一种测定免疫球蛋白G4的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种测定免疫球蛋白G4的试剂盒及其制备方法。

背景技术

免疫球蛋白G(immunoglobulin G，Ig G)是一种由浆细胞产生在血液中含量最高的免疫球蛋白，约占免疫球蛋白总量的75.0％-80.0％，在细胞免疫及体液免疫中均发挥重要的作用。IgG由于重链恒定域的序列不同而分为不同亚型，例如IgGl、IgG2、IgG3以及IgG4四种亚型，IgG4(immunoglobulin G4，IgG4)属于IgG中含量最低的一个亚型，约占血清总IgG含量的0.8％-11.7％，血清IgG4在人体内的正常含量为0.08-1.4g/L，平均为0.56g/L，其半衰期为21天。

免疫球蛋白G4相关疾病(IgG4-related disease，IgG4-RD)是一种新近发现的系统性自身免疫性疾病，其特征性改变为一个或多个器官局灶弥散性炎性细胞浸润和/或脏器肿大，表现为血清IgG4水平升高，以及典型的组织病理学改变-淋巴样浆细胞浸润、席纹状间质纤维化和闭塞性静脉炎。IgG4-RD可以同时或先后累及单个器官或多个器官，从而表现为不同的临床症候群：主要包括自身免疫性胰腺炎(AIP)、米库利奇病(Mikuliczdisease，MD)、腹膜后纤维化(retroperitoneal fibrosis，RPF)、硬化性胆管炎、肾小球膜性病变及小管间质性肾炎(tubulointerstitial nephritis，TIN)等疾病。

目前，IgG4的检测手段主要为：酶联免疫法(ELISA)以及免疫比浊法，而ELISA由于其需要进行手工操作且耗时较长，在临床上尚未大规模使用。普通比浊法一般直接使用抗血清或多抗制备R2试剂，但抗血清或多抗中存在大量非特异性蛋白，且IgGl、IgG2、IgG3和IgG4四种亚型之间差异较小，采用多抗容易发生交叉反应，难以特异性识别IgG4。

发明内容

本发明提供一种定量免疫球蛋白G4的试剂盒，通过选用极低粒径的胶乳微球，以及优化胶乳微球的标记过程：在胶乳微球标记过程中回添微量IgG4单克隆抗体的方法，增加了IgG4单克隆抗体与胶乳微球的标记效率，显著提升了试剂的检测性能，尤其是试剂的抗HOOK能力。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：一种测定免疫球蛋白G4的试剂盒，包括试剂R2，其特征在于：所述试剂R2包括10-80mmol/L缓冲液、0.1-1mol/L无机盐、20-80g/L封闭蛋白以及30-80ml/L包被有IgG4单克隆抗体的胶乳微球，所述胶乳微球的粒径为20-50nm。

优选地，还包括试剂R1，所述试剂R1包括：50-100mol/L的缓冲液、0.1-1mol/L的无机盐、10-40g/L的加速剂、2-10g/L的表面活性剂以及0.5-1.5g/L的防腐剂。

优选地，在试剂R2中：所述缓冲液选自MOPS、Tris、硼酸缓冲液或磷酸盐缓冲液中的至少一种，优选为硼酸缓冲液或Tris缓冲液；所述无机盐选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述封闭蛋白选自BSA或酪蛋白中的至少一种。

优选地，在试剂R1中：所述缓冲液选自MOPS、柠檬酸钠缓冲液、Tris或MES中的至少一种，所述无机盐选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述加速剂选自PEG8000、PEG6000或PEG20000中的至少一种；所述表面活性剂选自TX-100、Brij58、A90或Tween-20中的至少一种；所述防腐剂选自叠氮钠或PC3000中的至少一种。

优选地，所述试剂R1的PH为6.0-8.0；所述试剂R2的PH为6.0-8.0。

一种如上述任一项的测定免疫球蛋白G4试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)试剂R1的制备

试剂R1按照下述配方进行配置：

50-100mol/L的缓冲液、0.1-1mol/L的无机盐、10-40g/L的加速剂、2-10g/L的表面活性剂以及0.5-1.5g/L的防腐剂；

所述缓冲液选自MOPS、柠檬酸钠缓冲液、Tris或MES中的至少一种；所述无机盐选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述加速剂选自PEG8000、PEG6000或PEG20000中的至少一种；所述表面活性剂选自TX-100、Brij58、A90或Tween-20中的至少一种；所述防腐剂选自叠氮钠或PC3000中的至少一种；

(2)试剂R2的制备

将胶乳微球加入标记缓冲液中，搅拌均匀；随后向其中加入NHS/EDC活化剂活化，搅拌均匀；向活化的胶乳微球溶液中加入IgG4单克隆抗体，搅拌均匀后孵育6-14h；加入1％封闭蛋白，孵育1h后，向制备好的试剂中回添IgG4单克隆抗体，混匀，最终放入烘箱中老化3天。

所述缓冲液选自MOPS、Tris、硼酸缓冲液或磷酸盐缓冲液中的至少一种；优选为硼酸缓冲液或Tris缓冲液；所述无机盐选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述封闭蛋白选自BSA或酪蛋白中的至少一种。

优选地，所述胶乳微球的粒径为20-50nm。

优选地，在步骤(2)中，向制备好的试剂中回添IgG4单克隆抗体的含量为0.2-0.5mg。

优选地，所述活化剂采用EDC/NHS，所述NHS与EDC以及胶乳微球的质量比为：1∶(20-40)，所述IgG4单克隆抗体与胶乳微球的质量比为1∶(0.5-1)。

优选地，所述试剂R2中包被有IgG4单克隆抗体的胶乳颗粒的含量为20-30％。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明通过选用极低粒径的微球，以及在包被有IgG4单克隆抗体胶乳微球的制备过程中回添微量抗体的方法，增加了胶乳微球与抗体的标记效率，显著提升了试剂盒的检测性能，显著提升了试剂的抗HOOK能力，使试剂的线性范围达到0.04-7.0g/L；

(2)本发明的胶乳试剂制备过程减去了常规的离心步骤，极大的缩短了试剂盒的制备工艺，简化了制备流程；

(3)本发明通过选用IgG4单克隆抗体标记低粒径微球的方式，在检测过程中不需要额外对样本进行稀释，减少了样本前处理步骤，在保证检测精密度以及准确度的基础上，简化了样本的检测流程。

附图说明

图1为根据本发明实施例3所提供的IgG4赋值样本理论浓度与A组试剂盒测定值的线性关系图；

图2为根据本发明实施例3所提供的IgG4赋值样本理论浓度与B组试剂盒测定值的线性关系图；

图3根据本发明实施例3所提供的IgG4赋值样本理论浓度与C组试剂盒测定值的线性关系图；

图4为根据本发明实施例4所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与A组试剂盒测定值的线性关系图；

图5为根据本发明实施例4所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与B组试剂盒测定值的线性关系图；

图6为根据本发明实施例4所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与C组试剂盒测定值的线性关系图；

图7为根据本发明实施例4所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与D组试剂盒测定值的线性关系图；

图8为根据本发明实施例4所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与E组试剂盒测定值的线性关系图；

图9为根据本发明实施例5所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与A组试剂盒测定值的线性关系图；

图10为根据本发明实施例5所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与B组试剂盒测定值的线性关系图；

图11为根据本发明实施例5所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与C组试剂盒测定值的线性关系图；

图12为根据本发明实施例5所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与D组试剂盒测定值的线性关系图；

图13为根据本发明实施例5所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与E组试剂盒测定值的线性关系图；

图14为根据本发明实施例6所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与A组试剂盒测定值的线性关系图；

图15为根据本发明实施例6所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与B组试剂盒测定值的线性关系图；

图16为根据本发明实施例6所提供的IgG4超高赋值样本理论浓度与C组试剂盒测定值的线性关系图。

具体实施例

本文包括以下的实施例，用于以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。本领域技术人员根据本文的公开应当理解，可以在所公开的特定的实施方式中进行许多改变但是仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的思想和范围。本发明的具体实施方式仅用于解释本发明，而非意图通过任何方式限制本发明。

实施例1 IgG4检测试剂盒的制备

本发明的免疫球蛋白G4(IgG4)检测试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分。

1.试剂R1的制备

按照下述配方进行配置，充分搅拌混匀后，放于2-8℃保存。

试剂R1：

2.试剂R2的制备

b.将100μL 40nm(固含量10％)的胶乳微球加入2ml 30mM Tris的标记缓冲液中，搅拌均匀；

c.向上述溶液中加入0.3mg NHS和0.5mg EDC活化微球，匀速搅拌0.5h；

d.向活化的胶乳微球溶液中加入150.0μL 10g/L的鼠抗人IgG4单克隆抗体，搅拌均匀后孵育6h；

e.加入1％封闭蛋白BSA，孵育1h后，向制备好的试剂中再加入20ul 10g/L的鼠抗人IgG4单克隆抗体，混匀，最终放入37℃烘箱中老化3天。

实施例2试剂盒的使用方法

本实施例中，使用全自动生化分析仪(日立7180)配合本发明试剂盒进行样本检测。

1.仪器参数设置

2.测定方案

3.计算方式

血清样品中IgG4可与试剂中的抗IgG4抗体结合形成抗原-抗体-微球复合物，产生一定浊度，该浊度高低在一定抗体存在时与抗原的含量成正比，在一定波长下测定浊度并通过多点定标曲线可进行IgG4的定量测定。

样本中补体IgG4(g/L)＝CS×ΔAT/ΔAS(g/L)

(式中：ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值，ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值，CS校准液中IgG4的浓度)

实施例3试剂盒性能测试

为了验证本发明试剂盒的各项性能，共设置3组试剂盒进行性能验证：

A组：本发明实施例1制备得到的试剂盒；

B组：专利CN112198319A实施例1所述方法制备得到的试剂盒；

C组：免疫球蛋白G亚型4检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法-柏荣)。

(1)准确度验证

使用三组试剂盒分别对免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法，西门子)赋值样本进行准确度测试，设2个重复，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，计算测定均值与靶值的相对偏差进行准确度验证。检测结果如下表所示：

表1准确度验证

由上述实验结果可知，三组试剂盒测试值1与靶值1的相对偏差分别为1.36％、3.18％、-4.09％，测试值2与靶值2的相对偏差分别为0.91％、3.41％、4.77％。其中，本发明实施例1制备得到的试剂盒(A组)检测准确度优于对比试剂盒-1(B组)以及对比试剂盒-2(C组)。

(2)精密度验证

选取临床IgG4低值样本、中值样本以及高值样本，使用三组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定10次，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，分别计算测定均值和标准差，计算变异系数进行精密度考察。检测结果如下表所示：

表2精密度验证

由上述实验结果可知，三组试剂盒在低值样本检测时的变异系数分别为1.57％、4.97％以及3.35％，中值样本检测时的变异系数分别为3.35％、2.35％以及1.49％，高值样本检测时的变异系数分别为0.84％、4.88％以及8.29％，实验结果说明，三组试剂盒在中值样本的检测中均具有较好的精密度，而在低值样本的检测中，A组试剂盒的CV值显著低于B组试剂盒，同时在高值样本的检测中，A组试剂盒的CV值显著低于B组以及C组，说明本发明实施例1制备得到的试剂盒(A组)在检测低值样本以及高值样本时的精密度优于对照试剂盒-1(B组)以及对照试剂盒-2(C组)。

(3)线性范围验证

选择免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法，西门子，货号)在全自动生化分析仪(日立7180)对超高值样本赋值，其中高值样本的理论浓度值为7.12g/L，随后利用高值样本以及超纯水按比例配置各浓度梯度样本，使用三组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定2次，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，分别计算测定均值进行线性范围考察。检测结果如下表所示：

表3线性范围验证

由上述实验结果可知，本发明实施例1制备得到的试剂盒(A组)在样本浓度为0.04-7.12g/L范围内，检测值与理论值的相对偏差均较小，特别是在5.34-7.12g/L范围内时，其检测值与理论值的相对偏差均小于1％。而对照试剂盒-1(B组)以及对照试剂盒-2(C组)在样本浓度大于5.34g/L时，其检测值与理论值的相对偏差均大于20％。同时，将三组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行相关性分析(如附图1-3所示)，A组检测值与理论值的相关性显著优于B组以及C组，其中A组检测值与理论值的相关性R

实施例4回添抗体对试剂抗HOOK效应的影响

为了验证胶乳微球标记过程，回添IgG4单克隆抗体可以有效优化试剂的抗HOOK能力，共设置5组试剂盒进行验证：

A组：本发明实施例1制备得到的试剂盒；

B组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中未回添IgG4单克隆抗体，其余制备方法均与实施例1相同；

C组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中，回添10ul 10g/L IgG4单克隆抗体，其余制备方法均与实施例1相同；

D组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中，回添50ul 10g/L IgG4单克隆抗体，其余制备方法均与实施例1相同；

E组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中，回添100ul 10g/L IgG4单克隆抗体，其余制备方法均与实施例1相同；

选择免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法，西门子)在全自动生化分析仪(日立7180)对超高值样本赋值，样本浓度为27.62g/L，利用超纯水按比例稀释配置各浓度梯度样本，使用三组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定3次，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，分别计算测定均值及相对偏差SD进行抗HOOK能力验证。检测结果如下表所示：

表4试剂盒抗HOOK能力验证

由上述实验结果，将所述五组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行比对分析(如附图4-8所示)，结果显示，本发明实施例1制备得到的试剂盒(A组)能够达到的抗HOOK能力为24.17g/L(测定均值-3SD的值＞7.00时对应的最高浓度，为该试剂的抗HOOK能力值)；B组试剂盒的抗HOOK能力较低；C组试剂盒的抗HOOK能力为17.26g/L；D组试剂盒的抗HOOK能力为20.72g/L；E组试剂盒的抗HOOK能力为13.81g/L。

综上，本发明通过在胶乳微球的标记过程中回添适量抗体，可以有效提升试剂的抗HOOK能力，回添抗体量为0.2-0.5mg IgG4单克隆抗体时，试剂的抗HOOK能力最好。

实施例5胶乳微球粒径对试剂抗HOOK能力的影响

为了验证胶乳微球粒径对试剂抗HOOK能力的影响，共设置5组试剂盒进行验证：

A组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，选用粒径为10nm的胶乳微球，其余制备方法均与实施例1相同；

B组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，选用粒径为30nm的胶乳微球，其余制备方法均与实施例1相同；

C组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，选用粒径为50nm的胶乳微球，其余制备方法均与实施例1相同；

D组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，选用粒径为100nm的胶乳微球，其余制备方法均与实施例1相同；

E组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，选用粒径为150nm的胶乳微球，其余制备方法均与实施例1相同。

选择免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法，西门子)在全自动生化分析仪(日立7180)对超高值样本赋值，样本浓度为27.62g/L，利用超纯水按比例稀释配置各浓度梯度样本，使用三组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定3次，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，分别计算测定均值及相对偏差SD进行抗HOOK能力验证。检测结果如下表所示：

表5试剂盒抗HOOK能力验证

由上述实验结果，将所述五组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行比对分析(如附图9-13所示)，结果显示，A组试剂盒的抗HOOK能力较低(测定均值-3SD的值＞7.00时对应的最高浓度，为该试剂的抗HOOK能力值)；B组试剂盒的抗HOOK能力为20.72g/L；C组试剂盒的抗HOOK能力为24.17g/L；D组试剂盒的抗HOOK能力为17.26g/L；E组试剂盒的抗HOOK能力较低。

综上，本发明通过选用低粒径的微球，可以有效提升检测试剂的抗HOOK能力，当选用粒径为20-50nm的胶乳微球时，试剂盒的抗HOOK能力最高。

实施例6 IgG4单克隆抗体标记胶乳微球对试剂抗HOOK能力的影响

为了验证IgG4单克隆抗体标记胶乳微球对试剂抗HOOK能力的影响，共设置3组试剂盒进行验证：

A组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在与，选用兔抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体

B组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，选用羊抗人免疫球蛋白G4多克隆抗体；

Ｃ组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，选用兔抗人免疫球蛋白G4多克隆抗体；

选择免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法，西门子)在全自动生化分析仪(日立7180)对超高值样本赋值，样本浓度为27.62g/L，利用超纯水按比例稀释配置各浓度梯度样本，使用三组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定3次，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，分别计算测定均值及相对偏差SD进行抗HOOK能力验证。检测结果如下表所示：

表6试剂盒抗HOOK能力验证

由上述实验结果，将所述三组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行比对分析(如附图14-16所示)，结果显示，A组试剂盒的抗HOOK能力为20.72g/L(测定均值-3SD的值＞7.00时对应的最高浓度，为该试剂的抗HOOK能力值)；B组试剂盒的抗HOOK能力为13.81g/L；C组试剂盒的抗HOOK能力为13.81g/L。

综上，本发明通过选用IgG4单克隆抗体标记低粒径微球，可以有效提升检测试剂的抗HOOK能力。于此同时，在检测过程中不需要额外对样本进行稀释，减少了样本前处理步骤，在保证检测精密度以及准确度的基础上，简化了样本的检测流程。

实施例7

本实施例中共设置4组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂R1中的表面活性剂种类不相同，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述五种试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：

表7

注：本实施例中A组试剂R1中为2g/L Brij58；B组为2g/LTX-100；C组为2g/LA90；D组为2g/L TWEEN-20，其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。

实验结果表明，在试剂R1中添加上述4种表面活性剂时，试剂的检测精密度均较高，尤其是添加Tween-20时，精密度最高大达到了1.65％。

实施例8

本实施例中共设置5组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂R1中的表面活性剂(TWEEN-20)浓度不相同，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述五种试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：

表8

注：本实施例中A组试剂R1中TWEEN-20的浓度为1g/L；B组为2g/L；c组为5g/L；D组为10g/L；E组为20g/L，其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。

实验结果表明，在试剂R1中表面活性剂TWEEN-20的浓度范围为2-10g/L时，试剂盒的检测精密度更高。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下，在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变形。