一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体公开了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜、制备方法及其应用。

背景技术

人的机体在受到创伤后会导致皮肤破损，而皮肤破损后会导致人体的防御能力下降，进而造成人体失血过多甚至导致创伤感染，从而影响人体的自我修复能力，导致皮肤创伤的愈合能力降低。

而现目前针对此种较难经过自身愈合而恢复的皮肤创伤，常常采用创面上药、清创和创面缝合的物理化学双管齐下的操作来治愈创伤，然而在针对创口较深的情况时，由于使用该方法需要在治疗过程中频繁换药，不仅操作复杂，而且在换药的过程中由于伤口较深，若操作不当容易造成伤者的创伤受到二次伤害；且采用物理缝合后会导致患者周边的皮肤也受损，并导致在缝合处结痂，从而影响皮肤的塑性和质感，导致创伤部位的皮肤品质较差，进而影响美观等。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜，其主要解决了现目前因创面的生长因子合成减少、降解和失活增加导致损伤难以愈合的技术问题，且自体PRP无排斥反应。

本发明的第二目的在于提供一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜的制备方法，制备方法包括BC水凝胶的制备、PRP的制备以及组分混合等步骤，该方法操作简单方便。本发明中的PRP制备方法如下：使用血液成分分离机，采用一次性全封闭管道套件进行自体外周血成分单采，即得到PRP，将采集所得PRP进行分装，然后梯度冻存在-85°冰箱备用；成分血单采采用血液成分分离机进行，特点是：1)在全封闭状态下采集PRP，污染机会极低；2)PRP中血小板浓度、纯度高，红细胞和白细胞混入率极低；3)受治疗的患者自体血液损失少；4)PRP采集时间相对较短；5)实现PRP1次采集多次使用。即在本申请中一次采集量可供多次治疗，且采用完全封闭的管道系统，从根源上杜绝血液污染，减少患者风险及治疗费用。

本发明的第三目的在于提供一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜在制备用于皮肤创伤修复、皮肤塑性和润滑材料中的应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜，包括BC水凝胶、PRP、氯化钙溶液和牛凝血酶，BC水凝胶、PRP、氯化钙溶液和牛凝血酶的体积比为(0.5-1.5):(0.5-1.5):1:1。其中BC水凝胶具有许多优越的物理化学性能，包括高纯度、高结晶度、纳米纤维网状结构、柔软的弹性性质、高保水能力和良好的生物相容性，能够持续性的修复皮肤，从而不需要对皮肤内的药物进行反复换药，减轻了操作难度，并且避免因为频繁换药而对伤者的创伤部位造成二次伤害；而PRP能够在组织内抑制分解代谢酶，招募干细胞和成纤维细胞到损伤部位，从而对损伤部位的皮肤进行修复的同时，还能够加速表皮细胞的生长代谢，以使重新生长好的皮肤的质感更加紧致，而且还能够使皮肤表面的角质层脱落、重新生长，从而使皮肤表面更加光滑；而上述各原料相结合后，BC水凝胶和氯化钙溶液能够为PRP在组织内产生作用提供有益的环境条件，从而使PRP能够更有效的与受体细胞(干细胞、成纤维细胞和表皮细胞等等)和受体酶(分解代谢酶等)相结合，提高PRP的利用率，另外，BC水凝胶和牛凝血酶还能够辅助PRP修复创伤皮肤，从而进一步提高创伤的修复效率，减少修复时间；此外PRP还能够在BC水凝胶内均匀分布，从而使其能均匀作用于创伤部位，使周围的受损皮肤均匀生长，保证其在愈合后的皮肤的长势相近，从而使皮肤整体更加紧致，因此在皮肤经过缝合后，该细菌纤维素膜能避免周边皮肤因为缝合而导致的皮肤紧致性下降以及留疤等造成的皮肤损伤，使皮肤在缝合后仍具备较强的修复能力，从而避免留疤。

本发明还提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：BC水凝胶制备：将木醋杆菌在液体培养基内于28-32℃培养6-8天后，得到凝胶粗品，将凝胶粗品用0.4-0.6mol/L NaOH溶液浸泡后漂洗，即得到BC水凝胶；PRP制备：使用血液成分分离机，采用一次性全封闭管道套件进行自体外周血成分单采，即得到PRP，将采集所得PRP进行分装，然后梯度冻存在-85°冰箱备用；将BC水凝胶、PRP、氯化钙溶液和牛凝血酶混合，即得到细菌纤维素膜。该操作方法简单便利，能够全程处于机械化生产，从而提高该细菌纤维素膜的制备效率。

本发明还提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜在制备用于皮肤创伤修复、皮肤塑性和润滑材料中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有如下的优点与积极效果：

本发明提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜、制备方法及其应用，其中BC水凝胶具有许多优越的物理化学性能，包括高纯度、高结晶度、纳米纤维网状结构、柔软的弹性性质、高保水能力和良好的生物相容性，能够持续性的修复皮肤，从而不需要对皮肤内的药物进行反复换药，减轻了操作难度，并且避免因为频繁换药而对伤者的创伤部位造成二次伤害；而PRP能够在组织内抑制分解代谢酶，招募干细胞和成纤维细胞到损伤部位，从而对损伤部位的皮肤进行修复的同时，还能够加速表皮细胞的生长代谢，以使重新生长好的皮肤的质感更加紧致，而且还能够使皮肤表面的角质层脱落、重新生长，从而使皮肤表面更加光滑；而上述各原料相结合后，BC水凝胶和氯化钙溶液能够为PRP在组织内产生作用提供有益的环境条件，从而使PRP能够更有效的与受体细胞(干细胞、成纤维细胞和表皮细胞等等)和受体酶(分解代谢酶等)相结合，提高PRP的利用率，另外，BC水凝胶和牛凝血酶还能够辅助PRP修复创伤皮肤，从而进一步提高创伤的修复效率，减少修复时间；此外PRP还能够在BC水凝胶内均匀分布，从而使其能均匀作用于创伤部位，使周围的受损皮肤均匀生长，保证其在愈合后的皮肤的长势相近，从而使皮肤整体更加紧致，因此在皮肤经过缝合后，该细菌纤维素膜能避免周边皮肤因为缝合而导致的皮肤紧致性下降以及留疤等造成的皮肤损伤，使皮肤在缝合后仍具备较强的修复能力，从而避免留疤。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明试验例3的案例1中治疗前后创面示意图；

图2为本发明试验例3的案例2中治疗前后创面示意图；

图3为本发明试验例3的案例3中治疗前后创面示意图；

图4为本发明试验例1中各组OD值的对照示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。

本发明提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜，包括BC水凝胶、PRP、氯化钙溶液和牛凝血酶，BC水凝胶、PRP、氯化钙溶液和牛凝血酶的体积比为(0.5-1.5):(0.5-1.5):1:1，上述氯化钙溶液的初浓度为8-12mg/mL，牛凝血酶的初浓度为80-120U/mL。其中BC水凝胶具有许多优越的物理化学性能，包括高纯度、高结晶度、纳米纤维网状结构、柔软的弹性性质、高保水能力和良好的生物相容性，能够持续性的修复皮肤，从而不需要对皮肤内的药物进行反复换药，减轻了操作难度，并且避免因为频繁换药而对伤者的创伤部位造成二次伤害；而PRP能够在组织内抑制分解代谢酶，招募干细胞和成纤维细胞到损伤部位，从而对损伤部位的皮肤进行修复的同时，还能够加速表皮细胞的生长代谢，以使重新生长好的皮肤的质感更加紧致，而且还能够使皮肤表面的角质层脱落、重新生长，从而使皮肤表面更加光滑；而上述各原料相结合后，BC水凝胶和氯化钙溶液能够为PRP在组织内产生作用提供有益的环境条件，从而使PRP能够更有效的与受体细胞(干细胞、成纤维细胞和表皮细胞等等)和受体酶(分解代谢酶等)相结合，提高PRP的利用率，另外，BC水凝胶和牛凝血酶还能够辅助PRP修复创伤皮肤，从而进一步提高创伤的修复效率，减少修复时间；此外PRP还能够在BC水凝胶内均匀分布，从而使其能均匀作用于创伤部位，使周围的受损皮肤均匀生长，保证其在愈合后的皮肤的长势相近，从而使皮肤整体更加紧致，因此在皮肤经过缝合后，该细菌纤维素膜能避免周边皮肤因为缝合而导致的皮肤紧致性下降以及留疤等造成的皮肤损伤，使皮肤在缝合后仍具备较强的修复能力，从而避免留疤。

上述BC水凝胶、PRP、氯化钙溶液和牛凝血酶的体积比为1:1:1:1。

其次，本发明还提供了一种负载血小板血浆的细菌纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：BC水凝胶制备：将木醋杆菌在液体培养基内于28-32℃培养6-8天后，得到凝胶粗品，将凝胶粗品用0.4-0.6mol/L NaOH溶液浸泡后漂洗，即得到BC水凝胶；制备PRP；将BC水凝胶、PRP、氯化钙溶液和牛凝血酶混合，即得到细菌纤维素膜。该操作方法简单便利，能够全程处于机械化生产，从而提高该细菌纤维素膜的制备效率，其中PRP的制备方法为：使用血液成分分离机，采用一次性全封闭管道套件进行自体外周血成分单采，即得到PRP，将采集所得PRP进行分装，然后梯度冻存在-85°冰箱备用。

上述液体培养基包括终浓度为18-22g/L葡萄糖、4-6g/L蛋白胨、4-6g/L酵母提取物、14-16g/L d-甘露醇、2-3g/L Na2HPO4、1.5-2.5g/L柠檬酸和4-6g/L无水乙醇。

上述液体培养基包括终浓度为20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、15g/Ld-甘露醇、2.5g/L Na2HPO4、2g/L柠檬酸和5g/L无水乙醇。

之后，本发明还提供了一种负载血小板血浆的细菌纤维素膜在用于皮肤创伤修复、促进软骨细胞再生、皮肤塑性和润滑中的应用。

最后，本发明提供了一种用于皮肤创伤修复、皮肤塑性和润滑的材料，包括上述的负载血小板血浆的细菌纤维素膜。

实施例1

本实施例提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜，包括如下原料：0.5L BC水凝胶、0.5L PRP、1L初浓度为8mg/mL的氯化钙溶液和1L初浓度为80U/mL的牛凝血酶。

本实施例还提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：BC水凝胶制备：将木醋杆菌在液体培养基(包括终浓度为18g/L葡萄糖、4g/L蛋白胨、4g/L酵母提取物、14g/L d-甘露醇、2g/LNa2HPO4、1.5g/L柠檬酸和4g/L无水乙醇)内于28℃培养6天后，得到凝胶粗品，将凝胶粗品用0.4mol/L NaOH溶液浸泡后漂洗，即得到BC水凝胶；PRP制备：使用血液成分分离机，采用一次性全封闭管道套件进行患者自体外周血成分单采，即得到PRP；将BC水凝胶、PRP、氯化钙溶液和牛凝血酶混合，即得到细菌纤维素膜。

实施例2

本实施例提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜，包括如下原料：1.5L BC水凝胶、1.5L PRP、1L初浓度为12mg/mL的氯化钙溶液和1L初浓度为120U/mL的牛凝血酶。

本实施例还提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：BC水凝胶制备：将木醋杆菌在液体培养基(包括终浓度为22g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、6g/L酵母提取物、16g/L d-甘露醇、3g/LNa2HPO4、2.5g/L柠檬酸和6g/L无水乙醇)内于32℃培养8天后，得到凝胶粗品，将凝胶粗品用0.6mol/L NaOH溶液浸泡后漂洗，即得到BC水凝胶；PRP制备：使用血液成分分离机，采用一次性全封闭管道套件进行患者自体外周血成分单采，即得到PRP；将BC水凝胶、PRP、氯化钙溶液和牛凝血酶混合，即得到细菌纤维素膜。

实施例3

本实施例提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜，包括如下原料：1L BC水凝胶、1L PRP、1L初浓度为10mg/mL的氯化钙溶液和1L初浓度为100U/mL的牛凝血酶。

本实施例还提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：BC水凝胶制备：将木醋杆菌在液体培养基(包括终浓度为20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、15g/L d-甘露醇、2.5g/LNa2HPO4、2g/L柠檬酸和5g/L无水乙醇)内于30℃培养7天后，得到凝胶粗品，将凝胶粗品用0.5mol/L NaOH溶液浸泡后漂洗，即得到BC水凝胶；PRP制备：使用血液成分分离机，采用一次性全封闭管道套件进行患者自体外周血成分单采，即得到PRP；将BC水凝胶、PRP、氯化钙溶液和牛凝血酶混合，即得到细菌纤维素膜。

实施例4

本实施例提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜，包括如下原料：0.9L BC水凝胶、0.9L PRP、1L初浓度为9mg/mL的氯化钙溶液和1L初浓度为90U/mL的牛凝血酶。

本实施例还提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：BC水凝胶制备：将木醋杆菌在液体培养基(包括终浓度为19g/L葡萄糖、4.5g/L蛋白胨、4.5g/L酵母提取物、14.5g/L d-甘露醇、2.4g/LNa2HPO4、1.8g/L柠檬酸和4.5g/L无水乙醇)内于29℃培养7天后，得到凝胶粗品，将凝胶粗品用0.48mol/L NaOH溶液浸泡后漂洗，即得到BC水凝胶；PRP制备：使用血液成分分离机，采用一次性全封闭管道套件进行患者自体外周血成分单采，即得到PRP；将BC水凝胶、PRP、氯化钙溶液和牛凝血酶混合，即得到细菌纤维素膜。

实施例5

本实施例提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜，包括如下原料：1.1L BC水凝胶、1.1L PRP、1L初浓度为11mg/mL的氯化钙溶液和1L初浓度为110U/mL的牛凝血酶。

本实施例还提供了一种皮肤创伤修复的细菌纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：BC水凝胶制备：将木醋杆菌在液体培养基(包括终浓度为20.2g/L葡萄糖、5.5g/L蛋白胨、5.5g/L酵母提取物、15.5g/L d-甘露醇、2.6g/LNa2HPO4、2.1g/L柠檬酸和5.2g/L无水乙醇)内于29℃培养7天后，得到凝胶粗品，将凝胶粗品用0.52mol/L NaOH溶液浸泡后漂洗，即得到BC水凝胶；PRP制备：使用血液成分分离机，采用一次性全封闭管道套件进行患者自体外周血成分单采，即得到PRP；将BC水凝胶、PRP、氯化钙溶液和牛凝血酶混合，即得到细菌纤维素膜。

试验例1

对HaCaT细胞的增殖影响：

实验材料：人永生化表皮细胞(HaCaT细胞)、DMEM、HEPES、PRP、BC水凝胶、胰蛋白酶、胎牛血清、本申请实施例3所制得的细菌纤维素膜、青链霉素双抗、MTT。

实验步骤：(1)HaCaT细胞的培养，用含10wt％FBS的DMEM培养液培养细胞至瓶底被细胞铺满；(2)更换培养液并用PBS漂洗；(3)加入0.25wt％的胰蛋白酶消化液1mL消化至细胞脱壁；(4)加入含10wt％FBS的DMEM培养液5mL中止消化，将细胞吹散成单细胞悬液；(5)将细胞悬液以1000r/min离心力离心5min后用PBS洗涤；(6)再1000r/min离心5min后弃去上清，加入DMEM培养液，1:4传代于培养瓶内。

分别测量PRP、BC水凝胶和本申请实施例3所制得的细菌纤维素膜对HaCaT细胞增值率的影响：

(1)细胞接种：取对数生长期的HaCaT细胞，用0.25wt％的胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，细胞计数调整细胞浓度为1×10

(3)分别培养24h、48h后各取出一个96孔板，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL。

(4)放入培养箱培养4h后终止培养，吸尽上清后每孔加入150μL的DMSO，用酶标仪在490nm波长处测定各孔OD至后取平均值并进行比较，所得结果如图4所示。

根据图4结果所示，本申请实施例3所制得的细菌纤维素膜对HaCaT细胞的增值率的促进明显高于对照组1和对照组2，而实验组、对照组1和对照组2均明显高于空白对照组。

试验例2

选取20只雄性SD大鼠，以每5只一组平均分为四组(实验组、对照组1、对照组2和空白对照组)，在每组大鼠的表皮均开设4cm

表1皮肤紧致度和光滑度测量表

根据表1结果可知，使用本申请实施例3所制得的细菌纤维素膜所恢复的皮肤的紧致度和光滑度均明显高于使用PRP和BC水凝胶的皮肤，三者又明显高于使用生理盐水的自愈的皮肤。

试验例3

案例1：患者女，77岁，糖尿病史20年.2009年右足溃疡导致右足第一、第二趾截趾，2014年8月右足又开始溃破。2015年5月入院，常规换药和抗生素治疗3个月后，创面呈扩大趋势(图1)，每2周直接注射一次PRP，连续注射3次，一月后观察其足部，所得结果如图1所示。

案例2：患者男，60岁，糖尿病史5年。40年前脚底被钉子刺伤，当时未做任何治疗，后期创面经常有渗出，遂自己修剪并外用药物治疗，时好时坏。40年过去，创面增大到拳头大小，渗出多，有异味，肌腱外露。经过彻底清创后，每3周注射一次本发明实施例3中所制得的负载血小板血浆的细菌纤维素膜，连续注射3次，期间治疗过程如图2所示，根据图2结果所示，在注射完成的两月后创面已基本愈合。

案例3：患者，女，39岁，素食。1月15日，患者右手被机器挤伤，手背红肿，活动正常，去当地医院进行抗感染治疗，自觉好转后自动出院。2月15日再次红肿，疼痛并且溃破，溃破处有脓性渗出。创面彻底清创后，使用负压引流治疗，6天后打开，坏死腔隙消失，创面肉芽组织新鲜，立即使用本发明实施例3所制得的负载血小板血浆的细菌纤维素膜治疗，第6天、10天、15天分别打开观察及更换敷料，21天后，创面完全愈合，60天后，创面重新塑形排列，外观好看(图3)。

根据案例2、3和案例1进行对比，使用本发明所制得的负载血小板血浆的细菌纤维素膜进行治疗优于直接注射PRP进行治疗；而通过敷用本发明所制得的负载血小板血浆的细菌纤维素膜其治疗效果优于直接注射的治疗效果。

综上所述：

本发明提供了一种负载血小板血浆的细菌纤维素膜、制备方法及其应用，其中BC水凝胶具有许多优越的物理化学性能，包括高纯度、高结晶度、纳米纤维网状结构、柔软的弹性性质、高保水能力和良好的生物相容性，能够持续性的修复皮肤，从而不需要对皮肤内的药物进行反复换药，减轻了操作难度，并且避免因为频繁换药而对伤者的创伤部位造成二次伤害；而PRP能够在组织内抑制分解代谢酶，招募干细胞和成纤维细胞到损伤部位，从而对损伤部位的皮肤进行修复的同时，还能够加速表皮细胞的生长代谢，以使重新生长好的皮肤的质感更加紧致，而且还能够使皮肤表面的角质层脱落、重新生长，从而使皮肤表面更加光滑；而上述各原料相结合后，BC水凝胶和氯化钙溶液能够为PRP在组织内产生作用提供有益的环境条件，从而使PRP能够更有效的与受体细胞(干细胞、成纤维细胞和表皮细胞等等)和受体酶(分解代谢酶等)相结合，提高PRP的利用率，另外，BC水凝胶和牛凝血酶还能够辅助PRP修复创伤皮肤，从而进一步提高创伤的修复效率，减少修复时间；此外PRP还能够在BC水凝胶内均匀分布，从而使其能均匀作用于创伤部位，使周围的受损皮肤均匀生长，保证其在愈合后的皮肤的长势相近，从而使皮肤整体更加紧致，因此在皮肤经过缝合后，该细菌纤维素膜能避免周边皮肤因为缝合而导致的皮肤紧致性下降以及留疤等造成的皮肤损伤，使皮肤在缝合后仍具备较强的修复能力，从而避免留疤。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。