一种细胞培养基添加剂及培养基

技术领域

本发明涉及细胞生物学和组织工程技术领域，具体涉及一种细胞培养基添加剂及培养基。

背景技术

目前，对于中、重度瓣膜疾病，瓣膜置换或修复将是最佳治疗方案。据不完全统计，我国每年对人工心脏瓣膜的需求量达到6-8万枚以上。自1960年Harken等首次将人工心脏瓣膜应用于临床以来，人工心脏瓣膜经历了机械瓣、生物瓣、经导管植入瓣和组织工程瓣等几个发展阶段。近些年来，随着结构性心脏病治疗领域的崛起、介入瓣膜的广泛使用，生物瓣膜的应用也愈加广泛。同时，人工心脏瓣膜的结构、材料、运行机制以及植入方式朝着多样化发展，新的发展方向是针对不同植入位置、不同疾病，甚至是个体患者，设计不同的瓣膜，从而满足临床需求。

目前应用于临床的人工瓣膜按其材料的不同主要分为生物瓣膜和机械瓣膜。机械瓣膜的主体用非生物材料制成，如钛合金、不锈钢、低温热解碳、高分子材料等。生物瓣膜的主体用生物材料制成，又可分为同种瓣膜(如人的主动脉瓣、硬脑膜瓣)和异种瓣膜(如牛心包、主动脉瓣等)。机械瓣膜的耐用性优于生物瓣膜，但更容易形成血栓，且需要终生使用抗凝剂。生物瓣膜移植后不需要接受长时间的抗凝治疗，且其中的异种瓣膜来源于动物，供体充足，能为临床提供各种不同尺寸的瓣膜。

种子细胞的选择和支架的构建在组织工程瓣膜中尤为重要。在构建组织工程瓣膜中，原代真皮成纤维种子细胞的增殖效率偏低，会影响后期成功构建瓣膜的时间周期以及瓣膜功能。另一方面，组织工程瓣膜需要种子细胞能分泌大量的胶原蛋白作为瓣膜支架填充物，提高瓣膜的机械强度和弹性。因此提高人原代成纤维细胞体外扩增效率，且保持细胞具有良好的形态和功能的方法是急需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞培养基添加剂及培养基，以解决上述背景技术中提出的现有的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种细胞培养基添加剂，包括以下组分：人血清白蛋白、EGF、FGF-10、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、阿魏酰聚糖、纳米氧化锌和甲壳素。

优选的，包括以下组分：15-35mg/ml人血清白蛋白、2.5-5.5ng/mL EGF、 8-12ng/mLFGF-10、0.2-1.1μg/mL氢化可的松、3-8μg/mL胰岛素、4-6μg/mL 转铁蛋白、1-3ng/mL阿魏酰聚糖、0.2-0.4ng/mL纳米氧化锌和0.1-0.6μg/mL 甲壳素。

优选的，包括以下组分：25mg/ml人血清白蛋白、4ng/mL EGF、 10ng/mLFGF-10、0.6μg/mL氢化可的松、5μg/mL胰岛素、5μg/mL转铁蛋白、 2ng/mL阿魏酰聚糖、0.34ng/mL纳米氧化锌和0.3μg/mL甲壳素。

本发明的另一个目的是公开一种细胞培养基，所述细胞培养基包括：基础培养基；以及上述的细胞培养基添加剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本申请通过优化细胞培养基添加剂的配方，以达到促进人原代成纤维细胞体外扩增效率，且使细胞具有良好的形态和功能；同时，添加剂中的阿魏酰聚糖和纳米氧化锌可以提高人原代成纤维细胞的增殖活性，避免细胞凋亡，进而提高增殖效率。

附图说明

图1为本发明的原代皮肤成纤维细胞在常规培养基和迈克瑞自研培养基培养后的活力测试对照图；

图2为本发明的原代皮肤成纤维细胞在常规培养基和迈克瑞自研培养基中的Ⅰ型胶原蛋白含量测试对照图；

图3为本发明的原代皮肤成纤维细胞在常规培养基和迈克瑞自研培养基培养后的Ⅲ型胶原蛋白含量测试对照图；

图4为本发明的原代皮肤成纤维细胞在常规培养基培养后的荧光染色实验图；

图5为本发明的原代皮肤成纤维细胞在迈克瑞自研培养基培养后的荧光染色实验图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

参照图1到图5来对本申请进行具体阐述。

实施例1

本发明公开了一种细胞培养基添加剂，包括以下组分：15mg/ml人血清白蛋白、2.5ng/mL EGF、8ng/mLFGF-10、0.2μg/mL氢化可的松、3μg/mL胰岛素、4μg/mL转铁蛋白、1ng/mL阿魏酰聚糖、0.2ng/mL纳米氧化锌和0.1μg/mL 甲壳素。

一种细胞培养基，所述细胞培养基包括：基础培养基；以及上述的细胞培养基添加剂。

实施例2

本发明公开了一种细胞培养基添加剂，包括以下组分：35mg/ml人血清白蛋白、5.5ng/mL EGF、12ng/mLFGF-10、1.1μg/mL氢化可的松、8μg/mL胰岛素、6μg/mL转铁蛋白、3ng/mL阿魏酰聚糖、0.4ng/mL纳米氧化锌和0.6μg/mL 甲壳素。

一种细胞培养基，所述细胞培养基包括：基础培养基；以及上述的细胞培养基添加剂。

实施例3

本发明公开了一种细胞培养基添加剂，包括以下组分：25mg/ml人血清白蛋白、4ng/mL EGF、10ng/mLFGF-10、0.6μg/mL氢化可的松、5μg/mL胰岛素、 5μg/mL转铁蛋白、2ng/mL阿魏酰聚糖、0.34ng/mL纳米氧化锌和0.3μg/mL甲壳素。

一种细胞培养基，所述细胞培养基包括：基础培养基；以及上述的细胞培养基添加剂。

人原代真皮成纤维细胞体外功能增强实验

(1)人原代真皮成纤维细胞活性测试

人原代真皮成纤维细胞在5％CO

相对细胞活性(％)＝(样品组OD值/对照组OD值)x100％

具体的原代皮肤成纤维细胞在常规培养基和迈克瑞自研培养基培养后的活力测试对照图如图1所示。

(2)人原代真皮成纤维细胞的胶原蛋白生成量测试

当体外培养的成纤维细胞生长至80-90％汇合时，用胰酶将其消化并接种于96孔板，细胞在96孔板中贴附培养48h后，对成纤维细胞使用不含血清的饥饿培养基饥饿过夜，使细胞群体生长同步化，随后用常规培养基和迈可瑞自研培养基分别处理细胞48h后，取细胞培养上清液用于Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的ELISA测试，所测得样品组的胶原蛋白含量与未处理对照组进行统计比较，评估迈可瑞自研培养基对胶原蛋白生成量的影响。

具体的原代皮肤成纤维细胞在常规培养基和迈克瑞自研培养基中的Ⅰ型胶原蛋白含量测试对照图如图2所示。

具体的原代皮肤成纤维细胞在常规培养基和迈克瑞自研培养基培养后的Ⅲ型胶原蛋白含量测试对照图如图3所示。

(3)人原代真皮成纤维细胞爬片和荧光染色实验

人原代皮肤成纤维细胞使用培养基在37℃，含5％CO

具体的原代皮肤成纤维细胞在常规培养基培养后的荧光染色实验图如图 4所示。

具体的原代皮肤成纤维细胞在迈克瑞自研培养基培养后的荧光染色实验图如图5所示。

本申请通过优化细胞培养基添加剂的配方，以达到促进人原代成纤维细胞体外扩增效率，且使细胞具有良好的形态和功能；同时，添加剂中的阿魏酰聚糖和纳米氧化锌可以提高人原代成纤维细胞的增殖活性，避免细胞凋亡，进而提高增殖效率。

本发明使用到的标准零件均可以从市场上购买，异形件根据说明书的和附图的记载均可以进行订制，各个零件的具体连接方式均采用现有技术中成熟的螺栓、铆钉、焊接等常规手段，机械、零件和设备均采用现有技术中，常规的型号，加上电路连接采用现有技术中常规的连接方式，在此不再详述，本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。