壳寡糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及壳寡糖技术领域，尤其涉及一种壳寡糖及其制备方法。

背景技术

壳寡糖是指由2-10个2-氨基葡萄糖残基构成的低聚糖，其可增强免疫力，阻碍病原菌的生长。正是由于壳寡糖的这些特性，使得其在保健医药、农业和畜牧业上得到了广泛的应用，相关的制备技术路线得到迅速开发。目前，主要的生产方法有盐酸水解法，臭氧降解法和双氧水氧化降解法等，如专利文件201510519424.3，201310726242.4和201310019782.9等。纯化学方法制备的壳寡糖，在理化指标上也能达到壳寡糖的基本标准，但由于生产过程大量使用盐酸或双氧水，很难达到食品卫生条件。因此，现有食品领域用壳寡糖一般由酶降解工艺得到。

传统的酶降解工艺，由于酶可溶解于水，导致酶难以分离，降解完成之后难以回收，生产成本高。新型的酶降解工艺一般采用固定化酶方式，即通过外加硅烷偶联剂将酶固定在活性炭上(如200410087507.1)。这样在反应完成后，可通过过滤回收固定化酶。但这种固定化的方法较为复杂，且反应过程中容易出现偶联剂脱落而污染产物，后续分离困难并产生废水较多。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种壳寡糖的制备方法，其固载酶工艺简单，可提高酶的回收利用效率，降低生产成本。

本发明还要解决的技术问题在于，提供一种壳寡糖。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种壳寡糖的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将酶分散液与活性炭混合，在预设温度下温育预设时间，得到活性碳固载酶分散液；

(2)将壳聚糖分散于分散介质中，得到壳聚糖分散液；

(3)将所述壳聚糖分散液与所述活性炭固载酶分散液混合，反应得到壳寡糖；

其中，所述酶分散液为第一酶与果胶酶的混合物分散于分散剂而得。

作为上述技术方案的改进，所述第一酶选用几丁质酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、丝氨酸胰蛋白酶中的一种或多种；

所述活性碳固载酶分散液中酶浓度为0.1～1wt％。

作为上述技术方案的改进，所述第一酶选用几丁质酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、丝氨酸胰蛋白酶的混合物；

所述活性碳固载酶分散液中，所述几丁质酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、丝氨酸胰蛋白酶和果胶酶的重量比为1:1.2～2:1.5～2.5:1.5～2:1.2～2.0。

作为上述技术方案的改进，所述活性炭的粒径为0.5～5mm；

活性炭与酶分散液中酶的重量比为(5～10)：1。

作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，所述预设温度为20～35℃，所述预设时间为48～72h。

作为上述技术方案的改进，步骤(2)中，将壳聚糖与醋酸、水混合，得到壳聚糖分散液；

其中，水、壳聚糖和醋酸的重量比为(20～25)：(1～2)：(0.2～0.4)。

作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，反应温度为50～85℃，反应时间为5～15h；

在反应过程中，通入氧气和/或空气，鼓入氧气和/或空气的流量为1-5倍反应器容积/min。

作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，所述壳聚糖分散液与所述活性炭固载分散液的重量比为10～20：1。

作为上述技术方案的改进，步骤(3)包括：

(3.1)将所述壳聚糖分散液与所述活性炭固载酶分散液混合，得到混合反应液；

(3.2)将所述混合反应液在50～85℃下反应5～15h，然后固液分离，得到的固体为活性炭固载酶，得到的液体为壳寡糖成品。

相应的，本发明还公开了一种壳寡糖，其由上述的壳寡糖的制备方法制备而得。

实施本发明，具有如下有益效果：

1、本发明的壳寡糖的制备方法，采用果胶酶与其他酶的混合物作为复合酶，这种复合酶在20～35℃即可与活性炭结合，完成复合酶的固载；而无需加入额外的交联剂等其他物质，大幅简化了酶固载工艺。采用本发明制备的活性碳固载酶，其酶活回收率高，且连接作用强，在使用多次之后仍然具有较高的酶活保留率。

2、本发明的壳寡糖的制备方法，在酶降解的过程中鼓入氧气/空气，其可使得壳聚糖分散液的粘度快速地、大幅度地下降，从而降低了壳聚糖分散液中水的使用，减少了废水量。同时，也使得降解更加均匀，本发明的制备方法制备得到的壳寡糖的分子量分布集中。

3、本发明通过特定的固载工艺耦合鼓气降解反应，大幅度提升了降解率。本发明中壳聚糖降解彻底，转化率达到99％以上。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。

本发明提供了一种壳寡糖的制备方法，其包括以下步骤：

S1：将酶分散液与活性炭混合，在预设温度下温育预设时间，得到活性碳固载酶分散液；

其中，酶分散液为第一酶与果胶酶的混合物分散于分散剂而得。具体的，申请人在研究过程中意外的发现，当引入果胶酶之后，无需加入其他交联物质，即可通过果胶酶与其他酶相互之间的交联实现酶的固载。

具体的，第一酶可选用几丁质酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、丝氨酸胰蛋白酶中的一种或多种，但不限于此。优选的，第一酶选用几丁质酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、丝氨酸胰蛋白酶的混合物，这几种酶与果胶酶的混合物可有效提升固载量，提升酶活回收率以及固载酶的操作稳定性(即使用多次后固载量较多及酶活保留率较高)。具体的，几丁质酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、丝氨酸胰蛋白酶和果胶酶的重量比为1:1.2～2:1.5～2.5:1.5～2:1.2～2.0。

具体的，分散剂为水，其可溶解第一酶与果胶酶。活性碳固载酶分散液中酶浓度为0.1～1wt％，示例性的为0.2wt％、0.3wt％、0.5wt％、0.7wt％或0.8wt％，但不限于此。

其中，活性炭的粒径为0.5～5mm，若其粒径＜0.5mm，则其空隙笼过小，酶不容易进入空隙笼中。若其粒径＞5mm，其空隙笼过大，固载酶后期容易流失或冲散。

活性炭与酶分散液中酶的重量比为5～10:1。示例性的为5:1、6:1、7:1、8:1或9:1，但不限于此。

其中，温育的温度为20～35℃，但不限于此。温育的时间为48～72h，但不限于此。

S2：将壳聚糖分散于分散介质中，得到壳聚糖分散液；

其中，分散介质为弱酸溶液，示例性的为稀盐酸、甲酸、醋酸、乳酸等，但不限于此。优选的，在本发明的一个实施例中，将壳聚糖、水、醋酸混合，得到壳聚糖分散液，其中，水、壳聚糖和醋酸的重量比为(20～25)：(1～2)：(0.2～0.4)。混合后，得到壳聚糖分散液为溶胶状。由于本发明采用特定的活性炭固载酶耦合后期鼓泡工艺，有效降低了水的用量。

需要说明的是，步骤S1、S2部分先后。在实际实施过程中，可先实施S1、后实施S2；也可先实施S2，再实施S1；也可同时实施S1、S2。

S3：将所述壳聚糖分散液与所述活性炭固载酶分散液混合，反应得到壳寡糖；

具体的，S3包括：

S31：将所述壳聚糖分散液与所述活性炭固载酶分散液混合，得到混合反应液；

具体的，壳聚糖分散液与活性炭固载酶分散液的重量比为10～20：1。

S32：将所述混合反应液在50～85℃下反应5～15h，然后固液分离，得到的固体为活性炭固载酶，得到的液体为壳寡糖成品。

其中，在反应过程中，鼓入氧气和/或空气，鼓入流量为1-5倍反应器容积/min。通过鼓气，可快速地、大幅度地降低溶胶状壳聚糖分散液的粘度，从而提升酶降解的均匀性，使得本发明制备得到的壳寡糖的分子量更加集中。

其中，反应温度为50～85℃，示例性的为55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃，但不限于此。反应时间为5～15h，示例性的为5.5h、6.5h、7.5h、8.5h、9h、10h、12h或14h，但不限于此。通过控制反应时间，可得到分子量不同的壳寡糖。

在反应结束后，固液分离，得到固体为活性炭固载酶，可循环利用；得到的液体为壳寡糖成品，其含水量较低，通过简单的固液分离即可得到固相产品。

下面以具体实施例对本发明进行说明。

实施例1

本实施例提供一种壳寡糖的制备方法，其包括：

(1)将1g几丁质酶、2g果胶酶与2997g水混合，得到酶分散液；加入30g粒径为0.5～1mm的活性炭，在70℃下温育24h；得到活性炭固载酶分散液；

(2)将4kg壳聚糖溶解40L的1％的甲酸溶液中，得到壳聚糖分散液；

(3)将步骤(1)得到的活性炭固载酶分散液和步骤(2)得到的壳聚糖分散液混合，在85℃反应5h，反应结束后固液分离，得到固体为活性炭固载酶，液体为壳寡糖成品。

实施例2

本实施例提供一种壳寡糖的制备方法，其包括：

(1)将1g几丁质酶、2.5g纤维素酶、1g木瓜蛋白酶、1g丝氨酸胰蛋白酶和2.5g果胶酶与2992g水混合，得到酶分散液；加入40g粒径为4.5～5mm的活性炭，在30℃下温育72h；得到活性炭固载酶分散液；

(2)将4kg壳聚糖溶解50L的1.2wt％的醋酸溶液中，得到壳聚糖分散液；

(3)将步骤(1)得到的活性炭固载酶分散液和步骤(2)得到的壳聚糖分散液混合，在85℃反应5h，反应过程中，在底部鼓入流量为75L/min的氧气，反应结束后固液分离，得到固体为活性炭固载酶，液体为壳寡糖成品。

实施例3

本实施例提供一种壳寡糖的制备方法，其包括：

(1)将1g几丁质酶、1.5g纤维素酶、2g木瓜蛋白酶、2g丝氨酸胰蛋白酶和1.5g果胶酶与2992g水混合，得到酶分散液；加入60g粒径为4.5～5mm的活性炭，在25℃下温育60h；得到活性炭固载酶分散液；

(2)将3kg壳聚糖溶解60L的1.2wt％的醋酸溶液中，得到壳聚糖分散液；

(3)将步骤(1)得到的活性炭固载酶分散液和步骤(2)得到的壳聚糖分散液混合，在65℃反应10h，反应过程中，在底部鼓入流量为200L/min的氧气，反应结束后固液分离，得到固体为活性炭固载酶，液体为壳寡糖成品。

实施例4

本实施例提供一种壳寡糖的制备方法，其包括：

(1)将1g几丁质酶、1.8g纤维素酶、1.6g木瓜蛋白酶、1.8g丝氨酸胰蛋白酶和1.8g果胶酶与2992g水混合，得到酶分散液；加入60g粒径为3～4mm的活性炭，在25℃下温育50h；得到活性炭固载酶分散液；

(2)将3kg壳聚糖溶解60L的1.2wt％的醋酸溶液中，得到壳聚糖分散液；

(3)将步骤(1)得到的活性炭固载酶分散液和步骤(2)得到的壳聚糖分散液混合，在65℃反应10h，反应过程中，在底部鼓入流量为300L/min的氧气，反应结束后固液分离，得到固体为活性炭固载酶，液体为壳寡糖成品。

对比例1

本对比例提供一种壳寡糖的制备方法，其包括：

(1)将1g几丁质酶、2g纤维素酶、3g木瓜蛋白酶、2g丝氨酸胰蛋白酶与2992g水混合，得到酶分散液；加入60g粒径为3～4mm的活性炭，在25℃下温育50h；得到活性炭固载酶分散液；

(2)将3kg壳聚糖溶解60L的1.2wt％的醋酸溶液中，得到壳聚糖分散液；

(3)将步骤(1)得到的活性炭固载酶分散液和步骤(2)得到的壳聚糖分散液混合，在65℃反应10h，反应过程中，在底部鼓入流量为2L/min的氧气，反应结束后固液分离，得到固体为活性炭固载酶，液体为壳寡糖成品。

对实施例1～4、对比例1进行测试，具体的包括：

(一)将实施例1～4、对比例1中步骤(1)得到活性炭固载酶分散液固液分离得到活性炭固载酶，并对该活性炭固载酶进行测试，具体方法如下：

(1)测定固载量：采用紫外可见光光度计(UV2450，日本岛津公司)分别测定595nm处酶分散液的吸光度，测定步骤(1)活性炭固载酶分散液固液分离后所得液体的吸光度(595nm)；计算得到其中酶的浓度，并按照下式计算固载量：

ε＝(c

其中，ε为固载量(g/kg)，c

(2)测定酶活性：以葡萄糖为底物，采用滴定法测定酶活性。分别测定酶分散液的酶活性和活性炭固载酶的酶活性；并按照下式计算酶活回收率：

酶活回收率＝活性炭固载酶的总活力/酶分散液的酶总活力。

(二)将实施例1～4、对比例1中步骤(3)得到的活性碳固载酶配置成与各实施例、对比例步骤(1)中浓度相同的活性炭固载酶分散液；然后循环反应30次。取得到的活性炭固载酶测定酶活性，并按下式计算活性损失率：

活性损失率＝(反应前活性炭固载酶总活力-循环反应后活性炭固载酶总活力)/反应前活性炭固载酶总活力。

(三)测定各实施例、对比例的转化率和凝胶渗透色谱测定数均分子量。

具体数据如下：

以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。