一种叶黄素提高雨生红球藻中虾青素含量的生产工艺

技术领域

本发明属于虾青素生产领域，具体涉及一种叶黄素提高雨生红球藻中虾青素含量的生产工艺。

背景技术

虾青素是一种酮式类胡萝卜素，红色固体粉末，具脂溶性，不溶于水，可溶于有机溶剂，广泛存在于生物界中，特别是水生动物如虾、蟹、鱼和鸟类的羽毛中，起显色的作用，具有极强的抗氧化能力，可以清除二氧化氮、硫化物、二硫化物等，也可降低脂质过氧化作用，有效的抑制自由基引起的脂质过氧化作用，虾青素的主要生产方法包括人工合成和生物获取两种方式。人工合成虾青素仅价格昂贵，而天然虾青素的生物来源最适宜大规模生产的利用雨生红球藻积累虾青素，但它生长缓慢，培养过程中容易被其他生物污染，无法将其内部的虾青素全部提取。

目前，专利号为CN202110275002.1的发明专利公开了一种雨生红球藻中虾青素的提取方法，首先利用超声波细胞破碎仪可以有效的对雨生红球藻细胞壁进行破除，再利用有机溶剂对虾青素进行提取，通过针对性调整改进提取溶剂、提取时间、提取温度、提取次数、料液比等，使虾青素的提取效率显著提高，综合效益比强，本发明相较现有制备方法具有稳定性好、操作简单、制备时间短，提取效率高、可避免虾青素被氧化降解等优点，在工业生产中易于实现，值得推广应用。该提取方法所生产的虾青素的含量并不高，仅提高了加工的速度与效率，工作的产量不高，无法满足不同的加工生产需要。

因此，针对上述虾青素提取含量不高的问题，亟需得到解决，以改善虾青素的使用场景。

发明内容

（1）要解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种叶黄素提高雨生红球藻中虾青素含量的生产工艺，该生产工艺旨在解决现有技术下采用雨生红球藻对虾青素进行提取生产时候含量不高，且在进行加工的时候，还会出现加工原料提取不完全的技术问题。

（2）技术方案

为了解决上述技术问题，本发明提供了这样一种叶黄素提高雨生红球藻中虾青素含量的生产工艺，其步骤如下：

步骤一：将雨生红球藻细胞接种进行扩增培养，得到扩增培养物，对扩增培养物进行诱导培养，诱导藻细胞积累虾青素，得到诱导培养物，从诱导培养物分离得到雨生红球藻，雨生红球藻在扩增培养基中扩大培养；

步骤二：从扩增培养物分离藻细胞，转接至缺氮的BG11培养基中培养3-5天，加入生物诱导剂进行诱导培养24-48h，得到诱导培养物，诱导剂为燕麦的枯草芽孢杆菌发酵产物；

步骤三：使用雨生红球藻制备内容物料，将收集的雨生红球藻鲜藻进行静置沉降，去除上清液后进行均质破壁，得到破壁藻浆，在破壁藻浆中加入脂肪酶进行酶解，得到酶解破壁藻液，用于提取藻油，得到雨生红球藻藻油和藻渣，称取150-600g叶黄素，置于高压反应釜中，加入15-25mL的乳化剂，搅拌混合均匀，随后，向反应釜中加入5-40g的反应催化剂和20-60g的相转移催化剂，于90℃-150℃下反应10-30h，得玉米黄素；

步骤四：各称取30-80g的虎杖和决明，将其研磨成粉，加入浓度为40%-90%的乙醇溶剂100mL，对其回流提取过滤，得白藜芦醇，各称取20-60g的原儿茶酸和没食子酸，将其混合搅拌在一起，并向其中加入10-30g的柠檬酸和5-25g的α-葡庚糖酸钠，加水混匀后并水浴加热，得复合抗氧化剂；

步骤五：配制氮充足的BBM培养基，并在其中加入醋酸钠或醋酸镁，对培养基进行高压湿热灭菌，醋酸钠的加入量1-5g/L，醋酸镁的加入量为1–2.5g/L，将培养到对数生长期后期的雨生红球藻种子液接种到培养基中进行培养，使藻浓度在2.0×105-2.5×105cells/mL，每隔一天进行取样测其生物量，做培养基中雨生红球藻的生长曲线并将生物量最大时的雨生红球藻进行收集；

步骤六：称取0.5-2.4g卤化剂，并用1-15g氯仿溶解，缓慢加入到反应器中，反应1-15h，经三次水洗去除碱和盐后，得初液；

步骤七：将步骤四中的复合抗氧化剂加入到初液中，并向其中添加硅烷偶联剂，混合均匀后，经水浴加热后，过滤即得虾青素。

使用本技术方案的生产工艺时，将雨生红球藻细胞接种进行扩增培养，得到扩增培养物，对扩增培养物进行诱导培养，诱导藻细胞积累虾青素，得到诱导培养物，从诱导培养物分离得到雨生红球藻，雨生红球藻在扩增培养基中扩大培养，从扩增培养物分离藻细胞，转接至缺氮的BG11培养基中培养3-5天，加入生物诱导剂进行诱导培养24-48h，得到诱导培养物，诱导剂为燕麦的枯草芽孢杆菌发酵产物，使用雨生红球藻制备内容物料，将收集的雨生红球藻鲜藻进行静置沉降，去除上清液后进行均质破壁，得到破壁藻浆，在破壁藻浆中加入脂肪酶进行酶解，得到酶解破壁藻液，用于提取藻油，得到雨生红球藻藻油和藻渣，称取150-600g叶黄素，置于高压反应釜中，加入15-25mL的乳化剂，搅拌混合均匀，随后，向反应釜中加入5-40g的反应催化剂和20-60g的相转移催化剂，于90℃-150℃下反应10-30h，得玉米黄素，各称取30-80g的虎杖和决明，将其研磨成粉，加入浓度为40%-90%的乙醇溶剂100mL，对其回流提取过滤，得白藜芦醇，各称取20-60g的原儿茶酸和没食子酸，将其混合搅拌在一起，并向其中加入10-30g的柠檬酸和5-25g的α-葡庚糖酸钠，加水混匀后并水浴加热，得复合抗氧化剂，配制氮充足的BBM培养基，并在其中加入醋酸钠或醋酸镁，对培养基进行高压湿热灭菌，醋酸钠的加入量1-5g/L，醋酸镁的加入量为1–2.5g/L，将培养到对数生长期后期的雨生红球藻种子液接种到培养基中进行培养，使藻浓度在2.0×105-2.5×105cells/mL，每隔一天进行取样测其生物量，做培养基中雨生红球藻的生长曲线并将生物量最大时的雨生红球藻进行收集，称取0.5-2.4g卤化剂，并用1-15g氯仿溶解，缓慢加入到反应器中，反应1-15h，经三次水洗去除碱和盐后，得初液，将步骤四中的复合抗氧化剂加入到初液中，并向其中添加硅烷偶联剂，混合均匀后，经水浴加热后，过滤即得虾青素。

优选地，所述步骤一中的均质破壁采用的压力为0MPa-100MPa，破壁温度为40℃-60℃，破壁率≥95％。

优选地，所述步骤一中的脂肪酶用量占破壁藻浆质量的5％-10％，酶解温度为35℃-45℃，酶解时间为18-24h，酶解pH值为6.0-8.0。

优选地，所述步骤一中将1-15重量份的雨生红球藻藻油、1-5重量份的藻渣、1-10重量份的叶黄素酯、5-15重量份的维生素C以及20-40重量份的植物油混合，粉碎混匀后，过180目筛，得到所述内容物料。

优选地，所述步骤三中的高压湿热灭菌的条件为90-150℃，处理时间为10-30min。

优选地，所述乳化剂为十二烷基硫酸钠。

优选地，所述催化剂为亚磷酸。

优选地，所述步骤四中的水浴加热温度为50-90℃，水浴时间为10-40min。

优选地，所述步骤四中的搅拌速度为150-600r/min，搅拌时间为10-50min。

（3）有益效果

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的生产工艺所生产的虾青素含量明显多于原有生产工艺，通过增加了的叶黄素来提高雨生红球藻中虾青素的含量，同时通过加工工艺的优化，更好的进行加工生产的工作，提高工作的速度和效率，克服了皂化过程导致的虾青素损耗，使得高纯度虾青素酯产率高，工艺简单、简洁，所用分离纯化溶剂符合食品添加剂要求，且工艺操作简单，易于实现工业化。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面对本发明具体实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，以进一步阐述本发明，显然，所描述的具体实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的样式。

实施例1

本具体实施方式是用于提高雨生红球藻中虾青素含量的生产工艺，其步骤如下：

步骤一：将雨生红球藻细胞接种进行扩增培养，得到扩增培养物，对扩增培养物进行诱导培养，诱导藻细胞积累虾青素，得到诱导培养物，从诱导培养物分离得到雨生红球藻，雨生红球藻在扩增培养基中扩大培养；

步骤二：从扩增培养物分离藻细胞，转接至缺氮的BG11培养基中培养5天，加入生物诱导剂进行诱导培养48h，得到诱导培养物，诱导剂为燕麦的枯草芽孢杆菌发酵产物；

步骤三：使用雨生红球藻制备内容物料，将收集的雨生红球藻鲜藻进行静置沉降，去除上清液后进行均质破壁，得到破壁藻浆，在破壁藻浆中加入脂肪酶进行酶解，得到酶解破壁藻液，用于提取藻油，得到雨生红球藻藻油和藻渣，称取600g叶黄素，置于高压反应釜中，加入25mL的乳化剂，搅拌混合均匀，随后，向反应釜中加入40g的反应催化剂和60g的相转移催化剂，于150℃下反应30h，得玉米黄素；

步骤四：各称取80g的虎杖和决明，将其研磨成粉，加入浓度为90%的乙醇溶剂100mL，对其回流提取过滤，得白藜芦醇，各称取60g的原儿茶酸和没食子酸，将其混合搅拌在一起，并向其中加入30g的柠檬酸和25g的α-葡庚糖酸钠，加水混匀后并水浴加热，得复合抗氧化剂；

步骤五：配制氮充足的BBM培养基，并在其中加入醋酸钠或醋酸镁，对培养基进行高压湿热灭菌，醋酸钠的加入量5g/L，醋酸镁的加入量为2.5g/L，将培养到对数生长期后期的雨生红球藻种子液接种到培养基中进行培养，使藻浓度在2.5×105cells/mL，每隔一天进行取样测其生物量，做培养基中雨生红球藻的生长曲线并将生物量最大时的雨生红球藻进行收集；

步骤六：称取2.4g卤化剂，并用15g氯仿溶解，缓慢加入到反应器中，反应15h，经三次水洗去除碱和盐后，得初液；

步骤七：将步骤四中的复合抗氧化剂加入到初液中，并向其中添加硅烷偶联剂，混合均匀后，经水浴加热后，过滤即得虾青素。

实施例2

本具体实施方式是用于提高雨生红球藻中虾青素含量的生产工艺，其步骤如下：

步骤一：将雨生红球藻细胞接种进行扩增培养，得到扩增培养物，对扩增培养物进行诱导培养，诱导藻细胞积累虾青素，得到诱导培养物，从诱导培养物分离得到雨生红球藻，雨生红球藻在扩增培养基中扩大培养；

步骤二：从扩增培养物分离藻细胞，转接至缺氮的BG11培养基中培养3天，加入生物诱导剂进行诱导培养24h，得到诱导培养物，诱导剂为燕麦的枯草芽孢杆菌发酵产物；

步骤三：使用雨生红球藻制备内容物料，将收集的雨生红球藻鲜藻进行静置沉降，去除上清液后进行均质破壁，得到破壁藻浆，在破壁藻浆中加入脂肪酶进行酶解，得到酶解破壁藻液，用于提取藻油，得到雨生红球藻藻油和藻渣，称取150g叶黄素，置于高压反应釜中，加入15mL的乳化剂，搅拌混合均匀，随后，向反应釜中加入5g的反应催化剂和20g的相转移催化剂，于150℃下反应30h，得玉米黄素；

步骤四：各称取80g的虎杖和决明，将其研磨成粉，加入浓度为90%的乙醇溶剂100mL，对其回流提取过滤，得白藜芦醇，各称取20g的原儿茶酸和没食子酸，将其混合搅拌在一起，并向其中加入10g的柠檬酸和25g的α-葡庚糖酸钠，加水混匀后并水浴加热，得复合抗氧化剂；

步骤五：配制氮充足的BBM培养基，并在其中加入醋酸钠或醋酸镁，对培养基进行高压湿热灭菌，醋酸钠的加入量5g/L，醋酸镁的加入量为1g/L，将培养到对数生长期后期的雨生红球藻种子液接种到培养基中进行培养，使藻浓度在2.0×105cells/mL，每隔一天进行取样测其生物量，做培养基中雨生红球藻的生长曲线并将生物量最大时的雨生红球藻进行收集；

步骤六：称取2.4g卤化剂，并用15g氯仿溶解，缓慢加入到反应器中，反应15h，经三次水洗去除碱和盐后，得初液；

步骤七：将步骤四中的复合抗氧化剂加入到初液中，并向其中添加硅烷偶联剂，混合均匀后，经水浴加热后，过滤即得虾青素。

实施例3

本具体实施方式是用于提高雨生红球藻中虾青素含量的生产工艺，其步骤如下：

步骤一：将雨生红球藻细胞接种进行扩增培养，得到扩增培养物，对扩增培养物进行诱导培养，诱导藻细胞积累虾青素，得到诱导培养物，从诱导培养物分离得到雨生红球藻，雨生红球藻在扩增培养基中扩大培养；

步骤二：从扩增培养物分离藻细胞，转接至缺氮的BG11培养基中培养3天，加入生物诱导剂进行诱导培养24h，得到诱导培养物，诱导剂为燕麦的枯草芽孢杆菌发酵产物；

步骤三：使用雨生红球藻制备内容物料，将收集的雨生红球藻鲜藻进行静置沉降，去除上清液后进行均质破壁，得到破壁藻浆，在破壁藻浆中加入脂肪酶进行酶解，得到酶解破壁藻液，用于提取藻油，得到雨生红球藻藻油和藻渣，称取150g叶黄素，置于高压反应釜中，加入25mL的乳化剂，搅拌混合均匀，随后，向反应釜中加入5g的反应催化剂和60g的相转移催化剂，于90℃下反应10h，得玉米黄素；

步骤四：各称取30g的虎杖和决明，将其研磨成粉，加入浓度为90%的乙醇溶剂100mL，对其回流提取过滤，得白藜芦醇，各称取20g的原儿茶酸和没食子酸，将其混合搅拌在一起，并向其中加入30g的柠檬酸和25g的α-葡庚糖酸钠，加水混匀后并水浴加热，得复合抗氧化剂；

步骤五：配制氮充足的BBM培养基，并在其中加入醋酸钠或醋酸镁，对培养基进行高压湿热灭菌，醋酸钠的加入量1g/L，醋酸镁的加入量为1g/L，将培养到对数生长期后期的雨生红球藻种子液接种到培养基中进行培养，使藻浓度在2.5×105cells/mL，每隔一天进行取样测其生物量，做培养基中雨生红球藻的生长曲线并将生物量最大时的雨生红球藻进行收集；

步骤六：称取0.5g卤化剂，并用15g氯仿溶解，缓慢加入到反应器中，反应1h，经三次水洗去除碱和盐后，得初液；

步骤七：将步骤四中的复合抗氧化剂加入到初液中，并向其中添加硅烷偶联剂，混合均匀后，经水浴加热后，过滤即得虾青素。

其中，均质破壁采用的压力为100MPa，破壁温度为60℃，破壁率≥95％，的脂肪酶用量占破壁藻浆质量的10％，酶解温度为45℃，酶解时间为24h，酶解pH值为8.0，将15重量份的雨生红球藻藻油、5重量份的藻渣、10重量份的叶黄素酯、15重量份的维生素C以及40重量份的植物油混合，粉碎混匀后，过180目筛，得到内容物料，高压湿热灭菌的条件为150℃，处理时间为30min，乳化剂为十二烷基硫酸钠，催化剂为亚磷酸，水浴加热温度为90℃，水浴时间为40min，搅拌速度为600r/min，搅拌时间为50min。

使用本技术方案的清洁装置时，将雨生红球藻细胞接种进行扩增培养，得到扩增培养物，对扩增培养物进行诱导培养，诱导藻细胞积累虾青素，得到诱导培养物，从诱导培养物分离得到雨生红球藻，雨生红球藻在扩增培养基中扩大培养，步骤一中的均质破壁采用的压力为100MPa，破壁温度为60℃，破壁率≥95％，步骤一中的脂肪酶用量占破壁藻浆质量的5％-10％，酶解温度为35℃-45℃，酶解时间为18-24h，酶解pH值为6.0-8.0，步骤一中将1-15重量份的雨生红球藻藻油、1-5重量份的藻渣、1-10重量份的叶黄素酯、5-15重量份的维生素C以及20-40重量份的植物油混合，粉碎混匀后，过180目筛，得到内容物料，从扩增培养物分离藻细胞，转接至缺氮的BG11培养基中培养3-5天，加入生物诱导剂进行诱导培养24-48h，得到诱导培养物，诱导剂为燕麦的枯草芽孢杆菌发酵产物，使用雨生红球藻制备内容物料，将收集的雨生红球藻鲜藻进行静置沉降，去除上清液后进行均质破壁，得到破壁藻浆，在破壁藻浆中加入脂肪酶进行酶解，得到酶解破壁藻液，用于提取藻油，得到雨生红球藻藻油和藻渣，称取150-600g叶黄素，置于高压反应釜中，加入15-25mL的乳化剂，搅拌混合均匀，随后，向反应釜中加入5-40g的反应催化剂和20-60g的相转移催化剂，于90℃-150℃下反应10-30h，得玉米黄素，步骤三中的高压湿热灭菌的条件为90-150℃，处理时间为10-30min，各称取30-80g的虎杖和决明，将其研磨成粉，加入浓度为40%-90%的乙醇溶剂100mL，对其回流提取过滤，得白藜芦醇，各称取20-60g的原儿茶酸和没食子酸，将其混合搅拌在一起，并向其中加入10-30g的柠檬酸和5-25g的α-葡庚糖酸钠，加水混匀后并水浴加热，得复合抗氧化剂，步骤四中的水浴加热温度为50-90℃，水浴时间为10-40min步骤四中的搅拌速度为150-600r/min，搅拌时间为10-50min，配制氮充足的BBM培养基，并在其中加入醋酸钠或醋酸镁，对培养基进行高压湿热灭菌，醋酸钠的加入量1-5g/L，醋酸镁的加入量为1–2.5g/L，将培养到对数生长期后期的雨生红球藻种子液接种到培养基中进行培养，使藻浓度在2.0×105-2.5×105cells/mL，每隔一天进行取样测其生物量，做培养基中雨生红球藻的生长曲线并将生物量最大时的雨生红球藻进行收集，称取0.5-2.4g卤化剂，并用1-15g氯仿溶解，缓慢加入到反应器中，反应1-15h，经三次水洗去除碱和盐后，得初液，将步骤四中的复合抗氧化剂加入到初液中，并向其中添加硅烷偶联剂，混合均匀后，经水浴加热后，过滤即得虾青素。

以上描述了本发明的主要技术特征和基本原理及相关优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性具体实施方式的细节，而且在不背离本发明的构思或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将上述具体实施方式看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照各实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。