一种检测外周血microRNA的试剂盒

技术领域

本发明属于分子检测领域。

背景技术

microRNAs(miRNAs)是一种小型非编码的RNA基因分子，长度为19nt～23nt。通过与靶信使RNA相互作用在转录水平抑制基因的表达。虽然这些miRNA及其靶基因的生物学功能尚不清楚，但它在许多生物过程中起着重要作用，如细胞增殖分化、器官发育、代谢、免疫反应、肿瘤发生以及病毒感染。近年来，肿瘤的发生成为威胁健康的一大诱因，因为肿瘤的发生而导致的疾病是人类死亡的一个主要因素。相关研究表明，miRNA与肿瘤发生有关，特别是microRNA在肺癌患者的体内表达明显下调。microRNA在转录后水平上抑制肾素-血管紧张素系统(RAS)和c-MYC的表达，因为(RAS)和c-MYC是许多肿瘤的共同通路，因此microRNA可能是肿瘤发生的靶基因，与人类健康直接相关，被认为是抑癌基因，常被作为检测肺癌生物传感器的目标基因。因此探究精确且灵敏的microRNA检测方法对于临床诊断和治疗是非常必要的。

因为microRNA的长度较短，且与其同源序列仅有一两个碱基的差异，因此精确的microRNA的检测还是比较困难的。目前也有很多技术应用于microRNA检测，如实时逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)，定量聚合酶链反应(qPCR)，微阵列芯片技术，Northern印迹分析技术，但目前这些技术都存在一些短板，例如操作过程复杂、耗时长，检测所需设备昂贵、成本高，检测的灵敏度及选择性差等。近几年，滚环扩增(RCA)以及环介导恒温扩增(LAMP)等核酸扩增的方法应用于microRNA的检测，提高了microRNA检测的灵敏度和选择性，降低了检测成本，但是恒温扩增的反应机理较复杂，耗时长，难以应用于临床检测的需要，因此开发便捷、操作简单且能应用于实际临床应用的microRNA检测方法是目前的一个研究热点。

点亮型RNA适体(light-upRNAaptamer)是一种具有特定二级结构的RNA分子，可结合核酸荧光染料，触发强荧光。目前已筛选点亮型RNA适体包括Broccoli、DIR2-1、Spinach、Spinach2等，可结合e)-1,2-dimethyl-1H-imidazol-5(4H)-one(DFHBI)或者后者的改进版本(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1Himidazol-5(4H)-one(DFHBI-1T)，并使DFHBI或DFHBI-1T发出强荧光。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种全新的检测microRNA的方法，用于准确检测肺癌病人与健康人体内microRNA表达水平的差异。该方法对于检测microRNA简单可行，为临床检测提供参考。本发明的技术方案如下：

一种基于点亮型RNA，通过链置换检测microRNA的方法。

所述点亮型RNA适体的制备，所需序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。

所述错配链序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.12所示。

所述点亮型RNA适体由模板链转录得到。其模板链与单链DNA发生错配，在microRNA存在时，辅助链置换，形成带有启动子和点亮型RNA适体的DNA双链，进而转录得到点点亮型RNA适体。

其中，模板链与其他序列的摩尔浓度比为1:1，模板链与错配链的摩尔浓度比为1:(1～10)一种检测microRNA的方法，包括如下步骤：

1)由模板链SEQ ID NO.1分别与Broccoli DNA链SEQ ID NO.2、错配链SEQ IDNO.5～SEQ ID NO.12按1：1：(1～10)的摩尔比于pH值7.5±0.5的液体环境中混合后，90℃孵育3min，然后自然冷却至室温；

2)在上述混合物中加入与模板链等摩尔比的引物链SEQ ID NO.3与microRNA链SEQ ID NO.4将错配链置换，室温孵育20～30min；

3)在上述混合物中加入0.5～1μL T7 RNA聚合酶(20U/μL)及rNTP混合物，35～40℃孵育4h完成转录，获得Broccoli对应的RNA链；

4)将获得的Broccoli RNA链与DFHB-1染料相结合，室温孵育5～10min；

5)测荧光强度。

优选的，步骤1)中的SEQ ID NO.1分别与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6的摩尔比为1：1：1.5。

本发明方法的工作原理是：点亮型RNA适体由DNA模板转录而成，当目标microRNA存在时，辅助链置换形成含有启动子和点亮型适体DNA模板的双链DNA，进一步转录得到点亮型RNA适体。RNA适体结合特征核酸染料，发射荧光。由于点亮型RNA适体和与特征核酸染料的特异性结合，我们实现了对microRNA的高灵敏度的、非标记、非扩增、非逆转录的一步检测。

本发明的方法具有如下有益效果。

1)灵敏度高。可检测浓度低至0.7pM的microRNA。

2)特异性好。本发明的检测目标microRNA方法几乎不会对let-7g、miRNA-21、miRNA-141等与microRNA序列相近的microRNAs产生荧光增强效果。

3)检测方便。检测过程操作简便，不需要特定的实验技能，检测结果清晰易懂。

4)非扩增、非逆转录、非标记。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是采用本发明提供的链置换转录扩增检测microRNA的原理示意图。

图2是实施例2绘制的标准曲线。

图3是实施例3中错配链长度不同对荧光强度值的测试结果。

图4是模板链与错配链摩尔浓度比不同对荧光强度值的测试结果结。

图5是实施例4中不同染料对荧光强度的测试结果。

图6是实施例5中该传感器对目标microRNA的特异性选择性测试结果。

图7是实施例6中检测肺癌病人和健康人血清中microRNA的结果。

具体实施方式

实施例1制备RNA溶液

本实施例中，涉及的序列如表一所示，均合成于上海生工生物科技有限公司。

步骤如下：

1)合成所以反应链，其序列如表1所示；

2)将4μL浓度为1μM的模板链溶液，4μL浓度为1μM的Broccoli的DNA模板链溶液和4μL浓度为1.5μM的错配链溶液加入200μL的离心管内，混匀，在90℃下退火5分钟，然后自然冷却室温放置；

3)加入4μL浓度为1μM的引物溶液，4μL浓度为1μM的microRNA标准溶液，混匀，在室温条件下孵育30min；

4)加入1μL浓度为20U/μL的T7 RNA聚合酶，8μL的T7 RNA聚合酶缓冲液和2μL的rNTP混合物，混匀，在37℃下孵育4h，获得Broccoli的RNA溶液；

5)然向反应后的混合溶液中加入4μL浓度为100μM的DFHBI-1染料溶液和5μLH

(对照组步骤同上，将目标物microRNA标准溶液换成H

案例涉及序列序列

名称 序列(5’-3’)

模板链(Template)

GAGCCCACACTCTACTCGACAGATACGAATATCTGGACCCGACCGTCTCCCCTATAGTGAGTCGTATTAAACTATACAACCTACTACCTCA(SEQ ID NO.1)

Broccoli

GAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTC(SEQ ID NO.2)

引物(Promoter)

TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO.3)

microRNA

TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT(SEQ ID NO.4)

错配链(P

TGTATAGTTTAATACGACT(SEQ ID NO.5)

错配链(P

GTTGTATAGTTTAATACGACT(SEQ ID NO.6)

错配链(P

AGGTTGTATAGTTTAATACGACT(SEQ ID NO.7)

错配链(P

GTAGGTTGTATAGTTTAATACGACT(SEQ ID NO.8)

错配链(P

TAGTAGGTTGTATAGTTTAATACGACT(SEQ ID NO.9)

错配链(P

GTTGTATAGTTTAATACGA(SEQ ID NO.10)

错配链(P

GTTGTATAGTTTAATACGACTCA(SEQ ID NO.11)

错配链(P

GTTGTATAGTTTAATACGACTCACT(SEQ ID NO.12)

实施例2绘制标准曲线

本实施例中，绘制标准溶液曲线，步骤如下。

(1)配制microRNA标准溶液

配制4μL microRNA标准溶液，浓度分别为10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM；

(2)绘制标准曲线

步骤如实施案例1，在步骤3)中加入不同浓度的microRNA标准溶液溶液进行反应，制得的溶液与DFHBI-1染料混合后，室温下反应10min,在468nm的波长下测定反应混合液的荧光强度，记录该microRNA浓度下对应的的荧光强度峰值；以microRNA溶液浓度为横坐标，以该microRNA溶液浓度对应的荧光强度峰值为纵坐标绘制标准曲线。拟合出的标准曲线的回归方程为y＝269.05x+1102.7(R

小结：本实施例不仅得到了标准曲线，还得到其LOD为0.7pM，可见其检测灵敏度很高。

实施例3错配链长度不同对荧光强度结果的影响。

本实施例中，检测不同的错配链加入反应体系的荧光强度峰值在实施例1的步骤2)中加入4μL浓度为1.5μM的不同长度错配链进行反应后加入DFHBI-1染料，然后制得的溶液混合，室温下反应10min,在468nm的波长下测定反应混合液的荧光强度，记录该错配链长度制得的反应混合液的荧光强度峰值；对照组步骤同上，将目标物microRNA溶液换成H

结果：实验结果如图3所示，当错配链长度为P

结论：错配链长度要适中，才能得到较好的检测信噪比；当错配链长度为P

实施例4模板链与错配链摩尔浓度比不同对荧光强度结果的影响。

本实施例中，检测模板链与错配链摩尔浓度比不同时反应体系的紫外吸光度值在实施例1的步骤2)中加入4μL浓度为1μM、1.5μM、2μM、4μM、10μM的错配链溶液，使模板链与错配链摩尔浓度比为1:1、1:1.5、1:2、1:4、1:10，反应后加入DFHBI-1染料，然后制得的溶液混合，室温下反应10min,在468nm的波长下测定反应混合液的荧光强度，记录该错配链浓度制得的反应混合液的荧光强度峰值；对照组步骤同上，将目标物microRNA溶液换成H

结果：实验结果如图4所示，当错配链浓度为1.5μM时效果最好(信噪比最高)，当错配链浓度较大时，信号荧光值会降低，信噪比减小。

结论：错配链浓度适中，检测信噪比高；当模板链与错配链的摩尔浓度比为1:1.5时检测信噪比最高。

实施例5染料不同对荧光强度结果的影响。

本实施例中，检测不同的染料加入Broccoli的RNA溶液反应体系的紫外吸光度值1)分别在实施例1步骤4)中得到的Broccoli的RNA溶液反应体系中加入4μL浓度为1.5μM的SYBR Green II、SYBR Gold、DFHBI-1染料，然后制得的溶液混合，室温下反应10min,在468nm的波长下测定反应混合液的荧光强度，记录该染料制得的反应混合液的荧光强度峰值；对照组步骤同上，将目标物microRNA溶液换成H

结果：实验结果如图4所示，当染料为SYBR Green II或SYBR Gold时信号荧光值和背景荧光值都会大幅度增加，信噪比极低；当染料为DFHBI-1时信号荧光值和背景荧光值比值较大，达到5.58，能够轻易的分辨出microRNA组与对照组。

结论：溶液体系最适合使用的染料是DFHBI-1染料，用DFHBI-1染料时检测信噪比最高。

实施例6对靶分子的选择特异性。

本实施例中，检测本发明方法对目标microRNA的选择特异性。

(1)用超纯水分别配制1.5μM的let-7g、miR-21、miR-141核酸溶液；并使用let-7g、miR-21、miR-141核酸溶液替代实施例1步骤2)中的microRNA溶液，进行反应后加入DFHBI-1染料，然后制得的溶液混合，室温下反应10min,在468nm的波长下测定反应混合液的荧光强度，记录该核酸溶液制得的反应混合液的荧光强度峰值；对照组步骤同上，将目标物microRNA溶液换成H

let-7g、miR-21、miR-141的序列如下所示。

被检miRNA的序列

名称 序列

let-7g

UGAGGUAGUAGUUUGUACAGU

miR21

TAGCTTATCAGACTGATGTTGA

miR-141

TAACACTGTCTGGTAAAGATGG

结果：如图5所示，在检测miRNA样本时，只有microRNA具有良好的荧光强度增强的效果，检测let-7g、miR-21、miR-141几乎没有荧光增加，说明本发明具有较好的特异性。

结论：

本发明对let-7g、miR-21、miR-141等与microRNA相近的miRNA样本能有效辨别，具有良好的特异性。

实施例7临床检测。

本实施例中，检测来自5位肺癌病人和4位健康志愿者血清中microRNA的浓度，并分析其显著性差异，步骤如下：

(1)从5位肺癌病人和4位健康志愿者的血样中分离出血清，依次记作C1#～C5#，A1#～A4#,癌症病人样品记为C，健康志愿者记为A，用Trizol法提取C1#～C5#，A1#～A4#血清的总RNA，制成RNA水溶液；

(2)RNA水溶液的microRNA检测

①依次使用C1#～C5#，A1#～A4#血清样品提取的RNA溶液代替实施例1步骤3)中的microRNA标准样品溶液，进行反应后加入DFHBI-1染料，然后制得的溶液混合，室温下反应10min,在468nm的波长下测定反应混合液的荧光强度，记录该RNA溶液制得的反应混合液的荧光强度峰值；

②将C1#～C5#，A1#～A4#血清样品提取的总RNA溶液的荧光强度峰值分别代入标准曲线的回归方程中，计算C1#～C5#，A1#～A4#血清样品中microRNA的浓度；

结果：如图3所示，肺癌病人和健康志愿者的血清样品提取出的总RNA中microRNA的含量具有显著性差异。由图中误差条还可知晓，每次重复检测的结果差别较小，表明检测可重复性良好。

结论：本发明的方法可用于临床检测，得到比较可靠的检测结果。