一种用于水环境eDNA采样实验分析方法

技术领域

本发明涉及水环境eDNA分析技术领域，具体为一种用于水环境eDNA采样实验分析方法。

背景技术

环境DNA(environmental DNA,eDNA)是指可以从环境样品(如水、土壤、空气、冰芯等)中直接提取到的DNA片段总和。eDNA技术是近年来新出现的一种生物调查方法技术，由包括eDNA获取、基因分析和结果分析3个部分组成。与传统方法相比，eDNA技术具有灵敏度高,省时省力,对调查对象无损伤等优点，而且不要求调查人员具有传统的生物识别及鉴定经验。目前eDNA技术已被应用于目标物种(如入侵物种、濒危物种及其他稀有物种)”有无”的检测,生物量的估测，在水生生态系统的保护中具有广泛的应用前景，分析eDNA的目的就是获取这些环境样品中DNA所属物种的分类学信息和基因功能信息。再讲通俗一点，科学家提取环境样品中的eDNA，就是为了分析这些DNA分别是属于哪些物种，从而证实在相应环境中存在哪些物种。eDNA的目的，与传统的动植物分类调查其实是一致的，第一类eDNA类似于对环境的生物多样性调查，方法是检测环境样品中尽可能多的DNA序列，与数据库比对分析它们所属的物种分类信息，最终鉴定在这个环境中生活的所有物种，这个方法又被称为DNA宏条形码(DNA metabarcoding)。在样品处理上，DNA宏条形码使用普通的聚合酶链式反应(PCR)或直接霰弹枪法(shotgun strategy)测序，这两个实验方法都比较成熟，能够方便获得多个DNA序列。

目前在针对水环境eDNA采样实验分析过程中，由于采样保存不规范，使采集的实验样本污染严重，从而导致实验分析结果存在加大误差，不能实现通过采用可生物降解的亲水性材料支撑的过滤膜并配合很好的标准化处理，来使采集的实验样品能够进行很好无菌保存，无法达到既快速又安全的对采集的实验样品进行保存的目的，从而给实验人员的分析工作带来极大的不便。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于水环境eDNA采样实验分析方法，解决了目前在针对水环境eDNA采样实验分析过程中，由于采样保存不规范，使采集的实验样本污染严重，从而导致实验分析结果存在加大误差，不能实现通过采用可生物降解的亲水性材料支撑的过滤膜并配合很好的标准化处理，来使采集的实验样品能够进行很好无菌保存，无法达到既快速又安全的对采集的实验样品进行保存目的的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种用于水环境eDNA采样实验分析方法，具体包括以下步骤：

S1、选取一种与任何吸入泵兼容的eDNA过滤器；

S2、标准化处理：从采样地收集90-100L的水样品，使用步骤S1中的eDNA采样器对采样的水进行过滤，过滤器单独包装并预装有过滤膜，对所有样品的eDNA采样器上的过滤参数进行标准化，标准化处理完成后进行保存；

S3、环境DNA提取：将步骤S2标准化处理后实验样品转移至DNA提取设备中，加入溶解酶，混合反应2-3h，并通过离心机构进行离心分离处理，得到实验所需靶向DNA；

S4、PCR扩增均一化处理：根据步骤S3得到的靶向DNA序列通过基因工程设计合成引物接头，再将设计好的引物接头通过PCR扩增设备进行PCR扩增处理，然后对PCR扩增产物纯化，之后再对纯化后的PCR产物进行定量均一化处理：

S5、测序处理：对步骤S4定量均一化处理后的PCR产物进行DNA序列测序，并构建DNA序列文库，然后生成DNA序列文库报告。

优选的，所述步骤S2中eDNA过滤器的过滤膜是由可生物降解的亲水性材料组成，其能通过干燥自动保存捕获的eDNA，没有过滤膜转移步骤，不需要化学或冷藏。

优选的，所述步骤S4在进行PCR扩增过程中所有的样本都需要用OneStepTMPCR抑制剂去除试剂盒进行处理，消除样品中的PCR扩增抑制作用。

优选的，所述过滤膜是由聚醚砜、聚乳酸、聚羟基丁酸酯、聚乙烯醇、聚己内酯或聚丁二酸丁二醇酯中的一种或多种组成。

优选的，所述步骤S2中过滤膜的厚度为1-1.2μm，且直径为45-50mm。

优选的，所述步骤S2中在0.5-1.5L/min流速、8-12psi的压力阈值和0.3-0.7L的目标体积下，对所有样品的eDNA采样器上的过滤参数进行标准化。

优选的，所述步骤S3中溶解酶包括DNA解螺旋酶、DNA旋转酶、DNA引物酶和DNA合成酶。

(三)有益效果

本发明提供了一种用于水环境eDNA采样实验分析方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该用于水环境eDNA采样实验分析方法，具体包括以下步骤：S1、选取一种与任何吸入泵兼容的eDNA过滤器；S2、标准化处理：从采样地收集90-100L的水样品，使用步骤S1中的eDNA采样器对采样的水进行过滤，过滤器单独包装并预装有过滤膜，对所有样品的eDNA采样器上的过滤参数进行标准化，标准化处理完成后进行保存；S3、环境DNA提取：将步骤S2标准化处理后实验样品转移至DNA提取设备中，加入溶解酶，混合反应2-3h，并通过离心机构进行离心分离处理，得到实验所需靶向DNA；S4、PCR扩增均一化处理：根据步骤S3得到的靶向DNA序列通过基因工程设计合成引物接头，再将设计好的引物接头通过PCR扩增设备进行PCR扩增处理，然后对PCR扩增产物纯化，之后再对纯化后的PCR产物进行定量均一化处理：S5、测序处理：对步骤S4定量均一化处理后的PCR产物进行DNA序列测序，并构建DNA序列文库，然后生成DNA序列文库报告，可实现通过采用可生物降解的亲水性材料支撑的过滤膜并配合很好的标准化处理，来使采集的实验样品能够进行很好无菌保存，很好的达到了既快速又安全的对采集的实验样品进行保存的目的，避免了水环境eDNA采样实验分析过程中，由于采样保存不规范，使采集的实验样本污染严重的情况发生，确保了实验分析结果更加准确，从而大大方便了实验人员的分析工作。

附图说明

图1为本发明的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明实施例提供四种技术方案：一种用于水环境eDNA采样实验分析方法，具体包括以下实施例：

实施例1

一种用于水环境eDNA采样实验分析方法，具体包括以下步骤：

S1、选取一种与任何吸入泵兼容的eDNA过滤器；

S2、标准化处理：从采样地收集95L的水样品，使用步骤S1中的eDNA采样器对采样的水进行过滤，过滤器单独包装并预装有过滤膜，对所有样品的eDNA采样器上的过滤参数进行标准化，标准化处理完成后进行保存，eDNA过滤器的过滤膜是由可生物降解的亲水性材料组成，其能通过干燥自动保存捕获的eDNA，没有过滤膜转移步骤，不需要化学或冷藏，过滤膜是由聚醚砜和聚乳酸组成，过滤膜的厚度为1.1μm，且直径为47mm，在1L/min流速、10psi的压力阈值和0.5L的目标体积下，对所有样品的eDNA采样器上的过滤参数进行标准化；

S3、环境DNA提取：将步骤S2标准化处理后实验样品转移至DNA提取设备中，加入溶解酶，混合反应2.5h，并通过离心机构进行离心分离处理，得到实验所需靶向DNA，溶解酶包括DNA解螺旋酶、DNA旋转酶、DNA引物酶和DNA合成酶；

S4、PCR扩增均一化处理：根据步骤S3得到的靶向DNA序列通过基因工程设计合成引物接头，再将设计好的引物接头通过PCR扩增设备进行PCR扩增处理，然后对PCR扩增产物纯化，之后再对纯化后的PCR产物进行定量均一化处理，在进行PCR扩增过程中所有的样本都需要用OneStepTMPCR抑制剂去除试剂盒进行处理，消除样品中的PCR扩增抑制作用：

S5、测序处理：对步骤S4定量均一化处理后的PCR产物进行DNA序列测序，并构建DNA序列文库，然后生成DNA序列文库报告。

实施例2

一种用于水环境eDNA采样实验分析方法，具体包括以下步骤：

S1、选取一种与任何吸入泵兼容的eDNA过滤器；

S2、标准化处理：从采样地收集90L的水样品，使用步骤S1中的eDNA采样器对采样的水进行过滤，过滤器单独包装并预装有过滤膜，对所有样品的eDNA采样器上的过滤参数进行标准化，标准化处理完成后进行保存，eDNA过滤器的过滤膜是由可生物降解的亲水性材料组成，其能通过干燥自动保存捕获的eDNA，没有过滤膜转移步骤，不需要化学或冷藏，过滤膜是由聚羟基丁酸酯和聚乙烯醇组成，过滤膜的厚度为1μm，且直径为45mm，在0.5L/min流速、8psi的压力阈值和0.3L的目标体积下，对所有样品的eDNA采样器上的过滤参数进行标准化；

S3、环境DNA提取：将步骤S2标准化处理后实验样品转移至DNA提取设备中，加入溶解酶，混合反应2h，并通过离心机构进行离心分离处理，得到实验所需靶向DNA，溶解酶包括DNA解螺旋酶、DNA旋转酶、DNA引物酶和DNA合成酶；

S4、PCR扩增均一化处理：根据步骤S3得到的靶向DNA序列通过基因工程设计合成引物接头，再将设计好的引物接头通过PCR扩增设备进行PCR扩增处理，然后对PCR扩增产物纯化，之后再对纯化后的PCR产物进行定量均一化处理，在进行PCR扩增过程中所有的样本都需要用OneStepTMPCR抑制剂去除试剂盒进行处理，消除样品中的PCR扩增抑制作用：

S5、测序处理：对步骤S4定量均一化处理后的PCR产物进行DNA序列测序，并构建DNA序列文库，然后生成DNA序列文库报告。

实施例3

一种用于水环境eDNA采样实验分析方法，具体包括以下步骤：

S1、选取一种与任何吸入泵兼容的eDNA过滤器；

S2、标准化处理：从采样地收集100L的水样品，使用步骤S1中的eDNA采样器对采样的水进行过滤，过滤器单独包装并预装有过滤膜，对所有样品的eDNA采样器上的过滤参数进行标准化，标准化处理完成后进行保存，eDNA过滤器的过滤膜是由可生物降解的亲水性材料组成，其能通过干燥自动保存捕获的eDNA，没有过滤膜转移步骤，不需要化学或冷藏，过滤膜是由聚己内酯和聚丁二酸丁二醇酯组成，过滤膜的厚度为1.2μm，且直径为50mm，在1.5L/min流速、12psi的压力阈值和0.7L的目标体积下，对所有样品的eDNA采样器上的过滤参数进行标准化；

S3、环境DNA提取：将步骤S2标准化处理后实验样品转移至DNA提取设备中，加入溶解酶，混合反应3h，并通过离心机构进行离心分离处理，得到实验所需靶向DNA，溶解酶包括DNA解螺旋酶、DNA旋转酶、DNA引物酶和DNA合成酶；

S4、PCR扩增均一化处理：根据步骤S3得到的靶向DNA序列通过基因工程设计合成引物接头，再将设计好的引物接头通过PCR扩增设备进行PCR扩增处理，然后对PCR扩增产物纯化，之后再对纯化后的PCR产物进行定量均一化处理，在进行PCR扩增过程中所有的样本都需要用OneStepTMPCR抑制剂去除试剂盒进行处理，消除样品中的PCR扩增抑制作用：

S5、测序处理：对步骤S4定量均一化处理后的PCR产物进行DNA序列测序，并构建DNA序列文库，然后生成DNA序列文库报告。

实施例4

一种用于水环境eDNA采样实验分析方法，具体包括以下步骤：

S1、选取一种与任何吸入泵兼容的eDNA过滤器；

S2、标准化处理：从采样地收集97L的水样品，使用步骤S1中的eDNA采样器对采样的水进行过滤，过滤器单独包装并预装有过滤膜，对所有样品的eDNA采样器上的过滤参数进行标准化，标准化处理完成后进行保存，eDNA过滤器的过滤膜是由可生物降解的亲水性材料组成，其能通过干燥自动保存捕获的eDNA，没有过滤膜转移步骤，不需要化学或冷藏，过滤膜是由聚醚砜，过滤膜的厚度为1.15μm，且直径为48mm，在1.25L/min流速、11psi的压力阈值和0.6L的目标体积下，对所有样品的eDNA采样器上的过滤参数进行标准化；

S3、环境DNA提取：将步骤S2标准化处理后实验样品转移至DNA提取设备中，加入溶解酶，混合反应2.7h，并通过离心机构进行离心分离处理，得到实验所需靶向DNA，溶解酶包括DNA解螺旋酶、DNA旋转酶、DNA引物酶和DNA合成酶；

S4、PCR扩增均一化处理：根据步骤S3得到的靶向DNA序列通过基因工程设计合成引物接头，再将设计好的引物接头通过PCR扩增设备进行PCR扩增处理，然后对PCR扩增产物纯化，之后再对纯化后的PCR产物进行定量均一化处理，在进行PCR扩增过程中所有的样本都需要用OneStepTMPCR抑制剂去除试剂盒进行处理，消除样品中的PCR扩增抑制作用：

S5、测序处理：对步骤S4定量均一化处理后的PCR产物进行DNA序列测序，并构建DNA序列文库，然后生成DNA序列文库报告。

综上，本发明可实现通过采用可生物降解的亲水性材料支撑的过滤膜并配合很好的标准化处理，来使采集的实验样品能够进行很好无菌保存，很好的达到了既快速又安全的对采集的实验样品进行保存的目的，避免了水环境eDNA采样实验分析过程中，由于采样保存不规范，使采集的实验样本污染严重的情况发生，确保了实验分析结果更加准确，从而大大方便了实验人员的分析工作。

同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。