一种猪伪狂犬病病毒gH与gL亚单位联合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于兽用疫苗和兽用生物制品领域，涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种猪伪狂犬病病毒gH与gL亚单位联合疫苗及其制备方法。

背景技术

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的急性传染病。在PRV的诸多感染宿主中，以猪的感染率和发病率最高，病毒可潜伏于三叉神经节或荐神经节造成潜伏感染，使病猪长期带毒，难以根除。该病曾是严重威胁全球养猪业发展的主要传染病之一，然而在欧、美等国家20世纪90年代启动根除计划后，已无PRV疫情。在我国，主要使用弱毒活疫苗对PRV进行防控，目前我国PRV的流行已不再严重，可以进入到净化阶段，而疫病净化的后期，一般主张不再接种具有感染性的活疫苗，而应接种灭活苗或基因工程亚单位疫苗，因此开发针对PRV的亚单位疫苗对于疫病的防控和净化具有重大意义。

PRV属于疱疹病毒科(Herpesviridae)疱疹病毒α-亚科成员，为双股DNA病毒，基因组大小约150kb，至少含有75个开放阅读框。在PRV已鉴定的11种糖蛋白中，gB、gC、gD、gH、gL和gK是病毒复制所必需的糖蛋白。gB、gD和gC抗原被认为是研发PRV亚单位疫苗的首选抗原，大多数PRV亚单位疫苗的研发以这三者为主，如，CN107485712A使用大肠杆菌耐热肠素(ST)与不耐热肠毒素(LT)融合表达gB与gC(gB-STLT-gC)可以有效预防PRV对仔猪的感染，并在攻毒后有100％的保护效果；CN114146172A制备的gB、gC和gD纳米抗体具有强大的中和作用，能给仔猪提供100％的保护。但至今尚无可供应用的基因工程亚单位疫苗，因此仍需对此继续加强研究。gH与gL抗原在病毒入侵细胞时具有重要作用，其形成的二聚体对于侵染过程中病毒与细胞的融合具有重要作用。PRV在缺失gH与gL后，难以在细胞上产生有效的感染，两者也是PRV重要的抗原。且目前国内尚未有使用融合gH与gL抗原形式的亚单位疫苗。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗及其制备方法，该疫苗能使动物产生高水平中和抗体，同时又能提供免疫保护。

为达上述目的，本发明采用的技术方案是：一种融合蛋白，其包括猪伪狂犬病毒gH蛋白和gL蛋白，编码该蛋白的gH-gL基因序列如SEQ ID NO.1所示。其中，gH-gL基因是分别以猪伪狂犬病毒gH和gL基因序列作为N端和C端序列，中间添加EAAAK序列的linker，通过重叠延伸PCR扩增得到。

本发明同时提供一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗，其包括上述的融合蛋白，还包括有免疫佐剂，融合蛋白与免疫佐剂的体积比为1：1，且该疫苗蛋白浓度为30μg/mL，较佳的，免疫佐剂为ISA 201VG佐剂。

本发明还提供上述猪伪狂犬病毒亚单位疫苗的制备方法，步骤如下：

1)将上述融合蛋白的编码基因克隆至表达载体(如pKS001)中，构建重组表达载体，其中，该编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；

2)将重组表达载体转染至细胞(较好采用哺乳动物细胞CHO-K1Q)中，构建稳定细胞株，发酵表达，纯化，得上述融合蛋白；

3)将融合蛋白与免疫佐剂按体积比1:1充分混匀。

哺乳动物表达系统能更完善的翻译蛋白后糖基化、乙酰化和磷酸化等修饰。本发明以PRV的gH和gL蛋白为基础，使用哺乳动物表达细胞CHO-K1Q表达出gH和gL的gH-gL融合蛋白。并经动物免疫保护实验显示，以纯化的gH-gL蛋白为免疫原与商品化佐剂制备的重组亚单位疫苗，经肌肉注射免疫小鼠和猪后，发现本发明的gH-gL亚单位疫苗不仅可以产生使小鼠和猪产生高水平中和抗体，同时攻毒保护率为100％，具有良好的免疫保护作用，可用于PRV的防控与净化，具有广阔的应用背景和较大商业价值。

附图说明

图1是本发明重组表达载体pKS001-gH-gL的构建示意图。

图2是本发明重组蛋白N端gH基因片段PCR扩增电泳图，

其中，M：DNA分子mark；泳道1,2：gH基因片段。

图3是本发明重组蛋白C端gL基因片段PCR扩增电泳图，

其中，M：DNA分子mark；泳道1,2：gL基因片段。

图4是本发明重组蛋白gH-gL基因片段PCR扩增电泳图，

其中，M：DNA分子mark；泳道1,2：gH-gL基因片段。

图5是本发明gH-gL阳性转化子鉴定电泳图，

其中，M：DNA分子mark；泳道1,2,3：pKS001-gH-gL阳性转化子。

图6是本发明CHO-K1Q-gH-gL细胞株(7A2单克隆细胞株)上清中gH-gL蛋白的western blot鉴定图，

其中，M：彩虹180蛋白mark；泳道1：转染gH-gL后CHO-K1Q细胞表达上清；泳道2：正常CHO-K1Q细胞的表达上清。

图7是本发明CHO-K1Q-gH-gL细胞株(7A2单克隆细胞株)表达上清纯化后电泳图，

其中，M：彩虹180蛋白mark；泳道1,2：7A2单克隆细胞株表达上清纯化的gH-gL蛋白。

具体实施方式

实施例1表达载体构建及蛋白制备

根据PRV-XiangA株gH蛋白(GenBank accession：KF711986.1)和gL蛋白(GenBan kaccession：KF711988.1)基因序列(由南京金斯瑞生物公司进行密码子优化及基因合成)，设计PCR扩增引物，分别以gH和gL作为N端序列和C端序列，中间添加EAAAK序列linker，扩增出重组基因gH-gL基因，通过基因克隆将gH-gL基因克隆至哺乳动物表达载体pKS001的HindⅢ和EcoRⅠ中构建出重组表达载体pKS001-gH-gL(图1)，提取无内毒素的重组表达载体pKS001-gH-gL，将其转染至哺乳动物细胞CHO-K1Q中，构建稳定表达gH-gL蛋白的CHO-K1Q稳定细胞株，发酵表达，纯化得gH-gL蛋白，用于后期的疫苗制备。1.重组表达载体pKS001-gH-gL的构建

1.1PCR扩增

以合成的gH和gL基因为模板，设计的gH-N-FP/gH-C-RP和gL-N-FP/gL-C-RP为扩增引物(扩增引物序列见表1)。gH扩增长度为1965bp，结果见图2；gL扩增长度为463bp，结果见图3；以上述PCR产物1:1混合后作为模板，进行重叠延伸PCR扩增，扩增片段长度为2382bp，结果见图4，使用Omega的DNA清洁回收试剂盒回收PCR扩增片段。

表1gH-gL基因的PCR扩增引物

1.2重组质粒的克隆转化

1)使用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶对pKS001质粒和回收后的gH-gL基因扩增片段分别进行酶切，37℃酶切3h，酶切体系见下表2，使用Omega的DNA清洁回收试剂盒，清洁回收酶切后的pKS001载体片段和gH-gL基因片段。

表2pKS001质粒与gH-gL基因酶切体系

2)使用DNA T4连接酶进行pKS001酶切载体和gH-gL基因片段连接，连接体系见下表3。

表3gH-gL基因片段与pKS001酶切载体的连接体系

3)取gH-gL基因片段与pKS001载体的连接产物10μL，轻轻加入放置在冰盒上的100μL TOP10感受态中，轻轻吹打混匀，将该混合物置于冰上30min，42℃水浴中90秒进行热激，然后迅速放回冰浴中，静置3-5min。

4)加入500μL不含抗生素的LB培养液，轻轻混匀，37℃、180rpm下震荡培养45min。

5)将菌液以5000rpm离心5min以沉淀菌体，留离心管底部约50-100μL的培养液，重悬菌体，然后全部均匀涂布到含氨苄抗生素的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜。

1.3阳性转化子的PCR鉴定及测序

挑取pKS001-gH-gL转化平板上的克隆菌落作为模板，以gH-N-FP/gL-C-RP为鉴定引物，进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行核酸电泳，分析条带大小，与预期相符合(结合参见图5)，表明pKS001-gH-gL克隆菌被成功克隆。

1.4重组质粒的提取

使用LB培养基，接种pKS001-gH-gL重组克隆菌200mL，37℃，180rpm，培养12h后，7000rpm离心4min，收集细菌，使用北京天根生物无内毒素质粒大提试剂盒(DP117)进行质粒的提取。

2.融合蛋白gH-gL的表达

材料及设备：CHO-K1Q细胞株、

2.1细胞的复苏及传代

从液氮罐中取出CHO-K1Q细胞，在37℃水中快速解冻。将细胞液转移至15mL离心管中，加入10mL预热的CD04(加入5mM的谷氨酰胺)培养基，1000rpm离心3min，丢弃上清液，使用5mL CD04(加入5mM的谷氨酰胺)培养基重悬，并用细胞计数板进行细胞计数。将冷冻管的全部细胞液转移到装有15mL预热的CD04(加入5mM的谷氨酰胺)培养基的125mL摇瓶中，稀释至所需细胞密度，将摇瓶在含有5％CO2，37℃，摇床125rp m进行培养。细胞复苏后培养2～3d处于对数生长中期时传代。在进行其下游的转染表达实验前，对复苏的CHO-K1Q细胞进行三次传代培养，逐步调整细胞生长活力。

2.2细胞转染

1)使用CD04(加入5mM的谷氨酰胺)复苏CHO-K1Q至500mL细胞摇瓶内，待CH O-K1Q细胞密度增殖至4×10

2)取50μg pKS001-gH-gL质粒到4mm电转杯中，然后加入4×10

3)使用4mm电转杯进行电转实验，电转参数：电压280V、脉冲次数3次、脉冲时长10ms、脉冲间隔时5s。

4)电转后将细胞转移至T25细胞培养瓶中，添加5mL CD04(加入5mM的谷氨酰胺)，静置于恒温箱中。

2.3MSX加压筛选

1)静置培养以上转染细胞24h后，将T25细胞培养瓶之中的细胞转移至50ml离心管，180g/min，5min离心收集细胞，弃掉上清，使用CD04培养基(含有25μM，MSX)重选细胞，按照1～2×10

2)待细胞长至每孔的1/4时，使用ELISA方法检测表达量，挑选适量高表达孔的细胞，转移富集到新的96孔板上继续培养，挑选高表达细胞池，进行逐步放大培养。

2.4单克隆挑选及增值

1)使用CD04培养基(含有25μM，MSX)对筛选的最优表达细胞池进行传代和培养，培养细胞池密度至2～3×10

2)将适量的细胞培养物置于24孔板中，使用CD04培养基，将细胞密度进行倍比稀释至200cells/mL。

3)使用QuaMono

4)使用96孔扫描显微镜，对所有的克隆孔，进行逐一扫描拍照，筛选单克隆孔并进行标记。

5)置入恒温培养箱静置培养，第0d、第1d、第2d、第3d、第7d对单克隆细胞孔，进行扫描观察，拍照记录细胞生长情况。

6)第7d时，按照100μL/孔标准，添加CHO cloning Medium C(2周后，单克隆细胞的汇合度可以达到1/2-1/3)。

7)一般为铺板后的14-15d后，待细胞长至每孔的1/4时，挑选细胞生长状态良好、生长旺盛的细胞孔，转移到新的96孔板。

8)3d后，使用ELISA方法检测表达上清，根据检测结果，挑选适量高表达的细胞池，进行悬浮培养放大，冻存后作为构建的稳定转染细胞种子，其中单克隆4C4株、6E7株、7A2株和8C2株表达水平较高，且7A2株的表达量最高。

3.使用摇瓶进行稳定细胞株Fed-batch发酵表达

使用125mL的细胞摇瓶接种构建的CHO-K1Q稳定细胞株7A2，逐渐放大至500mL的摇瓶中进行培养，培养基选择CD04培养基。使用CHO Feed02 Supplement补料进行补加营养，进行发酵培养，同时按照6g/L的标准补充葡萄糖。第0d开始取样，绘制细胞生长曲线，第3d开始留样，进行后续统一产量检测，第14d时，细胞活率低于60％时收获。

4.表达上清中gH-gL蛋白的Western-boling鉴定

1)细胞株7A2悬浮发酵第4d，收集了1mL上清液，同时收集未转染的CHO-K1Q细胞的上清液作为对照。

2)取上清样品，各加入10μL的loading buffer和30μL的转染上清，煮沸5min，在提前制备12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶内上样，彩虹蛋白mar k加入5μL，转染上清样品每孔加入10μL，120V电泳80min。

3)将Millipore PVDF(0.45μm)膜进行用甲醇浸泡1min预处理，后放置到转膜液浸泡2min。转膜放置顺序：夹子黑色面+聚乙烯板+滤纸+凝胶+PVDF膜+滤纸+聚乙烯板+夹子白色面。280mA恒流，低温情况下转膜45min。

4)用含有5％脱脂奶粉和5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(pH7.4，0.1％Tween 20)作为封闭液，4℃封闭过夜。

5)使用封闭液稀释His-tag单克隆抗体(MAb)至终浓度0.2μg/mL，将PVDF膜置于使用封闭液稀释好的一抗中，在37℃摇床上孵育2h，转速80rpm。

6)使用PBS(pH7.4，0.1％Tween 20)在侧摆摇床上洗涤PVDF膜，洗涤3次，转速60rpm，每次洗涤10min。

7)使用封闭液稀释羊抗鼠IgG H&L(HRP)二抗，至工作浓度为0.05～0.2μg/mL，将PVDF膜置于使用封闭液稀释好的二抗中，37℃摇床上缓慢摇动孵育1h，转速为80rpm。

8)使用PBS(pH7.4，0.1％Tween 20)在侧摆摇床上洗涤PVDF膜，洗涤3次，转速60rpm，每次洗涤10min。

9)打开Bio-rad化学发光分析系统，配制ECL溶液(Millipore)并将曝光液均匀滴加在PVDF膜上，然后再化学发光系统中曝光观察，使用成像系统(Bio-Rad)收集信号，并使用Image Lab软件4.0.1分析结果，结合参见图6，被曝光的gH-gL蛋白条带在100～135kDa之间，与预期大小相符。

5.表达上清中gH-gL蛋白的纯化

收集gH-gL细胞表达上清，使用Ni Focurose 6FF(TED)介质纯化蛋白，步骤如下：

1)取5mL介质，用Bingding Buffer(20mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，pH 8.0)平衡；

2)孵育：将细胞上清与平衡好的介质混合，置于摆床，4℃条件下40r/min孵育2h；

3)上柱：将孵育后的介质与表达上清混合物转移到重力柱，流穿上清；

4)洗脱：依次用含50mmol/L、100mmol/L、250mmol/L、500mmol/L咪唑浓度的Bingding Buffer洗脱，1mL/管，最后将收集液进行SDS-PAGE检测。电泳结果显示能够纯化获得纯度较高的gH-gL重组蛋白，结果见图7。

实施例2疫苗配制

以纯化的gH-gL蛋白作为免疫抗原，使用BCA蛋白定量试剂盒对纯化的gH-gL蛋白进行定量，蛋白定量后使用0.22μm滤膜过滤，使用无菌的PBS将蛋白稀释至60μg/mL，按照体积比1:1与ISA 201VG佐剂充分混匀乳化配制gH-gL疫苗(30μg/mL)，最终进行分装，保存于4℃。

实施例3小鼠的PRV免疫保护性实验

将购买的质量为18～22g的ICR小鼠16只随机分为2组。一组小鼠进行后腿肌肉注射0.1mL的gH-gL亚单位疫苗(3μg/只)(gH-gL组)，另一组小鼠肌肉注射相同剂量的佐剂(对照组)。一免后35d加强免疫一次，共免疫2次，并于一免后52d眼球内眦静脉采血，分离血清，并进行中和实验，对照组无小鼠产生中和抗体，gH-gL组血清效价在256-2048之间，最高可达2048，具体结果见表4。

表4gH-gL免疫鼠中和抗体效价

采血后7d，使用PRV-XiangA(1.5×10

实施例4猪的PRV免疫保护性实验

购买4周龄PRV阴性猪10只随机分为两组，每组各5只。免疫组采用耳后颈部肌肉注射，一免后14d加强免疫，免疫剂量为1mL(30μg/头)，共免疫两次，并于一免后28d前腔静脉采血，并进行中和效价测定。对照组猪无中和抗体产生，免疫组猪PRV中和抗体均大于1∶256。免疫后35d使用PRV-XiangA毒株滴鼻攻毒(1.5×10

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。