苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物及其合成和应用

技术领域

本发明属药物化学领域，涉及苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物及其合成和应用。

背景技术

肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，其需要多种生长因子的参与进而侵袭正常组织细胞并扩张。研究发现肿瘤组织会上调其如Akt、MAP2K、VEGF、EPO或RAS的致癌基因来帮助其生存发展。促红细胞生成素(EPO)和血管内皮生长因子(VEGF)等在肿瘤血管生成过程中起着关键作用(Cancer Cell.2017,32(5),669-683.e5.)，肿瘤组织的血管增生进而可帮助肿瘤的发生发展。Douglas Hanahan最近在2022年总结了癌症的新标志，其中肿瘤微环境可以导致广泛的表观遗传变化(Canc-er Discov.2022,12(1),31-46.)，而缺氧即是肿瘤微环境的一个主要特征，由于肿瘤组织缺乏血管，其可以影响和改变总体蛋白甲基化水平，调控翻译过程，从而导致细胞异常生长与肿瘤扩散(Cell.2020,181(6),1329-1345e24.)。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)作为一种转录因子，是细胞适应和感受氧环境的关键因子，其通过与缺氧反应元件HRE(hypoxic response element)结合调控VEGF等下游基因，其中VEGF的上调可促进肿瘤血管增殖进而促进肿瘤发生进展。

缺氧诱导因子是一种转录因子，其在肿瘤发生发展中必不可少。由于肿瘤代谢高度活跃，氧气被异常消耗，进而可导致肿瘤组织的缺氧微环境。HIF的表达对这种缺氧环境高度敏感，其在缺氧条件下可稳定表达并发挥病理功能。HIF-1是一种螺旋-环-螺旋PER-ARNT-SIM蛋白家族的成员，其有两个亚基即氧敏感的α亚基和组成性表达的β亚基形成异源二聚体发挥生物学活性。缺氧条件下，由于氧气底物浓度低，HIF-1α不能被脯氨酰羟化酶(PHD)羟基化，而当HIF-1α被羟基化修饰后即被von Hippel-Lindau蛋白识别，进而进入泛素-蛋白酶体系统降解。(Cancer Cell.2017,32(5),669-683.e5.)因此缺氧下的HIF-1α稳定表达，进而进入细胞核内与β亚基形成异源二聚体作为一种高效的转录因子和DNA锚定，从而招募一系列辅助因子，上调下游基因如VEGF和EPO的表达，介导肿瘤的进展。一些研究人员还发现，HIF-1升高会导致治疗耐药性，以及恶性肿瘤不良预后有关(J Cancer ResClin Oncol.2020,146(1),1-18.Acta Pharm Sin B.2015,5(5),378-89.)。因此，针对HIF-1的治疗策略已成为化疗或放疗耐药患者潜在的癌症治疗和辅助治疗手段。

由于目前临床迫切需要HIF-1的转录活性抑制剂，许多HIF-1抑制剂已被开发并用于临床前抗癌药物(J Med Chem.2018,61(20),9266-9286.)。Ravi Naik实验室发现了新型(E)苯氧丙烯酰胺衍生物，其最佳IC

此外，最近的研究表明，在常氧状态下诱导HIF可能会在具有慢性炎症的疾病环境中产生严重后果。虽然目前HIF和炎症的关系尚未有明确的定论，但可以知道的是HIF-1的失调在慢性炎症、风湿性关节炎和肿瘤炎症中都参与了病理过程。因此，开发HIF-1α的抑制剂可为科学家认识炎症提供有力的工具，为炎症的治疗亦可提供潜在的药物。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供新的苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物及其药物用途。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物，该类化合物能有效抑制HIF-1α转录活性，可用于治疗或预防与HIF-1α表达异常引起的如肿瘤和炎症等疾病。

本发明的第二个目的在于，提供苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物的合成方法。

本发明的第三个目的在于，提供苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物，所述化合物拥有如式(Ⅰ)所示的结构，R1选自C3-11烷基、C5-7的饱和环烷基、苯基、吡啶基、萘基、噻吩基、苯并噻吩基、联苯基以及含有取代基的上述基团；

其中所述取代基独立地选自1个或多个卤素基、C1-5链状烷基、卤代的C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤代的C1-3烷氧基、NO

作为一个优选方案，所述结构为式Ⅰ-1～Ⅰ-21任一所示，

本发明提供了苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备2-硝基苯乙酸乙酯:：以无水乙醇和2-硝基苯乙酸在浓硫酸催化下进行酯化反应，萃取干燥后，抽滤浓缩获得产物；

(2)制备2-硝基苯基肟酸乙酯：将2-硝基苯乙酸乙酯在乙醇中与亚硝酸异戊酯混合，调节pH值至中性，用乙酸乙酯萃取，洗涤抽滤得到产物；

(3)制备苯并异噁唑-3-甲酸乙酯：以二甘醇二甲醚为溶剂，将2-硝基苯基肟酸乙酯用氢化钠加热还原缩合成环得到产物，冷却加入超纯水，用乙酸乙酯萃取并用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥浓缩后，用热石油醚重结晶后得到苯并异噁唑-3-甲酸乙酯；

(4)制备苯并异噁唑-3-甲酸：使用70％硫酸对苯并异噁唑-3-甲酸乙酯进行加热水解，产物用乙酸乙酯萃取并用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥浓缩后，抽滤得到灰白色产物苯并异噁唑-3-甲酸；

(5)制备苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物：将苯并异噁唑-3-甲酸和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯混合，加入二异丙基乙胺和待反应的胺搅拌反应，反应后的溶液加入乙酸乙酯稀释，有机相各用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗产品经有柱层析分离纯化，即可得到终产物。

进一步的，本发明还公开了一种药物组合物，包括上述苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物或其药学上可接受的盐与医学上可接受的载体。所述载体包括药学领域的常规稀释剂，赋形剂，填充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体，润滑剂等，必要时还可以加入香味剂，甜味剂等。

进一步的，本发明公开了苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物或其药学上可接受的盐在制备HIF-1α转录活性抑制剂中的应用。

进一步的，本发明公开了苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和治疗癌症和炎症的药物中的应用。

苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物在制备HIF-1α抑制剂中的应用，主要步骤如下：

(1)构建双荧光素酶报告基因检测系统对HIF-1α的转录活性进行测定。在细胞内引入HIF-1α-P2A，HRE-Luc,Renilla基因表达构建的双荧光素酶报告基因检测系统，并根据海肾荧光素酶底物结合释放的生物荧光作为内标均一化实验数据。

(2)采用荧光分光光度计或酶标仪进行荧光强度测定，用标准曲线法进行HIF-1α转录活性的定量分析。

(抑制剂活性评估参考文献，Cancer Commun.2021,41(7):560-575.)。

本发明的优点在于，本发明所提供的苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物是一类结构新颖的化合物，具备结构简洁、合成简单、易于放大生产等工艺优点。苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物对HIF-1α转录活性抑制明显，并且可显著下调下游VEGF和PDK1的mRNA表达水平，具有良好的结构改造潜力和应用前景，可进一步制成治疗癌症和炎症的药物。

附图说明

图1为目前文献已报道的HIF-1小分子抑制剂结构。

图2为苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物的主要结构设计与可改造位点。

图3为苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物的合成路线。

图4为本发明实施例1中，苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物对HIF-1下游VEGF和PDK1的表达的影响作用。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

实施例1：

苯并异噁唑-3-甲酸的制备

设备与材料：

所有用于核磁共振实验的氘代试剂均购买自

所有的核磁共振实验均由仪器Varian Mercury Plus 400和Bruker AscendTM600测试，结果经MestRenova7.0处理后导出。高分辨质谱于AB5600+Q TOF上以ESI作为电离源测试。HPLC选用安捷伦1260Infinity II液相色谱系统，色谱柱选用Thermo Fisher的C18键合色谱柱(150mm×4mm×5μm)。化合物分离纯化选用

制备中间体苯并异噁唑-3-甲酸技术路线：

试剂与条件(a)乙醇，硫酸，回流2h；(b)金属钠，乙醇，盐酸；(c)氢化钠，二甘醇二甲醚,150℃，5h；(d)硫酸,85℃4h。

(一)制备2-硝基苯乙酸乙酯(Ⅰ-1-1)

将10.0g,55.20mmol,1.0eq商业可得的2-硝基苯乙酸溶于120mL无水乙醇，加入4.6g,46.92mmol,2.50mL,0.85eq浓硫酸回流2小时。反应结束后，浓缩溶液，加入250mL乙酸乙酯和100mL饱和碳酸钠进行相分离。有机相用100mL饱和碳酸钠溶液洗涤后用100mL饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到目标淡黄色固体产物2-硝基苯乙酸乙酯(80％)。无需进一步纯化直接用于下一步反应。

(二)制备2-硝基苯基肟酸乙酯(Ⅰ-1-2)

将上步得到的Ⅰ-1-1(12.6g,60.23mmol,1.0eq)和亚硝酸异戊酯(8.04g,68.66mmol,9.24mL,1.14eq)溶于乙醇(130mL)。60℃下缓慢加入乙醇钠(1.52g,66.25mmol,,1.10eq)和乙醇(63mL)混合物，保持温度继续发应2小时。冷却至20℃用盐酸调整PH值到7并用乙酸乙酯萃取3次。合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸铵干燥，浓缩，抽滤，滤饼用石油醚洗涤两次，浓缩后得到淡黄色固体(62％)。无需进一步纯化直接进行下一步反应。

(三)制备苯并异噁唑-3-甲酸乙酯(Ⅰ-1-3)

将上步得到的Ⅰ-1-2(8.0g,33.59mmol,1.0eq)溶于二甘醇二甲醚(100mL)，氩气保护下缓慢加入二甘醇二甲醚(100mL)和氢化钠混合物(2.02g,50.39mmol,purity of 60％,1.5eq)并且剧烈搅拌。缓慢加热体系至150℃并反应5小时。冷却至50℃并加入ddH2O。水相用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相用饱和食盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥，浓缩，复溶于热石油醚中，将溶液至于0℃下可见淡黄色固体析出(29％)，抽滤所得粗品无需纯化直接进行下一步。

(四)制备苯并异噁唑-3-甲酸(Ⅰ-1-4)

将上一步所得Ⅰ-1-3溶于70％硫酸(100mL)85℃下搅拌4小时，加入冰水150mL并用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相用水和饱和食盐水分别洗涤两次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，抽滤，最后得到灰白色产物Ⅰ-1-4(68％)。

经检测，结构正确，检验结果如下：

(五)制备苯并异噁唑-3-甲酰胺衍生物通式(Ⅰ-1～Ⅰ-21)

将Ⅰ-1-4(100mg,0.61mmol,1.0eq)和HATU(300mg,0.79mmol,1.3eq)溶于2mL DMF，25℃搅拌30分钟。加入DIPEA(300μL)和待反应的胺(1.1eq)25℃搅拌反应6小时。乙酸乙酯稀释。有机相各用水和饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗产品经有柱层析分离纯化，即可得到终产物式Ⅰ-1～Ⅰ-21产率50-78％。

经检测，结构正确，检验结果如下：

(1)苯并异噁唑-3-甲酰苯胺(式Ⅰ-1)

(2)苯并异噁唑-3-甲酰环己基胺(式Ⅰ-2)

(3)苯并异噁唑-3-甲酰-4-吡啶胺(式Ⅰ-3)

(4)苯并异噁唑-3-甲酰-2-吡啶胺(式Ⅰ-4)

(5)苯并异噁唑-3-甲酰-(3-硝基)苯胺(式Ⅰ-5)

(6)苯并异噁唑-3-甲酰-(3-二甲氨基)苯胺(式Ⅰ-6)

(7)苯并异噁唑-3-甲酰-(4-二甲氨基)苯胺(式Ⅰ-7)

(8)苯并异噁唑-3-甲酰-(2-甲氧基)苯胺(式Ⅰ-8)

(9)苯并异噁唑-3-甲酰-(3-甲氧基)苯胺(式Ⅰ-9)

(10)苯并异噁唑-3-甲酰-(4-甲氧基)苯胺(式Ⅰ-10)

(11)苯并异噁唑-3-甲酰-(2-氯)苯胺(式Ⅰ-11)

(12)苯并异噁唑-3-甲酰-(3-氯)苯胺(式Ⅰ-12)

(13)苯并异噁唑-3-甲酰-(4-氯)苯胺(式Ⅰ-13)

(14)苯并异噁唑-3-甲酰萘-2-胺(式Ⅰ-14)

(15)苯并异噁唑-3-甲酰-(1,1’)联苯-3-胺(式Ⅰ-15)

(16)苯并异噁唑-3-甲酰-咔唑-3-胺(式Ⅰ-16)

(17)苯并异噁唑-3-甲酰-(3-甲氧酰)苯胺(式Ⅰ-17)

(18)苯并异噁唑-3-甲酰苯并噻唑-5-胺(式Ⅰ-18)

(19)苯并异噁唑-3-甲酰-(3,4-二氢)1-萘酮-6-胺(式Ⅰ-19)

(20)苯并异噁唑-3-甲酰-(3-乙酰)苯胺(式Ⅰ-20)

(21)苯并异噁唑-3-甲酰-(4-乙酰)苯胺(式Ⅰ-21)

实施例2：苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物对HIF-1α转录活性抑制作用的测定

实验仪器与材料

双荧光酶报告基因检测系统的所有试剂购买自Promega，生物实验耗材均来自探索平台。用于细胞培养的DMEM，抗生素和胎牛血清购买自Gibco。HEK293T细胞源自Procell经传代保存使用。

(一)苯并异噁唑-3-甲酰苯胺类化合物对HIF-1α转录抑制活性的测定

细胞密度50-60％的HEK293T细胞通过瞬时转染转入HIF-1α-P2A，Luc-HRE，Renilla质粒后孵育24小时使基因充分得到表达。收集细胞铺入96孔不透光白板中，控制细胞数量每孔不超过10,000个，待细胞贴壁稳定后加入五组浓度梯度的化合物于双复孔中，以5孔DMSO组为空白对照，孵育24小时。接着开始双荧光素酶报告基因检测，试剂盒选用Promega公司试剂盒。首先将96孔板中培养基去除，用PBS小心洗一次。加入配套裂解液孵育10分钟。避光加入萤火虫荧光素酶底物利用酶标仪读出荧光发光值，此步需要尽快操作以避免荧光淬灭。后加入含有淬灭荧光虫荧光素淬灭剂的Renilla荧光素酶底物，测得作为内参的荧光发光值。与DMSO对照组比对均一化后可得化合物抑制HIF-1α水平。

(二)苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物对HIF-α转录活性的半数抑制浓度(IC5)测定

双复孔实验，使用不同浓度梯度的化合物利用双荧光素酶报告基因检测系统测定结果得到不同浓度下的抑制率后，可通过GraphPad软件计算得到相应的苯并异噁唑-3-甲酰胺类化合物对HIF-α转录活性的半数抑制浓度IC

表1.化合物式Ⅰ-1～Ⅰ-21对HIF-1α转录活性的半数抑制浓度IC

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。