一种新型miRNA抑制物及其在体外缓解iMSC衰老中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、细胞生物学以及干细胞培养与应用领域，尤其涉及一种新型miRNA抑制物及其在体外缓解iMSC衰老中的应用。

背景技术

诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)是通过导入特定的转录因子使终末分化的体细胞恢复到全能性状态的一类细胞。iPSCs能够长期增殖并维持高度未分化转态，在体内可参与形成机体所有组织和器官；在体外可定向诱导分化出多种成熟细胞。病人可利用iPSCs技术用自身的体细胞制备专有的干细胞，大大降低免疫排斥反应发生的可能性。iPSCs具有供体的确切遗传背景和多能性，可用于精确的疾病建模、体外药物测试，运用iPSC/iPSC衍生干细胞建立疾病模型，将有助于进一步研究特定衰老相关疾病的致病机理和疾病发展，为筛选有效的治疗方法或手段提供良好的平台。

干细胞是再生医学的基础，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是再生医学和组织工程领域的关键治疗工具之一。iPSC在体外可通过特定诱导条件分化成MSC，即人诱导性多能干细胞衍生间充质干细胞(iPSC-MSC，iMSC)，而后通过体外培养方法扩增。然而，在体内或体外培养过程中，MSC会随着供体年龄增长和疾病状况而功能退化，并逐渐失去干性，限制其治疗应用。体外长期培养过程会诱发MSC复制性衰老，细胞形态由类似梭形趋于扁平，增殖能力降低，迁移能力下降，溶酶体密度增加，线粒体密度增加和膜电位发生改变。目前，如何有效延缓/逆转iMSCs在体外培养中的复制性衰老，仍是推进其建立疾病模型、研究疾病机理和构建筛选治疗方法平台中亟需解决的关键问题。

因此，现有技术还有待改进。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型miRNA抑制物及其在体外缓解iMSC衰老中的应用，通过在体外扩增培养iMSC体系中添加miR-311的抑制物，有效缓和iMSC衰老表型，旨在解决目前iMSCs在体外培养中的复制性衰老问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种新型miRNA抑制物，其中，所述新型miRNA抑制物为miR-311抑制物，所述miR-311抑制物的核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示。

所述的新型miRNA抑制物，其中，所述miR-311抑制物为化学合成。

一种如上任一所述的新型miRNA抑制物在体外缓解iMSC衰老中的应用，其中，所述iMSC为人诱导性多能干细胞衍生的间充质干细胞，所述应用为非诊断目的

所述的应用，其中，所述应用的方法为：在iMSC培养基中添加脂质体包裹的miR-311抑制物。

所述的应用，其中，所述miR-311抑制物的孵育浓度为100-200nM。

所述的应用，其中，所述的缓解iMSC衰老包括：减少iMSC衰老相关标志蛋白的表达，促进iMSC衰老后期的细胞增殖，改善iMSC衰老后期的线粒体膜电位状态，降低iMSC线粒体密度。

所述的应用，其中，所述衰老相关标志蛋白包括p21以及p16

有益效果：本发明提供了一种新型miRNA抑制物及其在体外缓解iMSC衰老中的应用，所述miRNA抑制物为miR-311抑制物，核苷酸序列为GAAUGACCUAACACCCCAC。本发明在体外扩增培养iMSC过程中，通过在iMSC培养基中添加脂质体包裹的miR-311抑制物，缓解iMSC复制性衰老，包括来自携带基因突变的早老症病人iMSC的衰老。所述的缓解iMSC复制性衰老是指：减少了衰老相关标志蛋白(p21和p16

附图说明

图1为本发明实施例1中iMSC衰老后期细胞衰老β-半乳糖苷酶染色结果示意图。

图2为本发明实施例2中iMSC衰老后期胞内衰老相关蛋白表达量变化结果示意图。

图3为本发明实施例3中iMSC衰老后期细胞数量增长变化结果示意图。

图4为本发明实施例4中iMSC衰老早期和后期胞内线粒体膜电位状态示意图。

图5为本发明实施例5中iMSC衰老早期胞内线粒体密度变化结果示意图。

图6为本发明实施例5中iMSC衰老后期胞内线粒体密度变化结果示意图。

具体实施方式

本发明提供一种新型miRNA的抑制物及其在体外缓解iMSC衰老中的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种新型miRNA抑制物，所述新型miRNA抑制物为miR-311抑制物，所述miR-311抑制物的核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示：

SEQ.ID NO 1：GAAUGACCUAACACCCCAC

miRNA是一类约由22个核苷酸组成的特殊RNA，影响靶向mRNA的翻译和稳定性来调控转录后的基因表达，被视为基因调控的重要贡献者。miRNA是衰老相关基因表达的重要调控分子。大多数调控干细胞衰老的miRNA已在造血干细胞和间充质干细胞中被证明，通过靶向DNA损伤、表观遗传变化和代谢的相关基因。本发明实施例通过提供一种miRNA抑制物——miR-311抑制物，加入体外培养的iMSC(iPSC-MSC，多能诱导干细胞衍生的间充质干细胞)中，可以有效缓解iMSC复制性衰老，包括来自携带基因突变的早老症病人iMSC的衰老。

miRNA前体的标志性发夹结构，能够用来预测新的miRNA。miR-311通过整合miRNA预测软件(miREvo和mirdeep2)分析前体序列中的二级结构及Dicer酶切位点信息、能量等特征预测而来的新miRNA。miR-311抑制物是依据miR-311序列信息设计合成的RNA单链，能够与成熟miR-311序列竞争性结合，达到削弱内源miR-311的基因沉默效应。本发明实施例中指出的miR-311抑制物具备缓解体外扩增诱发的iMSC复制性衰老为新发现。

在一些实施方式中，所述miR-311抑制物为化学合成。可通过普通的合成公司进行相应的化学合成。

本发明实施例还提供一种miRNA抑制物在体外缓解iMSC衰老中的应用，所述miRNA抑制物为miR-311抑制物，其核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示，所述应用为非诊断目的。

在一些实施方式中，将所述miR-311抑制物应用于体外缓解早老症患者iMSC复制性衰老，所述应用为非诊断目的。

在一些实施方式中，所述应用的方法为：在iMSC培养基中添加脂质体包裹的miR-311抑制物，缓解iMSC复制性衰老。

具体的，所述脂质体包括lipofectamine 3000或其他任何常见的转染试剂。

在一些实施方式中，所述的miR-311抑制物的孵育浓度为100-200nM。优选的，孵育浓度为150nM。

在一些实施方式中，所述的缓解iMSC衰老包括：减少iMSC衰老相关标志蛋白的表达，促进iMSC衰老后期的细胞增殖，改善iMSC衰老后期的线粒体膜电位状态，降低iMSC线粒体密度。

具体的，所述衰老相关标志蛋白包括p21以及p16

本发明实施例在iMSC培养基中添加脂质体包裹的miR-311抑制物，缓解iMSC复制性衰老，包括来自携带基因突变的早老症病人iMSC的衰老。所述的缓解iMSC复制性衰老是指：减少了衰老相关标志蛋白(p21和p16

下面通过具体实施例对本发明一种新型miRNA抑制物及其在体外缓解iMSC衰老中的应用做进一步的解释说明：

实施例1iMSCs衰老后期细胞衰老β-半乳糖苷酶染色

1、提供人工合成的miR-311模拟物(即miR-311mimic)和阴性对照物(即negativecontrol,NC)，其中miR-311mimic的正义链序列如SEQ.ID NO 2所示：GUGGGGUGUUAGGUCAUUC，反义链序列如SEQ.ID NO 3所示：AUGACCUAACACCCCACUU；阴性对照NC的正义链序列如SEQ.ID NO 4所示：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，反义链序列如SEQ.ID NO 5所示：ACGUGACACGUUCGGAGAATT。

2、使用lipofectamine 3000转染试剂(Invitrogen)分别完成上述miR-311mimic和NC的脂质体包裹。

3、将P12代早老症病人iMSC(P12指第12代，视为细胞衰老后期)接种至细胞培养板中，使用无血清的hMSC培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养。第二天对照组和实验组分别更换含有150nM浓度的NC和miR-311mimic的新鲜培养基，孵育2天后使用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行染色，在显微镜下观察染色结果。

记录结果如图1所示，由图可知，与阴性对照组(NC组)相比，添加miR-311mimic的实验组显著增加了β-半乳糖苷酶染色阳性比例。

实施例2iMSC衰老后期胞内衰老相关蛋白表达量变化

1、提供人工合成的miR-311模拟物(即miR-311mimic)、miR-311抑制物(即miR-311inhibitor)和阴性对照物(即NC和iNC)，其中miR-311inhibitor的序列如SEQ.ID NO 1所示：GAAUGACCUAACACCCCAC；iNC的序列如SEQ.ID NO 6所示：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA；miR-311mimic和NC同实施例1.

2、使用lipofectamine 3000转染试剂(Invitrogen)分别完成上述核苷酸的脂质体包裹。

3、将P12代iMSC(衰老后期)接种至细胞培养板中过夜培养，待细胞汇合度达到70％后分别更换含有NC、iNC、miR-311mimic和miR-311inhibitor(浓度为150nM)的新鲜培养基，孵育2天后收集细胞内总蛋白，通过Western blot实验分别检测衰老相关蛋白p21和p16

实验结果如图2所示。由图2A可知，与阴性对照组(NC组)相比，添加miR-311mimic显著增加了iMSC胞内p21和p16

实施例3iMSC衰老后期细胞数量增长变化

将适量的P12代和P14代iMSC(衰老后期)接种到细胞培养板中过夜培养，待细胞汇合度达到50-60％时，分别更换含有NC、iNC、miR-311mimic和miR-311inhibitor(浓度为150nM)的新鲜培养基，孵育2天后固定细胞并对细胞核进行染色，使用荧光显微镜拍摄DPAI染色情况，运用软件对细胞核进行计算统计。

统计结果如图3所示，由图可知，与对照组(iNC组)相比，miR-311inhibitor均促进了健康人群和早老症病人来源iMSCs衰老后期的细胞数量增长。

实施例4iMSC衰老早期和后期胞内线粒体膜电位状态

将适量的P6代早老症病人iMSC(衰老早期)和P13代健康人群iMSC(衰老后期)接种到细胞培养板中过夜培养，第二天分别更换含有NC、iNC、miR-311mimic和miR-311inhibitor(浓度为150nM)的新鲜培养基，孵育2天时对细胞进行线粒体膜电位分析，使用荧光显微镜观察并拍摄。

实验结果如图4所示，由图可知，与对照组相比，miR-311mimic组中多数细胞的红色荧光信号衰减和绿色荧光信号增强；miR-311inhibitor组中多数细胞的红色荧光信号增强和绿色荧光信号衰减，即添加miR-311inhibitor改善了iMSCs衰老早期和后期胞内线粒体膜电位状态。

实施例5iMSCs衰老早期以及衰老后期胞内线粒体密度变化

将适量的iMSC(P6代视为衰老早期，P12代视为衰老后期)接种到细胞培养板中过夜培养，第二天分别更换含有NC、iNC、miR-311mimic和miR-311inhibitor(浓度为150nM)的新鲜培养基，孵育2天后对细胞进行线粒体染色，使用荧光显微镜观察并拍摄染色情况。

实验结果如图5-图6所示，由图可知，无论是衰老早期还是衰老后期的iMSC，与对照组相比，miR-311mimic组中多数细胞的红色荧光信号增强，miR-311inhibitor组中多数细胞的红色荧光信号削减，即添加miR-311inhibitor下调了iMSCs线粒体密度。

综上所述，本发明公开了一种新型miRNA抑制物及其在体外缓解iMSC衰老中的应用，所述新型miRNA抑制物为miR-311抑制物，核苷酸序列为GAAUGACCUAACACCCCAC。本发明在体外扩增培养iMSC过程中，通过在iMSC培养基中添加脂质体包裹的miR-311抑制物，缓解iMSC复制性衰老，包括来自携带基因突变的早老症病人iMSC的衰老。所述的缓解iMSC复制性衰老是指：减少了衰老相关标志蛋白(p21和p16

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。