促进小鼠骨骼肌细胞中ATG13基因表达的miR-542-5p序列及其应用

技术领域

本发明涉及属于分子生物学及医学领域，具体涉及一种促进小鼠骨骼肌细胞中ATG13基因表达的miR-542-5p序列及其应用。

背景技术

ICU-获得性肌无力（ICU-AW）的特点是肢体无力等神经肌肉损伤，是ICU患者常见的神经肌肉并发症，平均发病率为57%左右。ICU-AW的主要临床表现是对称性肢体无力，还有可能引发脱机困难，进而延长患者的ICU住院时间，影响出院后的生活质量等。由于许多患者在危重病5年后仍存在功能下降，因此肌肉萎缩的恢复可能非常缓慢。肌肉功能障碍也发生在包括慢性阻塞性肺病 在内的几种慢性疾病中，导致发病率和死亡率增加。目前国内有关 ICU-AW 危险因素的研究较少，ICU-AW的病因仍不清楚，早期识别并及时干预有助于改善患者愈后及生活质量。

ATG13作为传统的自噬相关基因，主要通过PERK信号传导参与内质网转换，是细胞维持稳态和存活的中心调控因子。自噬作为一种在细胞应激下降解蛋白质和细胞器的明确和自我消化的过程，可以维持细胞的稳态，有利于细胞存活。前期研究表明，ATG13是骨骼肌发育、基础稳态和适应所必需的。胚胎或成人骨骼肌中ATG13的损失导致肌肉质量和力量的损失，线粒体异常、肌质网肿胀、内化细胞核和液泡显着等问题。

MicroRNA(miRNA)是一类内源的、广泛存在于生物体内的长度约为20～24个核苷酸的非编码RNA，参与各类调控，影响生物体发育，在细胞内具有多种重要的调控作用。最近，各类研究表明miRNA在细胞稳态中起关键作用。最近miR-542-3p 和 miR-542-5p被预测为靶向控制蛋白质周转和能量平衡的途径，从而影响肌肉质量和功能的途径。因此miR-542-5p很可能是肌肉萎缩的重要因素。

鉴于ATG13在ICU-AW病理进程中的重要作用，我们拟通过调节miR-542-5p的表达量来调节ATG13蛋白的表达从而实现其在ICU-AW中的应用。这为ICU-AW治疗提供了新的研究思路，对医学具有重要意义。

发明内容

本发明的目的：针对ICU患者常见的神经肌肉并发症的影响，提供一种miR-542-5p药物靶点在骨骼肌损伤疾病中的应用，能够通过调节靶分子ATG13抑制细胞自噬减轻线粒体损伤，从而维持骨骼肌细胞的胞质稳态和正常生理功能。

实现上述目的，本发明的技术方案是：一种促进小鼠骨骼肌细胞中ATG13基因表达的miR-542-5p序列，所述序列为5'-CUCGGGGAUCAUCAUGUCACGA-3 '。

本发明又提供了一种miR-542-5p序列在ICU-AW的应用，包括以下步骤：

步骤一、利用内毒素注射方法建立ICU-AW动物模型，取后肢腓肠肌，提取总RNA，查询和肌肉分化相关的miRNAs，设计引物，利用qPCR技术检测ICU-AW小鼠模型中差异表达显著的miRNAs；

步骤二、利用数据库分析miR-542-5p与ATG7的靶向关系，并通过双荧光素酶验证实验检测；

步骤三、设计miR-542-5p核苷酸，序列为5'-CUCGGGGAUCAUCAUGUCACGA-3 '。

设计miR-542-5p抑制物，序列为：

抑制物：正义链5'-UCGUGACAUGAUGAUCCCCGAG-3'：

步骤四、采用内毒素注射方法建立ICU-AW动物模型，利用纳米微球缓释体系通过腹腔注射miR-542-5抑制物，脱颈处死小鼠后，剥离取出腓肠肌和膈肌，检测miR-542-5p对骨骼肌的影响。

本发明的技术效果在于：miR-542-5p的抑制物能够通过调控ATG13的表达，缓解肢体无力，可以作为治疗肢体无力的药物，对肢体无力有潜在的预防和治疗价值。

miR-542药物靶点在骨骼肌损伤疾病中的应用，能够通过调节靶分子ATG13抑制细胞自噬诱导线粒体损伤，从而维持骨骼肌细胞的胞质稳态和正常生理功能。

附图说明

图1为ICU-AW动物模型中miR-542-5p的表达水平；

图2为miR-542-5p靶蛋白的预测与验证；

图3为miR-542-5p抑制物对小鼠骨骼肌的影响。

具体实施方式

下面将结合附图，对本实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

参见图1~图3，一种促进小鼠骨骼肌细胞中ATG13基因表达的miR-542-5p序列，所述序列为5'-CUCGGGGAUCAUCAUGUCACGA-3 '。

一种miR-542-5p序列在ICU-AW的应用，包括以下步骤：

步骤一、利用内毒素注射方法建立ICU-AW动物模型，取后肢腓肠肌，提取总RNA，查询和肌肉分化相关的miRNAs，设计引物，利用qPCR技术检测ICU-AW小鼠模型中差异表达显著的miRNAs；

步骤二、利用TargetScan等数据库分析miR-542-5p与ATG13的靶向关系，并通过双荧光素酶验证实验检测；

步骤三、采用内毒素注射方法建立ICU-AW动物模型，利用纳米微球缓释体系通过腹腔注射miR-542-5p抑制物，脱颈处死大鼠后，剥离取出腓肠肌，检测miR-542-5p抑制物对骨骼肌的影响。

以下结合附图和实例对本发明进行进一步说明。

本发明中所涉及的试剂及材料若无特殊说明均可通过商业渠道购买。

实施例1:

ICU-AW动物模型中miR-542-5p的表达变化。

(1)采用内毒素注射方法建立 ICU-AW 动物模型，采用健康清洁级Balb/C小鼠，全程在洁净室饲养，培养温度21～25℃。通过腹腔注射4mg/kg内毒素构建 ICU-AW 动物模型。适应性喂养7d后处死小鼠，取小鼠后肢腓肠肌提取细胞总RNA，利用qPCR技术检测miR-542-5p的表达水平。

miRNA的引物序列如下表：

表1为miR-542-5p反转录特异性引物和qPCR引物序列

Real time PCR反应条件为：95℃30s，变性；95℃10s；60℃30s；72℃5s，40个循环。

如图1所示，miR-542-5p在Balb/C ICU-AW动物模型小鼠腓肠肌中表达显著上调，由此可知miR-194-5p能够对小鼠骨骼肌产生影响。

实施例2:

miR-542-5p与ATG13相互关系的分析与验证。

(1)利用TargetScan网站(http://www .targetscan .org/vert_70/)分析miR-542-5p与ATG7之间的相互作用，如图2所示。

(2)构建psiCHECKTM-2-ATG13-3’UTR，psiCHECKTM-2-ATG13-3’ UTR-mut载体，通过双荧光素酶活性验证miR-542-5p与靶蛋白之间的相互作用。按照 Dual-LuciferaseReporter Assay System的使用说明进行荧光检测。转染后48h收取细胞，弃去培养基，用PBS清洗两次，每孔细胞加入50μL 1×PLB(Passive Lysis Buffer)，室温振荡15min，收集细胞裂解液。使用酶标仪检测发光，使用20μL细胞裂解液与100μl的试剂LAR II混匀后可以检测萤火虫荧光值(F)，随后在混合溶液中再加入100μl试剂Stop&Glo@Reagent后可以检测海肾虫荧光值(R)，读取数值后，进行数据分析，萤火虫荧光值为内参，相对荧光素酶活性＝海肾虫荧光值(R)/萤火虫荧光值(F)，如图2所示。

实施例3:

miR-542-5p抑制物对小鼠骨骼肌的影响。

取ICU-AW大鼠后肢腓肠肌后4％多聚甲醛固定24h以上，进行脱水浸蜡，包埋，切片。

然后依次将切片放入二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，90％酒精2min，80％酒精2min，70％酒精2min，蒸馏水洗2min。

石蜡切片苏木素染色液染色5-10分钟，自来水中冲洗去多余的染色液，约10分钟，蒸馏水再洗涤一遍，伊红染色液染色30秒-2分钟，70%乙醇10秒，80%乙醇10秒，90%乙醇10秒，无水乙醇10秒。二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯，再透明5分钟，用中性树胶或其它封片剂封片，显微镜下观察，细胞核呈蓝色，而细胞浆呈粉红色或红色。

图3为ICU-AW大鼠腓肠肌HE染色照片，从图中可以看出对照组腓肠肌形态完好、饱满、排列紧密，ICU-AW组与对照组相比，ICU-AW组肌纤维间间隙增加，肌纤维形态与对照组比较略有不足，肌纤维间空隙较大且不饱满。由此可知经过内毒素注射使小鼠肌肉发生了萎缩，肌纤维形态改变。同时，miR-542-5p抑制组与ICU-AW组组相比，肌纤维形态均略有恢复，肌纤维间排列更为紧密，即可说明miR-542-5p抑制组对ICU-AW具有缓解作用。

结果分析：

本发明首先在动物水平检测了ICU-AW模型小鼠后肢肌肉miR-542-5p的表达，miR-542-5p在Balb/C ICU-AW动物模型小鼠腓肠肌中表达显著上调，由此可知miR-194-5p能够对小鼠骨骼肌产生影响。然后通过网站分析了miR-542-5p与ATG13之间的相互作用，并通过双荧光素酶验证实验进行了验证，如图2所示。转染miR-542-5p模拟物能够抑制腓肠肌细胞中ATG13的表达。如图 3所示为ICU-AW大鼠腓肠肌HE染色照片，从图中可以看出对照组腓肠肌形态完好、饱满、排列紧密，ICU-AW组与对照组相比，ICU-AW组肌纤维间间隙增加，肌纤维形态与对照组比较略有不足，肌纤维间空隙较大且不饱满。由此可知经过内毒素注射使小鼠肌肉发生了萎缩，肌纤维形态改变。同时，miR-542-5p抑制组与ICU-AW组组相比，肌纤维形态均略有恢复，肌纤维间排列更为紧密，即可说明miR-542-5p抑制组对ICU-AW具有缓解作用。

在本发明中，我们从miR-542-5p在参与ICU-AW病理进程的生物学功能入手，筛选得到与 miR-542-5p具有直接相互作用的靶蛋白ATG13，并进一步在动物水平研究了miR-542-5p对骨骼肌发育的影响。通过本发明的研究，明确了miR-542-5p通过靶向ATG13参与调控骨骼肌发育的机理，miR-542的抑制物能够通过调控AGT13的表达，缓解ICU-AW的症状，可以作为治疗ICU-AW的药物，对ICU-AW有潜在的预防和治疗价值。