一种有效防控苹果腐烂病的菌株组合及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种有效防控苹果腐烂病的菌株组合及其应用。

背景技术

苹果树腐烂病(Apple Valsa canker)是由苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali Miyabeet Yamada)侵染引起的一种严重苹果树病害。该病害在我国所有苹果种植区域均有发生，具有分布广、危害重、防治难的特性，被果农称为苹果树的“癌症”。

目前对苹果树腐烂病的防治方法中常采用化学药剂，但是大量化学药剂的使用容易产生抗药性、造成人畜中毒和环境污染。因此，寻找持效、低毒、环境友好型的防治方法成为苹果树腐烂病防治的发展趋势。生物防治具有持效性和环境友好型的优点，目前已经成为植物病害防治的热点。在苹果树腐烂病的生物防治中，已经有大量研究者开展了相关工作，但是，在田间环境中由于天气等不可控的外界因素及生物防治的不稳定性，造成大部分生防菌均处于实验室研究阶段，在苹果腐烂病的防治实践中还无法得到广泛应用。选择抗逆性强、具有不同作用机制的生防、促生菌构建复合菌剂是提高生物防治效果和稳定性的一个主要手段。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的对于苹果腐烂病缺乏有效的，且抗逆性强的生防菌株的问题，提供一种有效防控苹果腐烂病的菌株组合及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种有效防控苹果腐烂病的菌株组合，包括解淀粉芽孢杆菌LZ1-4和解淀粉芽孢杆菌PGB-8，所述解淀粉芽孢杆菌LZ1-4和解淀粉芽孢杆菌PGB-8均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.25340和CGMCC No.25339。

优选地，所述解淀粉芽孢杆菌LZ1-4的16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。

优选地，所述解淀粉芽孢杆菌PGB-8的16S rRNA基因序列如SEQ ID No.2所示。

进一步优选，所述解淀粉芽孢杆菌LZ1-4和解淀粉芽孢杆菌PGB-8的复配比例为1:1。

本发明同时提供上述菌株组合在制备苹果腐烂病的生防制剂中的应用。

本发明所具有的有益效果：

一)本发明中解淀粉芽孢杆菌LZ1-4和解淀粉芽孢杆菌PGB-8进行等比例复配，形成菌液浓度为OD600＝0.8时对苹果腐烂病的防效可达到95.76％，明显高于1000倍三唑酮药剂处理的效果，显著提高对苹果腐烂病的防治效果；

二)本发明中解淀粉芽孢杆菌LZ1-4和解淀粉芽孢杆菌PGB-8具有较强的抗逆性：均可耐受10％的NaCl；LZ1-4可在pH6～pH10的条件下生长，PGB-8的生长pH为6～9；菌株LZ1-4和PGB-8的无菌发酵液耐紫外线和高低温影响，紫外照射120min后，以及-80～120℃处理后仍对C.mali QH2表现出一定的拮抗活性；

三)本发明中的菌株组合的菌液浓度为OD600＝0.8时即可有效防控苹果腐烂病，生防菌株的使用量少，有效降低生产成本，提高苹果种植的生产效益。

附图说明

图1为本发明中菌株LZ1-4与PGB-8对C.mali QH2的皿内抑制图及菌丝形态影响；

图2为本发明中LZ1-4与PGB-8在LB培养基上的形态特性图；

图3为本发明中LZ1-4与PGB-8的16S rRNA构建进化树图

图4为本发明中LZ1-4与PGB-8的耐盐、酸、碱及其无菌发酵液耐紫外照射和高低温能力试验结果图；

图5为本发明中LZ1-4、PGB-8及菌株组合分别对苹果腐烂病在枝条上的抑制活性图。

本发明中的解淀粉芽孢杆菌LZ1-4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏日期为：2022年07月18日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.25340；分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

本发明中的解淀粉芽孢杆菌PGB-8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏日期为：2022年07月18日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.25339；分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1菌株分离、筛选及促生活性测定

1.土壤样品采集及菌株分离和筛选

苹果腐烂病菌(C.mali QH2)分离自内蒙古呼和浩特市谦和果园感染了苹果树腐烂病的‘金红’树，保藏于内蒙古农业大学园艺与植物保护学院果树病害病原生物学及综合防控研究室，保藏编号为QH2。

从内蒙古自治区巴彦淖尔市果园李子和金红苹果的根际采集土壤样品。利用逐级稀释法分离土壤中的细菌，将形态差异明显的单个菌落在LB培养基上进行纯化和培养。采用平板对峙法测定分离菌株对苹果腐烂病的拮抗活性。用直径6mm的无菌打孔器在PDA平板的两侧打孔，挑去琼脂块后，将在28℃培养2d的细菌菌饼(5mm直径)倒置放入孔中，在PDA平板中央接种28℃培养5d的苹果腐烂病菌(C.mali QH2)，28℃恒温培养。待对照菌落长满平板时，观察并记录抑菌圈直径。以抑菌率＝(1-拮抗处理病斑的半径/对照病斑半径)*100％计算抑菌率。挑取抑菌圈前沿菌丝。从分离菌株中筛选出两株对C.mali QH2表现出显著的抑制作用的菌株，分别命名为LZ1-4与PGB-8。结果如附图1和表1所示，LZ1-4与PGB-8能够显著抑制C.mali QH

表1 LZ1-4与PGB-8与C.maliQH2平板对峙结果

2.菌株鉴定

使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒对步骤1分离得到的LZ1-4与PGB-8的菌株DNA进行提取。使用通用引物27F和1492R对菌株LZ1-4与PGB-8的16S rRNA序列进行PCR扩增，通用引物27F和1492R的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。通用引物27F的序列为5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，其中“M”代表碱基“A”或者“G”。PCR扩增反应体系如下：2×M5Hipper超光速Mix 10μL，ddH

结果如图2、图3所示，菌株LZ1-4与PGB-8在LB上呈现典型的细菌菌落形态，菌落白色至透明色，利用16S rRNA序列比对LZ1-4与解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens G1111的相似性达到100％，PGB-8与解淀粉芽孢杆菌G12的相似性达到99.86％，形态学结合分子序列鉴定两株菌均为解淀粉芽孢杆菌。

3.菌株稳定性试验

以步骤1分离得到的菌株LZ1-4与PGB-8为试验菌株进行以下稳定性试验。

耐盐能力：配制含0.1％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10.0％、12.0％、15％NaCl(W/V)的LB培养液，接种上述试验菌株的种子液，180r/min、32℃培养48h，以未处理发酵液为对照，测定OD600，每处理重复3次。比较其在不同盐浓度下的生长速率，评估试验菌株的耐盐性。

耐酸碱能力：用1mol/LNaOH或HCl分别调整pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的LB培养液，每瓶接种0.5mL试验菌株的种子液，180r/min、32℃培养48h，测定OD600，每处理重复3次，评估筛选试验菌株耐酸碱能力。

菌株无菌发酵液的紫外线稳定性：将试验菌株的无菌发酵液离心后取上清液，过0.22um滤膜得到不含孢子发酵滤液，将发酵滤液放在距离功率20W紫外灯45.5cm垂直处，分别照射10、20、30、40、50、60、90和120min，以不经紫外线照射的无菌发酵液为对照，利用牛津杯法测定紫外照射对无菌发酵液活性的影响；在PDA平板中央接种C.mali QH2病菌菌饼，距培养皿边缘20mm位置处对称放置无菌牛津杯，每杯内加200μL，经过不同处理的无菌发酵液后培养基正面向上置37℃培养16-18h，观察结果。

菌株无菌发酵液的耐高低温能力：参照紫外稳定性测定结果准备试验菌株的无菌发酵液，将处理好的发酵液分别在-80、-20、0、4、室温、40、50、60、70、80、90、和100℃温度下金属浴处理20min以及121℃高压灭菌20min，冷却后至室温利用牛津杯法测定不同温度处理对试验菌株活性的影响。

结果如图4所示菌株LZ1-4和PGB-8均可耐受10％的NaCl，当NaCl浓度达到12％时生长受到抑制；LZ1-4可在pH6～pH10的条件下生长，PGB-8的生长pH为6～9；菌株LZ1-4和PGB-8的无菌发酵液耐紫外线和高低温影响，紫外照射120min后，以及-80～120℃处理后仍对C.mali QH2表现出一定的拮抗活性。以上试验结果充分说明菌株LZ1-4和PGB-8具有较强的抗逆性。

实施例2菌株组合对苹果腐烂病的活体防效

将实施例1分离筛选出的菌株LZ1-4与PGB-8分别接种于LB液体培养基中，28℃，180r/min摇床上振荡24h。无菌蒸馏水调整菌液的OD600为0.8，分别制得LZ1-4与PGB-8的菌液；将LZ1-4与PGB-8的菌液等比例混合制成菌株组合液。

分别测定LZ1-4、PGB-8及菌株组合(LZ1-4与PGB-8等比例混合菌液)的防效，以三唑酮可湿性粉剂1000倍液为药剂对照，以只接种C.mali QH2的作为阳性对照，以不接种的枝条作为阴性对照。具体测定方法如下：

将健康苹果树枝条切成10cm长，于0.1％次氯酸钠浸泡5min，酒精浸泡3min，用无菌水冲洗3次，风干后，两端用石蜡封紧。用直径6mm的钉帽烫伤树皮后用待测定菌液(LZ1-4、PGB-8或菌株组合)浸泡枝条30s，将苹果腐烂病病原菌(C.mali QH2)的菌饼(直径6mm)放置在焦痕的上方，并用湿润的无菌吸水棉和保鲜膜包住接种部位，以不接种菌饼的枝条为对照将枝条放入容器中，保持湿度放入25℃的恒温光照培养箱中保湿培养，菌株在恒温培养箱中28℃培养10d后将敷于果枝上方的菌饼去掉观察发病情况，并测量病斑长度。防治效果(％)＝[1–(处理病斑直径/对照病斑直径)]×100％。

结果如图5、表2所示，当接种菌液OD600为0.8时，LZ1-4对C.mali QH2在枝条上的抑制率为85.75％，PGB-8的抑制率为67.57％，LZ1-4与PGB-8等比例混合制成的菌株组合的防效达到95.76％，高于药剂防控效果。

表2试验菌株对苹果腐烂病的防治效果

注：*不同字母表示在P＝0.05水平差异显著

综上所述，本发明中LZ1-4与PGB-8等比例复配后制成的菌株组合，在菌液浓度为OD600＝0.8时对苹果腐烂病的防效可达到95.76％，高于药剂(三唑酮)1000倍的处理，能够有效防控苹果腐烂病，且菌株LZ1-4与PGB-8的抗逆能力强，可用于制备苹果腐烂病防治的生物制剂，在苹果生产种植实践中具有广泛的应用前景。

本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。