一种便捷的肿瘤微环境外泌体提取试剂盒及其提取方法

技术领域

本发明属于分泌体提取技术领域，具体涉及一种便捷的肿瘤微环境外泌体提取试剂盒及其提取方法。

背景技术

外泌体是一类直径40～180nm由细胞释放的、具有脂质双分子层和丰富内容物的纳米囊泡，广泛存在于多种细胞及体液中。肿瘤细胞分泌的外泌体尤为旺盛，可携带肿瘤细胞特征性，参与肿瘤细胞与基质细胞之间的遗传信息交换，是细胞间传递生物信号的重要方式。研究发现肿瘤微环境的外泌体对肿瘤的发生发展、免疫应答、肿瘤耐药性等多种病理过程中发挥重要作用。

然而，由于其复杂的生物起源和纳米级的微小尺寸，外泌体的分离及提纯的方法受到限制，因此阻碍了相关研究的进一步发展以及相关的临床转化应用。常规的超速离心法耗时长，步骤繁琐，每次提取需要约4小时的时间，且对仪器设备要求高，需要用到100000g的超速离心机。目前，市面上尚缺乏专门用于肿瘤微环境外泌体提取的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种便捷的肿瘤微环境外泌体提取试剂盒及其提取方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种便捷的肿瘤微环境外泌体提取试剂盒，由试剂A，试剂B，试剂C，70μm细胞滤网、0.22μm滤头及1.5ml离心管组成。

一种便捷的肿瘤微环境外泌体提取试剂盒的提取方法，包括如下步骤：

(1)将获得的肿瘤组织剪成碎片，加入试剂A，并且在37度条件下孵育20分钟；

(2)将肿瘤组织消化成肿瘤细胞悬液，加入试剂B，终止消化反应；

(3)经70μm细胞滤网去除残余的结缔组织碎片，500g离心三分钟，获得上清悬液；

(4)将获得的上清悬液通过0.22μm滤头过滤，去除细胞碎片，大囊泡等杂质；

(5)最后加入试剂C，4度孵育30分钟，1500g离心，去上清，所获得的的沉淀即为肿瘤微环境来源的外泌体。

本发明相比现有技术具有以下优点：

1、本发明开发出一种便捷的，用于肿瘤微环境的外泌体提取方法。可在2小时内完成外泌体的提取，并且获得纯度较高的外泌体。

2、本发明通过对提取的肿瘤微环境外泌体进行表征鉴定，证明了该试剂盒可以获得纯度较高的外泌体。

附图说明

图1为纳米颗粒跟踪分析；

图2为透射电镜图；

图3为蛋白印迹电泳图。

具体实施方式

为了对本发明做更进一步的解释，下面结合下述具体实施例进行阐述。

实施例1

一种便捷的肿瘤微环境外泌体提取试剂盒，由试剂A，试剂B，试剂C，70μm细胞滤网、0.22μm滤头及1.5ml离心管组成。

一种便捷的肿瘤微环境外泌体提取试剂盒的提取方法，包括如下步骤：

(1)将获得的肿瘤组织剪成碎片，加入试剂A，并且在37度条件下孵育20分钟；

(2)将肿瘤组织消化成肿瘤细胞悬液，加入试剂B，终止消化反应；

(3)经70μm细胞滤网去除残余的结缔组织碎片，500g离心三分钟，获得上清悬液；

(4)将获得的上清悬液通过0.22μm滤头过滤，去除细胞碎片，大囊泡等杂质；

(5)最后加入试剂C，4度孵育30分钟，1500g离心，去上清，所获得的的沉淀即为肿瘤微环境来源的外泌体。

纳米颗粒跟踪分析技术显示提纯的外泌体直径主要分布在40-180nm直径，具有典型的外泌体大小特征。

透射电镜显示，提纯的外泌体具有明显的膜，立体结构清晰，同时具有茶托样或凹半球样结构，符合外泌体经典的电镜特征。

蛋白印迹显示，提纯的外泌体表达外泌体经典标记物，如Alix、Flotillin-1、TSG101、CD9蛋白。

以上的实验结果表明，我们研发的试剂盒可以有效地从肿瘤微环境中获得高纯度的外泌体。