包含环(组氨酸-脯氨酸)二肽及甲状旁腺激素的组合物用于预防、改善或治疗骨质流失疾病的用途

技术领域

本发明涉及一种包含环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)和甲状旁腺激素的组合物用于预防、改善或治疗骨质流失疾病的用途。

背景技术

骨塑建(bone modeling)和重建(remodeling)过程在骨的发育、生长和代谢中起着重要作用。骨塑建从出生开始，一直持续到骨成熟和生长结束的青壮年期，并在20岁至30岁初期形成最多骨量。之后的大约30年里，不断重复去除骨和补充骨的骨重建过程，此时骨形成和骨吸收成对保持平衡。在此之后，由于骨形成不足以赶上骨吸收引起的骨质流失，导致骨量每年减少约0.3～0.5％，尤其是女性，在更年期早期，每年会经历2～3％的显著骨质流失。

骨组织构成软骨和骨骼系统，起到作为机械功能的支撑和肌肉附着的作用，负责保护生物器官和骨髓，并保存钙和磷离子以维持体内平衡。骨组织由胶原蛋白、糖蛋白等细胞基质和成骨细胞(osteoblasts)、破骨细胞、骨细胞等多种细胞构成。

并且，骨组织是由成骨细胞形成并不断被破骨细胞吸收和破坏的动态组织，骨质疏松症是由成骨细胞和破骨细胞失衡导致骨吸收比骨形成增强而引起的疾病，随着骨组织的钙化减少，骨骼致密性变薄，骨髓腔变宽，随着病情的发展，骨骼变得越来越脆弱，因此即使受到很小的冲击也很容易骨折。

已知骨质疏松症导致很容易由骨骼变弱而不是症状本身引起的各种骨折，尤其是股骨骨折或椎骨骨折等限制了长期活动，使人们无法过上健康的生活，最终导致15％的老年人死亡由骨质疏松症引起。骨量受多种因素影响，例如遗传因素、营养摄入、荷尔蒙变化以及运动和生活方式的差异等。骨质疏松症的已知原因包括年老、缺乏运动、低体重、吸烟、低钙饮食、更年期和卵巢切除术等。尤其是女性，30岁以后骨质流失会继续发展，到了更年期，由于荷尔蒙的变化，骨质流失会迅速发展。

像这样，尽管程度有所不同，但骨质疏松症是老年人尤其是绝经后女性不可避免的症状，随着人口老龄化，发达国家对骨质疏松症及其治疗剂的兴趣逐渐增加。并且，已知全球与骨病治疗相关的市场约有1300亿美元，预计未来还会进一步增长，因此世界各地的研究机构和制药公司都在大力投资开发骨病治疗剂，目前骨吸收抑制剂的研发正在积极进行中。

近年来，甲状旁腺激素(PTH)已成为一种流行的骨质疏松症治疗剂。与减少骨吸收(bone resorption)的其他疗法不同，甲状旁腺激素增加骨质量，并进一步增加骨密度(bone mineral density，BMD)。甲状旁腺激素对骨骼有多种直接和间接作用。甲状旁腺激素增加钙从骨骼到血液中的释放率。甲状旁腺激素的慢性效果是增加成骨细胞(osteoblast)及破骨细胞(osteoclast)两侧所有骨细胞的数量并增加骨重建(remodelingbone)。给予骨质疏松症患者的甲状旁腺激素尤其在脊柱和髋关节内的小梁骨(trabecularbone)中产生骨形成的网刺激(net stimulation)，从而显著减少骨折。骨形成被认为是通过甲状旁腺激素刺激成骨细胞而发生的，就像成骨细胞具有甲状旁腺激素受体一样。

在这种背景下，本发明人寻求一种当与甲状旁腺激素一同被用作复合剂时可以增强对骨质流失疾病的治疗效果的物质，当甲状旁腺激素与环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)一起使用时，确认到其对成骨细胞分化和促进骨形成表现出协同效应，从而完成了本发明。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：韩国公开专利第10-2008-0059430号

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供一种用于预防或治疗骨质流失疾病的药物组合物，包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素。

本发明的再一目的在于，提供一种用于预防或改善骨质流失疾病的保健功能性食品组合物，包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其食品学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素。

本发明的还有一目的在于，提供一种用于增强甲状旁腺激素对骨质流失疾病治疗效果的药物组合物，包含环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其药学上可接受的盐。

本发明的另一目的在于，提供一种用于增强甲状旁腺激素对骨质流失疾病改善效果的保健功能性食品组合物，包含环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其食品学上可接受的盐。

进一步地，本发明的目的在于，提供一种骨质流失疾病的预防或治疗方法，包括将有效量的组合物给予需要其的个体的步骤，上述组合物包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素(PTH)。

本发明的再一目的在于，提供一种增强甲状旁腺激素对骨质流失疾病的治疗效果的方法，包括将环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素(PTH)给予需要其的个体的步骤。

本发明的还有一目的在于，提供一种组合物在制备用于预防或治疗骨质流失疾病的药剂中的用途，上述组合物包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素(PTH)。

本发明的另一目的在于，提供一种组合物在制备用于增强甲状旁腺激素(PTH)对骨质流失疾病的预防或治疗效果的药剂中的用途，上述组合物包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐。

解决问题的手段

为了解决上述问题，本发明提供一种用于预防或治疗骨质流失疾病的药物组合物，包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素。

并且，本发明提供一种用于预防或改善骨质流失疾病的保健功能性食品组合物，包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其食品学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素。

进一步地，本发明提供一种用于增强甲状旁腺激素对骨质流失疾病治疗效果的药物组合物，包含环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其药学上可接受的盐。

并且，本发明提供一种用于增强甲状旁腺激素对骨质流失疾病改善效果的保健功能性食品组合物，包含环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其食品学上可接受的盐。

本发明提供一种骨质流失疾病的预防或治疗方法，包括将有效量的组合物给予需要其的个体的步骤，上述组合物包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素(PTH)。

并且，本发明提供一种增强甲状旁腺激素对骨质流失疾病的治疗效果的方法，包括将环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素(PTH)给予需要其的个体的步骤。

并且，本发明提供一种组合物在制备用于预防或治疗骨质流失疾病的药剂中的用途，上述组合物包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素(PTH)。

并且，本发明提供一种组合物在制备用于增强甲状旁腺激素(PTH)对骨质流失疾病的预防或治疗效果的药剂中的用途，上述组合物包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐。

根据本发明的一优选实施例，上述甲状旁腺激素可以为甲状旁腺激素

根据本发明的再一优选实施例，上述骨质流失疾病可以为选自由骨质疏松症、佩吉特病(Paget's disease)、牙槽骨流失、骨软化症及肾性骨营养不良症(renalosteodeystrophy)组成的组中的一种以上。

根据本发明的还有一优选实施例，上述骨质疏松症可能由于女性荷尔蒙减少、成骨细胞受到破坏或活性受到抑制而引起。

根据本发明的另一优选实施例，可以将上述环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素(PTH)同时(simultaneous)、单独(separate)或顺序(sequential)给药。

发明的效果

本发明的包含环(组氨酸-脯氨酸)二肽及甲状旁腺激素的用于预防、改善或治疗骨质流失疾病的组合物对成骨细胞分化和促进骨形成表现出协同效应，从而对治疗骨质流失疾病有效，由于环(组氨酸-脯氨酸)二肽增强甲状旁腺激素的成骨细胞分化和骨形成促进作用，因此当甲状旁腺激素用于预防、改善或治疗骨质流失疾病时，可将环(组氨酸-脯氨酸)二肽用作增效助剂。

附图说明

图1a及图1b为示出在MC3T3-E1成骨细胞分化期间根据环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)和甲状旁腺激素

图2a为示出在原代成骨细胞分化期间根据环(组氨酸-脯氨酸)二肽和人甲状旁腺激素

图2b为示出在原代成骨细胞分化期间根据环(组氨酸-脯氨酸)二肽和人甲状旁腺激素

图2c为示出在原代成骨细胞分化期间根据环(组氨酸-脯氨酸)二肽和人甲状旁腺激素

图2d为示出在原代成骨细胞分化期间根据环(组氨酸-脯氨酸)二肽和人甲状旁腺激素

图2e为示出在原代成骨细胞分化期间根据环(组氨酸-脯氨酸)二肽和人甲状旁腺激素

图2f为示出在原代成骨细胞分化期间根据环(组氨酸-脯氨酸)二肽和人甲状旁腺激素

图2g为示出在原代成骨细胞分化期间根据环(组氨酸-脯氨酸)二肽和人甲状旁腺激素

具体实施方式

以下，更加详细地描述本发明。

如上所述，本发明人寻求一种当与甲状旁腺激素一同被用作复合剂时可以增强对骨质流失疾病的治疗效果的物质，当甲状旁腺激素与环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)一起使用时，确认到其对成骨细胞分化和促进骨形成表现出协同效应，从而完成了本发明。

因此，本发明提供一种用于预防或治疗骨质流失疾病的药物组合物，包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素。

本发明还提供一种用于预防或改善骨质流失疾病的保健功能性食品组合物，包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其食品学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素。

进一步地，本发明提供一种用于增强甲状旁腺激素对骨质流失疾病治疗效果的药物组合物，包含环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其药学上可接受的盐，并且本发明提供一种用于增强甲状旁腺激素对骨质流失疾病改善效果的保健功能性食品组合物，包含环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其食品学上可接受的盐。

在本发明中，“环(组氨酸-脯氨酸)二肽(Cyclo-HisPro；CHP)”是一种天然存在的环状二肽(dipeptide)或通过TRH代谢过程和从头合成(de novo)在体内合成的生理活性二肽，广泛分布于整个脑、脊髓及胃肠道等的物质，上述环状二肽(dipeptide)由促甲状腺激素释放激素(thyrotropin-releasing hormone，TRH)的代谢产物即组氨酸-脯氨酸(Histidine-Proline)组成。

在本发明的组合物中，上述环(组氨酸-脯氨酸)二肽可通过合成使用或使用市售的。并且，可以从含有环(组氨酸-脯氨酸)二肽的物质，例如前列腺提取物中纯化来使用。

旨在通过使用术语“纯化的”来表示与可从诸如前列腺提取物之类的天然来源获得的形式相比，环(组氨酸-脯氨酸)二肽处于浓缩形式。纯化的成分可以从它们的天然来源浓缩或通过化学合成方法获得。

上述“前列腺提取物(prostate extract)”的主要组分为锌、环(组氨酸-脯氨酸)二肽、前列腺素前体及花生四烯酸、由于以高浓度含有环(组氨酸-脯氨酸)二肽，因此可以合理预期环(组氨酸-脯氨酸)二肽诱导的骨密度及骨体积比增加效果和成骨细胞分化和骨形成促进效果。

在本发明的组合物中，上述“前列腺提取物”可以是牛或猪的前列腺粉末等，优选地，为了提高环(组氨酸-脯氨酸)二肽的含量，能够以去除脂肪的形式使用，但不限于此。

在本发明的组合物中，上述“甲状旁腺激素(PTH)”可以是具有如下氨基酸序列的分泌性84个氨基酸残基多肽或其片段：Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-Gly-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asn-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln(序列编号1)。

根据本发明的一优选实施例，上述甲状旁腺激素(PTH)可以是牛或人激素的以下N-末端34个氨基酸组成的甲状旁腺激素

又被称为特立帕肽(teriparatide)的甲状旁腺激素(1-34)目前由位于美国Indiana州Indianapolis的礼来(Eli Lilly)公司以商品名FORTEO销售，用于治疗患有高骨折风险的骨质疏松症的绝经后女性。

在本发明中，术语“骨质流失”是指由破骨细胞与成骨细胞之间的失衡引起的骨质流失的症状，“骨质流失疾病”是指包括与上述症状相关的所有疾病。因此，包括由于破骨细胞的活性过高导致骨质流失引起的骨密度降低，或者成骨细胞的活性下降导致骨形成不良而引起的所有疾病。上述骨质流失疾病的具体例包括但不限于骨质疏松症、佩吉特病(Paget's disease)、牙槽骨流失、骨软化症及肾性骨营养不良症(renalosteodeystrophy)等。

在此情况下，上述骨质疏松症为更年期或绝经期症状之一，可能是由女性荷尔蒙减少而引起，或者是由成骨细胞受到破坏或活性受到抑制而引起。

在本发明中，术语“更年期”通常是指从具有生育能力的时期转换到丧失生育能力的时期。上述更年期主要用来指女性的更年期，但女性的更年期不仅包括绝经期(menopause)，还包括围绕绝经期(perimenopause)前后的时期，一般对应于40～60岁的年龄段。

本发明的包含环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素的组合物可以通过促进成骨细胞的分化来促进骨形成，从而可以预防、改善或治疗骨质流失疾病。

如图1a及1b所示，当将环(组氨酸-脯氨酸)二肽和人甲状旁腺激素

在本发明的用于预防、改善或治疗骨质流失疾病的组合物中，术语“预防”是指抑制或延迟疾病或病症发作的所有行为。在本发明中是指通过促进成骨细胞的分化来延迟骨质流失疾病的发作时期或抑制发作。

在本发明的用于预防、改善或治疗骨质流失疾病的组合物中，术语“改善”是指改善或有益地改变疾病或病症状态的所有行为，在本发明中是指通过促进成骨细胞分化的作用来改善诸如骨质疏松症的症状或牙槽骨流失之类的症状。

在本发明的用于预防、改善或治疗骨质流失疾病的组合物中，术语“治疗”是指延迟、停止或逆转疾病或病症进展的所有行为，在本发明中是指通过促进成骨细胞分化的作用来停止、减轻、缓解、消除或逆转牙槽骨或骨质流失等。

术语“协同效应(synergy effect)”是指当将每种成分联合(组合)给药时产生的效果大于作为单一成分单独给药时产生的效果之和(Chou and Talalay，Adv.Enzyme.Regul.，22:27-55，1984)。本发明的环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素通过联合给药来增加对骨质流失疾病的预防、改善或治疗效果。

术语“联合给药(administered in combination)”是指将化合物或成分一同给予患者。将每种化合物或成分一同给药是指可以将每种成分在相同的时间或按任何顺序或在不同时间按顺序给药以获得所需的治疗效果。

术语“患者”是指需要治疗的任何单一个体，包括人、牛、狗、豚鼠、兔、鸡、昆虫等。并且，对象包括参与临床研究试验但没有任何疾病临床表现的任何对象，或参与流行病学研究的对象或用作对照组的对象。

在本发明中，术语“药学上可接受的”是指生理学上可接受并且在给予人类时通常不会引起过敏反应或与此类似反应，上述盐优选是由药剂学上可接受的游离酸(freeacid)形成的酸加成盐。

上述药学上可接受的盐可以是利用有机酸或无机酸形成的酸加成盐，上述有机酸包括例如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、丁酸、异丁酸、三氟乙酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、富马酸、琥珀酸、琥珀酸单酰胺、谷氨酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、乙醇酸、葡萄糖醛酸、抗坏血酸、苯甲酸、邻苯二甲酸、水杨酸、邻氨基苯甲酸、二氯乙酸、氨氧乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸或甲磺酸。无机酸包括例如盐酸、溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸或硼酸。酸加成盐可以优选为盐酸盐或乙酸盐的形式，更优选为盐酸盐的形式。

除此之外，盐还可以是加巴盐、加巴喷丁盐、普瑞巴林盐、烟酸盐、己二酸盐、半丙二酸盐、半胱氨酸盐、乙酰半胱氨酸盐、甲硫氨酸盐、精氨酸盐、赖氨酸盐、鸟氨酸盐或天冬氨酸盐。

并且，本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体还可以包括例如用于口服给药的载体或用于肠胃外给药的载体。用于口服给药的载体可包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。用于肠胃外给药的载体可以包括水、合适的油、盐水、葡萄糖和乙二醇水溶液等。并且，还可以包括稳定剂及防腐剂。合适的稳定剂包括抗氧化剂，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯和氯丁醇。其他药学上可接受的载体可参考以下文献中记载的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences，19th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1995)。

本发明的药物组合物可以通过任何方法给予包括人类在内的哺乳动物。例如，可以口服或肠胃外给药，肠胃外给药方法包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠给药。

根据上述给药途径，本发明的药物组合物可以配制成用于口服给药或肠胃外给药的制剂。配制时，可以使用一种或多种缓冲液(例如盐水或磷酸盐缓冲液(PBS))、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖等)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)或谷胱甘肽)、填充剂、延伸剂、粘合剂、助剂(例如氢氧化铝)、悬浮剂、增稠剂、润湿剂、崩解剂或表面活性剂、稀释剂或赋形剂来配制。

用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、酸剂、颗粒剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、悬浮液或胶囊剂等，这些固体制剂在本发明的药物组合物中混合至少一种赋形剂，例如淀粉(包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉等)、碳酸钙(Calciumcarbonate)、蔗糖(Sucrose)、乳糖(Lactose)、葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇麦芽糖醇、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素或明胶等来配制。例如，可以通过将活性成分与固体赋形剂混合、研磨、加入合适的助剂并将它们加工成颗粒混合物来获得片剂或糖衣丸。

除了简单的赋形剂外，还使用硬脂酸镁滑石等润滑剂。用于口服的液体制剂包括悬浮剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂等，除了作为常用的简单稀释剂的水或液体石蜡外，还可包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香料或防腐剂等。

并且，根据情况，可以添加交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠作为崩解剂，可以进一步包括抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂和防腐剂等。

当肠胃外给药时，本发明的药物组合物可以根据本领域已知的方法以注射剂、经皮给药剂和鼻吸入剂的形式与合适的肠胃外载体一同配制。在上述注射剂的情况下，必须经过消毒并防止受到细菌和真菌等微生物的污染。对于注射剂，合适的载体的例子包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的混合物和/或含有植物油的溶剂或分散介质。更优选地，合适的载体可使用汉克斯溶液、林格溶液、具有三乙醇胺的磷酸盐缓冲盐水(磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffered saline))或如无菌注射用水、10％乙醇、40％丙二醇和5％葡萄糖等的等渗溶液。为了保护注射剂免受微生物污染，还可以加入各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。并且，在大多数情况下，注射剂还可含有糖或氯化钠等渗剂。

在经皮给药剂的情况下，包括软膏剂、乳膏剂、乳液剂、凝胶剂、外用溶液剂、糊剂、搽剂和空气剂等形式。在上文中，“经皮给药”是指通过将药物组合物局部给药至皮肤而将有效量的包含在药物组合物中的活性成分递送到皮肤中。

在吸入给药剂的情况下，根据本发明使用的化合物可以使用合适的推进剂，例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，来方便地以气溶胶喷雾的形式从加压包或雾化器中输送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供用于输送计量的量的阀来确定。例如，吸入器或吹入器中使用的明胶胶囊和药筒可配制成含有化合物和如乳糖或淀粉等的合适的粉末基质的粉末混合物。肠胃外给药的制剂描述于文献(Remington's Pharmaceutical Science，15th Edition，1975.Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania 18042，Chapter 87：Blaug，Seymour)中，这是所有制药化学中普遍公知的配方。

当本发明的药物组合物含有有效量的环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐和甲状旁腺激素时，可以提供预防、改善或治疗骨质流失疾病的优选效果。在本发明中，术语“有效量”是指表现出大于阴性对照组的反应的量，优选指足以预防、改善或治疗骨质流失疾病的量。本发明的药物组合物可以含有0.01％至99.9％的环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素，剩余量可以由药学上可接受的载体占据。本发明的药物组合物中所包含的环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素的有效量将根据组合物的产品化形式等而变化。

本发明的药物组合物的总有效量可以按单剂量(single dose)给予患者，并且可以通过长时间给予多剂量(multiple dose)的分次治疗方法(fractionated treatmentprotocol)给药。本发明的药物组合物可根据疾病的严重程度改变有效成分的含量。例如，以环(组氨酸-脯氨酸)二肽为基准，可以分一次至数次给药，给药量优选为每天每1kg体重0.001mg至100mg，更优选0.01mg至10mg。但是，上述环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素的剂量是根据患者的年龄、体重、保健状况、性别、疾病严重程度、饮食和排泄率以及药物组合物的给药途径和治疗次数等多种因素，以及有效剂量来确定的。考虑到上述情况，本领域普通技术人员能够确定上述环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素的根据用于预防、治疗或改善骨质流失疾病的特定用途的适当的有效剂量。根据本发明的药物组合物在其剂型、给药途径和给药方法方面没有特别限制，只要表现出本发明的效果即可。

本发明的用于预防或治疗骨质流失疾病的药物组合物可单独使用或与使用手术、放射治疗、激素治疗、化学治疗或生物反应调节剂的方法联合使用。

本发明的用于预防或治疗骨质流失疾病的药物组合物还能够以含有环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素的外用剂的剂型提供。在这方面，本发明的组合物可以是用于预防或改善骨质流失疾病的准药物组合物及包含上述组合物的准药物。

上述外用剂可以直接应用于皮肤或口腔内。当本发明的用于预防或治疗骨质流失疾病的药物组合物用作外用剂时，可以进一步包含脂肪物质、有机溶剂、增溶剂、增稠剂和胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(foaming agent)、香料、表面活性剂、水、离子乳化剂、非离子乳化剂、填充剂、金属离子螯合剂、络合剂、防腐剂、维生素、阻滞剂、润湿剂、精油、染料、色素、亲水性活性剂、亲脂性活性剂或可能含有皮肤科学领域常用的助剂，例如脂质囊泡等皮肤外用剂中常用的任何其他成分。并且，上述成分能够以皮肤科学领域常用的量引入。

当本发明的组合物提供为外用剂时，可以是液体剂、软膏、贴剂、凝胶、霜剂或喷雾剂等剂型，但不限于此。根据本发明的一实例，本发明的准药品可以包括口腔护理产品、软膏剂、面膜、湿敷剂、贴敷剂及经皮吸收剂等，上述口腔护理产品包括牙膏、漱口水和口腔喷雾剂。

当使用本发明的环(组氨酸-脯氨酸)二肽处理时，促进成骨细胞的分化，当上述有效成分应用于口腔护理产品时，通过促进成骨细胞的分化，可有效预防或改善牙槽骨疾病。因此，上述准药物组合物可以是用于预防或改善骨质流失的口腔护理用组合物。

当本发明的组合物作为准药物组合物使用时，可以直接加入环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素，或者可以根据常规方法与其他准药物成分一同适当使用。可以根据使用目的(预防、保健或治疗性处置)适当确定有效成分的混合量。

本发明的药物组合物及保健功能性食品组合物的内容可以比照适用于本发明的准药物组合物及准药物。

在本发明的保健功能性食品组合物中，作为“食品学上可接受的盐”即本发明的食品学上可接受的盐，有用的盐是由食品学上可接受的游离酸(free acid)形成的酸加成盐或由碱形成的金属盐。作为一例，可以使用无机酸和有机酸作为游离酸。可以使用盐酸、硫酸、溴酸、亚硫酸或磷酸作为无机酸，可以使用柠檬酸、乙酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、甲磺酸等作为有机酸。并且，可以使用碱金属盐或碱土金属盐、钠盐、钾盐或钙盐作为金属盐。但不一定限于此。

在本发明中，术语“保健功能性食品”包括“功能食品”和“保健食品”的含义。

在本发明中，术语“功能食品(functional food)”与特殊保健用食品(food forspecial health use，FoSHU)同义，是指经过加工处理后，除提供营养外，还能有效发挥生物调节功能的具有较高药效的食品。

在本发明中，术语，“保健食品(health food)”是指与一般食品相比具有积极的维持或增强保健效果的食品，保健辅助食品(health supplement food)是指以保健辅助为目的的食品。根据情况，术语“功能食品、保健食品、保健辅助食品”互换使用。上述食品可以制成各种形式，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、液状、丸等，以获得对骨质流失疾病的改善或恢复有用的效果。

作为这种功能食品的具体例，通过使用上述组合物，可以制备在利用农产品、畜产品或水产品的特性进行转化的同时具有改进的储存性的加工食品。

本发明的保健功能性食品组合物还可以制成营养补充剂(nutritionalsupplement)、食品添加剂(food additives)及饲料等形式，供包括人类或牲畜在内的动物食用。

可以根据本领域已知的常规方法以各种形式制备上述类型的食品组合物。常见食品包括但不限于饮料(包括酒精饮料)、水果及其加工食品(例：水果罐头、瓶装罐头、果酱、橘子酱等)、鱼类、肉类及其加工食品(例：火腿、咸牛肉香肠等)、面包类和面条类(例：乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面、通心粉等)、果汁、各种饮料、饼干、糖浆、乳制品(例：黄油、奶酪等)、食用植物油脂、人造黄油、植物蛋白、蒸煮食品、冷冻食品、各种调味品(例：豆酱、酱油、酱汁等)等，可在其中加入环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素来制备。

并且，营养补充剂可以通过将环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素添加到胶囊、片剂、丸等中来制备，但不限于此。

并且，保健功能性食品不限于此，但例如可以将上述环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素液化、颗粒化、胶囊化、粉末化来摄取，以便能够制成茶、汁、饮料形式来饮用(保健饮料)。并且，为了以食品添加剂的形式使用上述环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素，可以将其制成粉末或浓缩液形式来使用。并且，可以将上述环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素和骨质流失疾病的预防或已知有效预防或改善骨质流失疾病的已知活性成分一同混合来以组合物形式制备。

当本发明的食品组合物用作保健饮料组合物时，上述保健饮料组合物可以包含各种调味剂或天然碳水化合物作为附加成分，如常规饮料。上述天然碳水化合物可以是葡萄糖、果糖等单糖；麦芽糖、蔗糖等二糖类；糊精、环糊精等多糖类；木糖醇、山梨糖醇或赤藓糖醇等糖醇。作为甜味剂可以使用牛磺酸、甜菊提取物等天然甜味剂；糖精或阿斯巴甜等合成甜味剂。上述天然碳水化合物的比例通常为每100mL本发明组合物约0.01～0.04g，优选约0.02～0.03g。

环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素可以作为有效成分包含在用于预防或改善骨质流失疾病的食品组合物中，其含量是获得预防或改善效果的有效量，例如，优选地，相对于组合物总重量的0.01至100重量百分比，但不特别限于此。本发明的食品组合物可以通过将环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其盐及甲状旁腺激素与已知可有效预防或改善骨质流失疾病的其他活性成分一同混合来制备。

除上述之外，本发明的保健功能性食品还可包含各种营养剂、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸、果胶酸盐、海藻酸、海藻酸盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH值调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精或碳酸化剂等。此外，本发明的保健食品可以含有用于制备天然果汁、果汁饮料或植物饮料的水果。这些成分可以独立使用或混合使用。这些添加剂的比例并不重要，但通常每100重量份本发明的组合物在0.01～0.1重量份的范围内选择。

本发明还提供一种骨质流失疾病的预防或治疗方法，包括将有效量的组合物给予需要其的个体的步骤，上述组合物包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素(PTH)。

进一步地，提供一种增强甲状旁腺激素对骨质流失疾病的治疗效果的方法，包括将环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素(PTH)给予需要其的个体的步骤。

在本发明的方法中，术语“个体”包括但不限于任何动物(例如，人、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)。这些术语不表示特定的年龄或性别。因此，旨在无论是女性/雌性、男性/雄性、成人/成体及新生受试者以及胎儿均应包括在内。患者是指患有疾病或障碍的受试者。术语“患者”包括人和兽医学受试者。

在本发明的方法中，对于包括环(组氨酸-脯氨酸)二肽及甲状旁腺激素的效果及其给药途径、给药次数、剂量等在内的结构的描述与上述相同，因此将省略其描述。

在本发明的方法中，可以将环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素(PTH)同时(simultaneous)、单独(separate)或顺序(sequential)给药。例如，环(组氨酸-脯氨酸)二肽或其药学上可接受的盐和甲状旁腺激素可以共同配制并以组合的单位给药制剂同时给药，或者可以作为单独的制剂同时或顺序给药。

在顺序给药的情况下，每种有效成分可以作为单独的制剂以时间间隔给药，给药顺序可由医生或本领域普通技术人员确定。

本发明还提供一种组合物在制备用于预防或治疗骨质流失疾病的药剂中的用途，上述组合物包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐；以及甲状旁腺激素(PTH)。

本发明还提供一种组合物在制备用于增强甲状旁腺激素(PTH)对骨质流失疾病的预防或治疗效果的药剂中的用途，上述组合物包含：环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)或其药学上可接受的盐。

以下，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，由于本发明可以有多种变化，可以有多种形式，以下所描述的特定实施例和描述仅用于帮助理解本发明，而本发明不限于特定的公开的形式。应当理解，本发明的范围包括在本发明的思想和范围内的所有修改、等同技术方案和代替技术方案。

本发明的实施方式

准备例1

以下实施例中使用的环(组氨酸-脯氨酸)二肽(CHP)购自Bachem，人甲状旁腺激素

准备例2

出生第一天的C57BL/6pup购自Coretech公司，用于培养颅骨来源的原代成骨细胞(Calvarial primary osteoblast)。用于细胞分离的胶原酶(collagenase)和分散酶(dispase)分别购自Gibco公司和Roche公司。

准备例3

用于实时(Real-time)聚合酶链式反应(PCR)的引物使用了由Bioneer公司以如表1所示的碱基序列合成的引物。

表1

实施例1

环(组氨酸-脯氨酸)二肽和人甲状旁腺激素

1-1.MC3T3-E1成骨细胞培养条件

利用含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的MEMα、无抗坏血酸(noascorbic acid)培养基在37℃、5％CO

1-2.用环(组氨酸-脯氨酸)二肽、人甲状旁腺激素

在12孔板中，将2.5x10

表2

1-3.碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，碱性磷酸酶)活性测量

分化第14天，去除培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗一次后，每孔加入100μl的RIPA裂解缓冲液，并利用细胞刮刀(scraper)分离细胞。利用移液管将其转移到1.5ml管中，然后利用超声波破碎仪(Sonicator，振幅10，0.5秒脉冲，10次)进行破碎。在4℃下以15000rpm离心分离10分钟后，仅分离上层液。将分离出的每种裂解物样品按10μl先放入96孔板中，加入pNPP底物溶液200μl并在常温下反应1小时，在405nm处测量吸光度。

为了用裂解物的蛋白质浓度校正碱性磷酸酶活性值，通过BCA定量法对每种裂解物进行定量，并将405nm处的碱性磷酸酶活性吸光度值除以总蛋白量(Abs.OD405nm/μg ofanalyzed)。

对于统计学显著性，使用单向方差分析(One-way ANOVA)统计分析法，并使用图基(Tukey)事后检验法比较与对照组的显著性(*p<0.05)。

实验结果，如图1a及1b所示，确认到与人甲状旁腺激素

实施例2

环(组氨酸-脯氨酸)二肽和人甲状旁腺激素

2-1.原代成骨细胞的培养

仅分离了出生第1天的C57BL/6pup的颅骨(Calvaria)。在消化培养基(Digestionmedia)(加入0.1％胶原酶、0.2％分散酶的MEMα)中放入分离的颅骨，在37℃振荡并消化(digestion)5次，每次15分钟。丢弃第一次消化液(digested solution)，收集第二次至第五次消化液(digested solution)。在1600rpm离心分离5分钟，将细胞悬浮在培养基(加入10％胎牛血清(FBS)的MEMα)中后，使细胞经过0.2μm过滤器(strainer)来去除碎片(debris)。释放培养基中获得的细胞并在37℃、5％CO

2-2.用环(组氨酸-脯氨酸)二肽、人甲状旁腺激素

在12孔板中，将1x10

表3

2-3.细胞内核糖核酸(RNA)的提取

分化第6天，去除培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗一次后，放入NucleoZOL500μL裂解细胞。接着，根据NucleoZOL的总核糖核酸分离(Total RNA isolation)方案提取核糖核酸(RNA)，利用iScript互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成试剂盒，通过逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)将1μg核糖核酸(RNA)合成为互补脱氧核糖核酸(cDNA)。

2-4.成骨细胞分化和成骨相关基因表达的分析

使用对应于每个基因的正向/反向引物组，通过iQ SYBR Green Supermix对合成的互补脱氧核糖核酸(cDNA)实时(Real-time)进行聚合酶链式反应(PCR)并分析。每个基因表达值通过将其除以管家基因β-肌动蛋白的表达值进行校正。对于统计学显著性，使用单向方差分析(One-way ANOVA)统计分析法，并使用图基(Tukey)事后检验法比较与对照组的显著性(*p<0.05，**p<0.01)。

实验结果，如图2a所示，确认到人甲状旁腺激素

如图2b及2c所示，确认到由成骨细胞分化的同时分泌的骨形成蛋白2(BMP2)和骨钙素(Osteocalcin)基因在人甲状旁腺激素

如图2d及2e所示，确认到与对照组相比，人甲状旁腺激素

通过上述结果，确认到人甲状旁腺激素

序列表

<110> 诺麦塔制药有限公司

<120> 包含环（组氨酸-脯氨酸）二肽及甲状旁腺激素的组合物用于预防、改善或治疗骨质流失疾病的用途

<130> PCT5040486

<150> KR10-2019-0058369

<151> 2019-05-17

<160> 18

<170> PatentIn版本3.2

<210> 1

<211> 84

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 甲状旁腺激素

<400> 1

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser

35 40 45

Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu

50 55 60

Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asn Val Asp Val Leu Thr Lys

65 70 75 80

Ala Lys Ser Gln

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 甲状旁腺激素1-34

<400> 2

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 碱性磷酸酶正向引物

<400> 3

agatggcctg gatctcatca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 碱性磷酸酶反向引物

<400> 4

cagtgcggtt ccagacatag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 骨形成蛋白2正向引物

<400> 5

tggaagtggc ccatttagag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 骨形成蛋白2反向引物

<400> 6

tgacgctttt ctcgtttgtg 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 骨钙素正向引物

<400> 7

ctgctcactc tgctgacc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 骨钙素反向引物

<400> 8

ttgtcagact cagggccg 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 成骨相关转录因子抗体正向引物

<400> 9

gaagtccaat ggggatctga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 成骨相关转录因子抗体反向引物

<400> 10

agaatccctt tccctctcca 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 核心结合因子α1正向引物

<400> 11

aagtgcggtg caaactttct c 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 核心结合因子α1反向引物

<400> 12

tgcttgcagc cttaaatatt cc 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 胶原蛋白1a1正向引物

<400> 13

ctaacgtggt tcgtgaccg 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 胶原蛋白1a1反向引物

<400> 14

gctgcggatg ttctcaatct 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 骨保护素正向引物

<400> 15

ggaatagatg tcaccctgtg t 21

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 骨保护素反向引物

<400> 16

aaaacactca gccaatttgg tat 23

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> β-肌动蛋白正向引物

<400> 17

gggaaggtga cagcattg 18

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> β-肌动蛋白反向引物

<400> 18

atgaagtatt aaggcggaag att 23