所述R2包括缓冲液、电解质、抗人MMP-3抗体胶乳颗粒、保护剂和稳定剂。

优选地，所述试剂R1中的高分子促聚剂为聚乙二醇6000；所述试剂R1中的表面活性剂为吐温-20；所述试剂R1和R2中的电解质均为氯化钠；所述试剂R1和R2中的保护剂均为BSA；所述试剂R2中的稳定剂为甘油。

更优选的，所述试剂R1包括TRIS、氯化钠、BSA、PEG6000、吐温-20和叠氮钠。

更优选的，所述试剂R2包括TRIS、氯化钠、BSA、甘油、抗人MMP-3抗体胶乳颗粒和叠氮钠。

优选地，本发明中使用的胶乳颗粒不含表面活性剂，可不用清洗直接使用，减少了操作工序。

优选地，本发明中使用的抗体为鼠抗人MMP-3抗体，效价高，灵敏度与线性范围更优。

优选的，在S4中，所述切向流系统由中空纤维膜柱、蠕动泵以及称重天平组成，设备之间以软管连接；更优选的，所述中空纤维膜柱的孔径为750kD，材质为mPES，内径纤维为1mm，膜面积为0.51cm²，长度为65cm；

优选地，所用蠕动泵的转速能达到650rpm/min，可为切向流系统提供足够动力。

本发明的一些具体实施例中，使用的切向流采用的是中空纤维膜柱，相对于普通膜包，其膜面积更大，孔径更宽，流速更快不易堵塞。

更优选的，所述称重天平称量误差在0.01g以内；

更优选的，所述软管型号为25#。

优选的，在S5中，所述的均质机为胶乳分散专用均质机，处理量为40L/h，施加的最大工作压力为1000bar。根据不同的胶乳粒径来选择合适的工作压力。

优选的，在S1中，使用EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐）活化胶乳微球颗粒；优选的，所述的EDC需要配置成水溶液使用，即配即用。

优选的，在S1中，胶乳微球颗粒的粒径为100-120nm，固含量为5%。

本发明第二个方面公开了一种MMP-3试剂盒的制备方法，所述MMP-3试剂盒包括试剂R1和试剂R2；

所述试剂R1的制备方法为：将TRIS、氯化钠、BSA（牛血清白蛋白）、PEG6000、吐温-20和叠氮钠依次加入纯水中，搅拌至完全溶解后，调整pH至7.4；

所述试剂R2的制备方法为：将TRIS、氯化钠、BSA、甘油和叠氮钠加入纯水中至完全溶解后，调整pH至7.4得到R2保存液；接着制备抗人MMP-3抗体胶乳颗粒并换液；用均质机将换液完成的抗人MMP-3抗体胶乳颗粒进行均质，得到试剂R2。

本发明第三个方面公开了上述的试剂盒或上述的方法在医学领域中的应用；优选的，根据上述的试剂盒或上述的方法在类风湿关节炎早期诊断领域中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过胶乳增强免疫比浊法制备得到MMP-3试剂盒，该MMP-3试剂盒具有灵敏度高，线性范围广，重复性好，稳定性优良等优点；使用切向流与均质设备帮助试剂盒的生产，减少了需使用多台离心机的高昂设备成本，降低了需多名操作人员的人力成本。

附图说明

图1为三个实施例与比较例在定标曲线的拟合图。

具体实施方式

下面通过详细的实施例对本申请进行进一步的阐述，应该理解，下述实施例仅是为了用于说明本申请，并不对发明内容进行限定。

实施例中所用仪器、设备、试剂均可通过各种渠道获得，例如购买得到，或可以制备而得。

试剂R1的制备：

TRIS 12g/L；

氯化钠 8.5g/L；

BSA 10g/L；

PEG6000 30g/L；

吐温-20 1g/L；

叠氮钠 1g/L；

根据上述的配方，称取准确的量，依次投入纯化水中，搅拌至完全溶解，然后调整pH=7.4即可。

试剂R2保存液的制备：

TRIS 12g/L；

氯化钠 8.5g/L；

BSA 2g/L；

甘油 0.5g/L；

叠氮钠 0.5g/L；

根据上述的配方，称取准确的量，依次投入纯化水中，搅拌至完全溶解，然后调整pH=7.4即可。

试剂R2胶乳颗粒的制备（1L量）：

实施例1-3所使用的的过滤设备参数：

表1

实施例 1

（1）取100ml胶乳与50mM MES（pH=6.0）混匀，使其固含量为1%；

（2）配制5ml 10mg/ml的EDC水溶液，将其投入上述胶乳混合液中，在摇床上（120rpm，26℃）活化15min；

（3）待15min活化时间到后，将抗人MMP-3抗体投入上述混合液中，浓度为0.2g/L，之后在摇床上（120rpm，26℃）偶联2h；

（4）偶联完成后，在上述混合液中加入BSA，使溶液中BSA浓度为1%，在摇床上（120rpm，26℃）封闭1h；

（5）使用表1中的超滤膜包与蠕动泵使用软管连接之后，使用R2保存液对封闭完成的胶乳颗粒进行换液；

（6）使用均质机对换液完成的胶乳颗粒进行均质，工作压力为600bar，粒径分散后的液体即为试剂R2。

实施例 2

（1）取100ml胶乳与50mM MES（pH=6.0）混匀，使其固含量为1%；

（2）配制5ml 10mg/ml的EDC水溶液，将其投入上述胶乳混合液中，在摇床上（120rpm，26℃）活化15min；

（3）待15min活化时间到后，将抗人MMP-3抗体投入上述混合液中，浓度为0.2g/L，之后在摇床上（120rpm，26℃）偶联2h；

（4）偶联完成后，在上述混合液中加入BSA，使溶液中BSA浓度为1%，在摇床上（120rpm，26℃）封闭1h；

（5）使用表1中的中空纤维膜柱与蠕动泵使用软管连接之后，使用R2保存液对封闭完成的胶乳颗粒进行换液；

（6）使用均质机对换液完成的胶乳颗粒进行均质，工作压力为600bar，粒径分散后的液体即为试剂R2。

实施例 3

（1）取100ml胶乳与50mM MES（pH=6.0）混匀，使其固含量为1%；

（2）配制5ml 10mg/ml的EDC水溶液，将其投入上述胶乳混合液中，在摇床上（120rpm，26℃）活化15min；

（3）待15min活化时间到后，将抗人MMP-3抗体投入上述混合液中，浓度为0.2g/L，之后在摇床上（120rpm，26℃）偶联2h；

（4）偶联完成后，在上述混合液中加入BSA，使溶液中BSA浓度为1%，在摇床上（120rpm，26℃）封闭1h；

（5）使用表1中的中空纤维膜柱与蠕动泵使用软管连接之后，使用R2保存液对封闭完成的胶乳颗粒进行换液；

（6）使用均质机对换液完成的胶乳颗粒进行均质，工作压力为600bar，粒径分散后的液体即为试剂R2。

比较例

（1）取100ml胶乳与50mM MES（pH=6.0）混匀，使其固含量为1%；

（2）配制5ml 10mg/ml的EDC水溶液，将其投入上述胶乳混合液中，在摇床上（120rpm，26℃）活化15min；

（3）待15min活化时间到后，将抗人MMP-3抗体投入上述混合液中，浓度为0.2g/L，之后在摇床上（120rpm，26℃）偶联2h；

（4）偶联完成后，在上述混合液中加入BSA，使溶液中BSA浓度为1%，在摇床上（120rpm，26℃）封闭1h；

（5）由于离心机一次处理量有限，将封闭完成的胶乳颗粒分成5批，取其中1批分成六管，两两配平，将其放入超高速冷冻离心机后，设置转速为20000RPM，时间为30min，开始离心；

（6）离心结束后，小心倒掉管内上清液，在管中加入5ml R2保存液，使用移液枪对其进行吹打，最终无明显结块即可结束吹打；

（7）将吹打完成的胶乳颗粒，放在超声波破碎仪下进行超声至粒径不再变化；

（8）将剩下的4批，按照（5）-（7）步骤进行操作，最终超声完全后使用R2保存液稀释即可。

比对测试：

测试仪器：日立7180生化分析仪/UV-2450紫外分光光度计

操作步骤：

（1）使用紫外分光光度计测试三个实施例与比较例的空白吸光度，使用R2保存液调整至大致相同，计算损耗率以及整个R2包被过程所用的时间；

（2）在日立7180生化分析仪上使用MMP-3校准品，定标三个实施例与比较例，查看定标曲线的差异。如表2和表3所示。

表2

表3

表3对应的结果如图1所示，从这些数据可知，切向流法相对于离心法，所用时间更短，损耗率更低，试剂性能基本一致。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。