适用于木薯清液发酵产饲用蛋白的产朊假丝酵母菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一株产朊假丝酵母、菌剂、产朊假丝酵母或菌剂在饲料添加剂中的应用、饲料添加剂及饲料添加剂的制备方法。

背景技术

随着原料价格的不断波动，燃料乙醇企业开始动态调整原料，使用多元化原料生产酒精，从而达到最大的利润化。目前，有部分乙醇生产企业以100％木薯为原料发酵生产酒精。然而，使用100％木薯发酵生产酒精时将会产生大量的木薯清液。木薯清液是酒糟经离心分离后得到的上清液，其中物质不能为酿酒酵母所利用，组成成分复杂，是一种高浓度有机废水，不含重金属元素和有毒物，根据储存条件的不同容易快速发生分解，若直接当做废弃物排放，不仅造成资源上的极大浪费，也对环境产生污染。

在饲料添加剂工业中，产朊假丝酵母(Candida utilis)是一种亟为重要的微生物，常用于生产谷胱甘肽、氨基酸及一些酶。产朊假丝酵母可以利用工业非食用资源及废弃资源增殖发酵，具有较强的将无机氮转化为有机氮的能力，并且生成富含蛋白质、核苷酸、促生长因子、多种酶类及多族维生素类的菌体蛋白；同时能够刺激反刍动物瘤胃生成大量有益微生物，调控其胃肠菌群环境，增强机体免疫力。产朊假丝酵母增殖密度高，可以作为优秀的菌体蛋白饲料单独使用，具有广阔的发展前景。

目前，有些报道研究了利用不同工厂废液培养产朊假丝酵母，但均为实验室研究水平，对于工业化应用借鉴意义较小。有研究者发现将5％产朊假丝酵母接种至白酒糟中可以获得较好的发酵效果，发酵结束后酒糟的粗蛋白含量可达18.28％(不同添加剂对白酒糟发酵饲料营养价值的影响研究，孙亚楠等，2022)。但是，酒糟中已富含蛋白质等多种营养物质，因此该产朊假丝酵母的产粗蛋白能力并不是很高。另外，与酒糟不同，酒糟经过离心分离后的清液中粗蛋白等营养物质含量较低，相比于酒糟，菌株难以利用清液。现有菌株利用酒糟相比清液的发酵效果更佳，并且尚未有研究公开能够高效利用降解木薯清液的产朊假丝酵母。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一株产朊假丝酵母、菌剂、产朊假丝酵母或菌剂在饲料添加剂中的应用、饲料添加剂及饲料添加剂的制备方法。该产朊假丝酵母的蛋白产量高，小肽含量高，氨基酸种类丰富，并且使用该产朊假丝酵母可以利用木薯清液产生菌体蛋白，可以作为高附加值的饲料添加剂，进而实现木薯清液的高值化利用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种产朊假丝酵母(Candida utilis)，该产朊假丝酵母的保藏编号为CGMCC NO.22631。

本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有如前所述的产朊假丝酵母。

本发明第三方面提供如前所述的产朊假丝酵母或如前所述的菌剂在饲料添加剂中的应用。

本发明第四方面提供一种饲料添加剂的制备方法，所述方法包括：将如前所述的产朊假丝酵母或如前所述的菌剂接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。

本发明第五方面提供由如前所述的制备方法制得的饲料添加剂。

本发明第六方面提供如前所述的产朊假丝酵母或如前所述的菌剂在木薯清液处理中的应用。

本发明第七方面提供一种处理木薯清液的方法，所述方法包括：将如前所述的产朊假丝酵母或如前所述的菌剂接种于木薯清液中。

通过上述技术方案，本发明获得的有益效果包括：

1、相较于其他假丝酵母，本发明的产朊假丝酵母的生长速率快，蛋白质产量高，小肽产量高，发酵所需时间短，更适用于工业化生产。

2、相较于其他假丝酵母，本发明的产朊假丝酵母具有较好的利用木薯清液(特别是木薯清液中的低聚糖(麦芽低聚糖、纤维低聚糖)、木糖、甘油和有机酸)的能力，并能够在含有有机酸、甘油的木薯清液中具有较好的生长能力，其能够利用木薯清液产生高达53.47wt.％的粗蛋白，并能够产生高达25.26wt.％的小肽，进而实现对木薯清液的高值利用，并减少环境污染。

3、本发明的产朊假丝酵母产生的蛋白中氨基酸种类丰富，能够满足牛、羊等牲畜的营养需求，因此非常适用于制备饲料添加剂。

生物保藏

本发明的产朊假丝酵母(Candida utilis)于2021年05月28日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.22631，简称CUNX-01。

附图说明

图1是本发明的产朊假丝酵母的400倍光学显微镜下的照片；

图2是实施例3中摇瓶发酵氮源筛选中的以酵母数为响应值的等值线图；

图3是实施例3中不同转速下本发明的产朊假丝酵母的发酵液随发酵时间的OD值变化曲线图；

图4是实施例3中不同溶氧(DO)参数下本发明的产朊假丝酵母的发酵液中酵母数随发酵时间的变化曲线图；

图5是实施例3中不同补料时间点下本发明的产朊假丝酵母的发酵液中酵母数随发酵时间的变化曲线图；

图6是实施例3中不同补料速率下本发明的产朊假丝酵母的发酵液中酵母数随发酵时间的变化曲线图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明中，所述“小肽”，指的是介于氨基酸和高蛋白(大分子蛋白质)之间的一种小分子活性蛋白，也即分子量在1000道尔顿以下。小肽不仅优于氨基酸，而且优于高蛋白(大分子蛋白质)，相较于分子量一般都在一万至几十万道尔顿之间的大分子蛋白质，分子量在1000道尔顿以下的小肽不需要消化可直接吸收。所述小肽的含量检测方法参照国标GB/T 22492-2008《大豆肽粉》中的附录B(肽含量的测定方法)的方法测定。

本发明第一方面提供一种产朊假丝酵母(Candida utilis)，该产朊假丝酵母的保藏编号为CGMCC NO.22631。

本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有如前所述的产朊假丝酵母。

本发明中，所述菌剂的形态可以是本领域常规的菌剂形态，比如可以为固体、液体或半固体形态。

本发明的一些实施方式中，该菌剂含有所述产朊假丝酵母的活菌体。

本发明中，所述菌剂中活菌体的数量可以在较宽的范围内选择，只要满足相关标准的要求即可。

所述菌剂的制备方法可以参照本领域常规的制备方法，在此不再赘述。

本发明第三方面提供如前所述的产朊假丝酵母或如前所述的菌剂在饲料添加剂中的应用。

本发明的一些实施方式中，所述饲料添加剂为畜牧饲料添加剂，优选为反刍动物饲料添加剂和/或单胃动物饲料添加剂。

本发明第四方面提供一种饲料添加剂的制备方法，所述方法包括：将如前所述的产朊假丝酵母或如前所述的菌剂接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。

本发明中，所述产朊假丝酵母或所述菌剂的接种量可以在较宽的范围内选择，例如可以以酵母数为0.05-1亿/mL的终浓度接种。

本发明中，所述发酵培养基可以为本领域中常用的用于产朊假丝酵母发酵的培养基，例如可以为YPD培养基、糖蜜培养基等。本发明的产朊假丝酵母能够利用木薯清液，当接种于木薯清液中时，得到的发酵液中的蛋白质、小肽含量高，并且发酵液中的蛋白质中氨基酸种类丰富，能够满足牲畜的营养需求。因此，本发明的一些实施方式中，本发明的发酵培养基还可以为木薯清液发酵培养基。优选的情况下，所述发酵培养基为木薯清液发酵培养基。

本发明中，所述“糖蜜培养基”指的是含有糖蜜的培养基。除了糖蜜外，所述糖蜜培养基还可以含有其他常用于产朊假丝酵母发酵的培养基的组分，例如氮源和/或无机盐。优选的情况下，所述糖蜜培养基的氮源含量为0-10g/L，无机盐含量为0-10g/L。优选的情况下，所述糖蜜培养基中的氮源硫酸铵和/或尿素；所述糖蜜培养基中的无机盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵中的至少一种。

本发明中，所述“木薯清液发酵培养基”指的是含有木薯清液的培养基。除了木薯清液外，所述木薯清液发酵培养基还可以含有其他常用于产朊假丝酵母发酵的培养基的组分，例如碳源、氮源、无机盐中的至少一种。其中，除非特殊说明，所述碳源、氮源、无机盐均指的是木薯清液发酵培养基中除木薯清液本身含有的碳源、氮源、无机盐之外额外添加的组分。应当理解的是，优选的情况下，所述组分可以进一步提高发酵液中产朊假丝酵母的酵母数、蛋白质含量、小肽含量。

本发明的一些实施方式中，所述木薯清液发酵培养基的pH值为5-7。

本发明的一些实施方式中，所述木薯清液发酵培养基中还含有抑菌剂。其中，对所述抑菌剂的种类没有特别限定，只要不抑制产朊假丝酵母生长即可；所述抑菌剂的添加量为本领域常规技术选择，只要能够抑制杂菌生长即可，例如可以为5-20mg/L。

本发明的一些实施方式中，所述木薯清液发酵培养基含有木薯清液、可选的碳源、可选的氮源、可选的无机盐和抑菌剂。

本发明的一些实施方式中，所述木薯清液发酵培养基的配制方法为：将可选的碳源、可选的氮源、可选的无机盐和抑菌剂溶解于木薯清液中，得到木薯清液发酵培养基。

本发明中，所述木薯清液发酵培养基中碳源的含量可以在较宽的范围内选择，例如可以为0g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g、8g/L、9g/L、10g/L中任意一个值或上述任意两个值组成的范围内的数值。发明人研究发现，当所述木薯清液发酵培养基含有碳源时，所述发酵液中产朊假丝酵母的酵母数能够进一步提高。因此优选的情况下，所述木薯清液发酵培养基中碳源的含量为2-10g/L。

本发明的一些实施方式中，所述木薯清液发酵培养基中的碳源为糖蜜。优选的情况下，所述糖蜜为大豆糖蜜和/或甘蔗糖蜜。进一步优选的，所述糖蜜为大豆糖蜜。

本发明的一些实施方式中，所述木薯清液发酵培养基中氮源的含量可以为0g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g、8g/L、9g/L、10g/L中任意一个值或上述任意两个值组成的范围内的数值。为了进一步提高发酵液中产朊假丝酵母的酵母数，优选的情况下，所述木薯清液发酵培养基中氮源的含量为2-6g/L。

本发明的一些实施方式中，所述木薯清液发酵培养基中的氮源为硫酸铵和/或尿素。优选的情况下，为了进一步提高发酵液中产朊假丝酵母的酵母数、蛋白质含量、小肽含量，所述氮源优选为硫酸铵。

本发明的一些实施方式中，所述木薯清液发酵培养基中无机盐的含量可以在较宽的范围内选择，例如，所述无机盐的含量可以为0g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g、8g/L、9g/L、10g/L中任意一个值或上述任意两个值组成的范围内的数值。

本发明的一些实施方式中，所述木薯清液发酵培养基中的无机盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵中的至少一种。优选的情况下，当所述发酵培养基为木薯清液发酵培养基时，所述无机盐优选为磷酸二氢钾。

本发明中，所述“木薯清液”指的是在木薯发酵生产酒精时，得到的酒糟经离心分离后得到的上清液。

本发明的一些实施方式中，所述木薯清液含有可溶性糖、有机酸、甘油中的至少一种。其中，所述木薯清液中，可溶性糖的含量为15-20g/L，有机酸含量在10-15g/L，甘油含量在5-10g/L。发明人研究发现，当可溶性糖的含量在上述范围内时，产朊假丝酵母生长速率较快。

本发明的一些实施方式中，所述可溶性糖含有单糖，木薯清液中单糖含量为1-3g/L。当单糖的含量在上述范围内时，产朊假丝酵母发酵结束时的数量最多。本发明的一些实施方式中，所述单糖为葡萄糖和/或木糖，其中木薯清液中葡萄糖的含量为0.5-1g/L，木糖的含量为1-2g/L。

本发明的一些实施方式中，所述可溶性糖还含有聚合度为2以上的可溶性糖(也即低聚糖)。其中，木薯清液中所述低聚糖的含量为12-18g/L。优选的情况下，所述低聚糖为麦芽低聚糖和/或纤维低聚糖。本发明中，所述低聚糖指的是聚合度为2以上的可溶性糖。

本发明的一些优选的实施方式中，所述木薯清液中的可溶性糖的含量为15-20g/L。优选的情况下，所述可溶性糖为单糖和低聚糖，所述单糖的含量为1-3g/L，所述低聚糖的含量为12-18g/L。优选的情况下，所述单糖为葡萄糖和木糖，所述木薯清液中葡萄糖的含量为0.5-1g/L，木糖的含量为1-2g/L。优选的情况下，所述低聚糖为麦芽低聚糖和纤维低聚糖。

本发明的一些优选的实施方式中，所述木薯清液发酵培养基含有木薯清液、大豆糖蜜和硫酸铵，并且不含有除硫酸铵外的其他无机盐；优选地，所大豆糖蜜的含量为2-5g/L，所述硫酸铵的含量为5-10g/L。所述木薯清液发酵培养基在该优选范围内时，能够进一步提高发酵液中产朊假丝酵母的酵母数、蛋白质含量、小肽含量。优选的情况下，所述木薯清液发酵培养基的pH值为5-7。

本发明的一些优选的实施方式中，所述木薯清液发酵培养基含有木薯清液、甘蔗糖蜜和可选的硫酸铵，并且不含有除硫酸铵外的其他无机盐；优选地，甘蔗糖蜜的含量为5-10g/L，所述硫酸铵的含量为0-5g/L。进一步优选的情况下，所述木薯清液发酵培养基含有木薯清液和甘蔗糖蜜，并且不含有硫酸铵和无机盐。所述木薯清液发酵培养基在该优选范围内时，能够进一步提高发酵液中产朊假丝酵母的酵母数、蛋白质含量、小肽含量。优选的情况下，所述木薯清液发酵培养基的pH值为5-7。

本发明的一些实施方式中，所述方法包括：所述产朊假丝酵母在接种前先经过活化处理。

本发明中，所述活化处理可以为本领域常规的制备方法，例如可以为一级种子培养、二级种子培养，本领域技术人员可以根据实际情况选择培养方式。优选的情况下，所述种子培养用的培养基为本领域常规选择，例如可以为YPD培养基。

本发明的一些实施方式中，所述活化处理为：(1)将产朊假丝酵母菌株平板单菌落接种至YPD液体培养基中培养获得一级种子液；(2)将一级种子液接种至新的YPD液体培养基中培养获得二级种子液。

本发明的一些实施方式中，步骤(1)中，所述产朊假丝酵母菌株平板单菌落可以直接接种30-50mL的YPD液体培养基中，28-30℃、150-200rpm培养16-20h形成一级种子液，也可以先接种至5-10mL的YPD液体培养基中，28-30℃、150-200rpm培养16-24h后，再按照0.5-1vol.％的接种量接种至新的YPD液体培养基中，28-30℃、150-200rpm培养16-20h，形成一级种子液。

本发明的一些实施方式中，步骤(2)包括：将一级种子液以0.5-1vol.％的接种量接种至新的YPD液体培养基中，28-30℃、150-200rpm培养16-20h形成二级种子液。

本发明的一些优选的实施方式中，所述活化处理为：将产朊假丝酵母菌株平板单菌落先接种至5-10mL的YPD液体培养基中，28-30℃、150-200rpm培养16-24h后，按照0.5-1vol.％的接种量接种至新的YPD液体培养基中，28-30℃、150-200rpm培养16-20h，形成一级种子液；将一级种子液以0.5-1vol.％的接种量接种至新的YPD液体培养基中，28-30℃、150-200rpm培养16-20h形成二级种子液。

本发明的一些实施方式中，所述发酵的条件包括：温度28-30℃，溶氧10-40％，发酵18-24h。优选的情况下，为了进一步提高发酵液中产朊假丝酵母的酵母数、蛋白质含量、小肽含量，所述发酵的条件包括：温度28-30℃，溶氧10-30％，发酵18-24h。可以通过通气量、搅拌(或振荡)控制发酵体系中的溶氧量，为了达到以上溶氧量，通气量、搅拌(或振荡)的速率可以在较宽的范围内选择，例如通气量可以在0.5-10L/min范围内选择，所述搅拌(或振荡)的速率可以在300-900rpm范围内选择。发明人研究发现，当所述搅拌(或振荡)的速率在上述范围内时，能够进一步提高发酵液中产朊假丝酵母的酵母数。进一步优选的，所述搅拌(或振荡)的速率可以在500-900rpm范围内选择。

本发明的一些实施方式中，所述发酵的条件还包括：pH为5-7。其中，所述pH值的控制为本领域常规技术操作，例如可以通过氨水或硫酸溶液进行pH值的控制，在此不再赘述。

本发明的一些实施方式中，所述方法还包括补料，所述补料包括：在发酵过程中流加碳源。

本发明的一些实施方式中，相对于1L初始发酵培养基，所述补料的速率为2-20g/h。发明人研究发现，相对于1L初始发酵培养基，当所述补料的速率为10-20g/h时，能够进一步提高发酵液中产朊假丝酵母的酵母数、蛋白质含量、小肽含量。进一步优选的，相对于1L初始发酵培养基，所述补料的速率为15-20g/h。

发明人研究发现，当在发酵第5-12h进行补料时，能够进一步提高发酵液中产朊假丝酵母的酵母数、蛋白质含量、小肽含量。因此优选的情况下，所述方法还包括：在发酵第5-12h进行补料。进一步优选的，所述方法还包括：在发酵第8-12h进行补料。

本发明的一些实施方式中，所述补料时长为5-10h。

本发明中，所述饲料添加剂的形式可以为固体和/或液体。当所述饲料添加剂的形式为固体时，所述方法还可以包括：将发酵液进行固液分离、低温干燥，所得固体为饲料添加剂。所述固液分离的方式可以为本领域常规的技术选择，例如可以为离心、过滤、旋蒸。所述低温干燥的方式可以为本领域常规的技术选择，只要使得低温干燥后的物料水分含量达到12％(v/v)以下即可，例如可以使用真空低温烘干。

本发明第五方面提供由如前所述的制备方法制得的饲料添加剂。

本发明的一些实施方式中，所述饲料添加剂含有粗蛋白。优选的情况下，以干基计，以所述饲料添加剂的总重量为基准，所述粗蛋白的质量含量为40-55wt.％。进一步优选的，所述粗蛋白中含有小肽，以干基计，以所述饲料添加剂的总重量为基准，所述小肽的质量含量为20-30wt.％。其中，所述粗蛋白的含量检测方法参照国标GB/T 6432-1994《饲料中粗蛋白测定方法》测定，所述小肽的含量检测方法参照国标GB/T 22492-2008《大豆肽粉》中附录B的方法测定。

本发明第六方面提供如前所述的产朊假丝酵母或如前所述的菌剂在木薯清液处理中的应用。

本发明第七方面提供一种处理木薯清液的方法，其特征在于，所述方法包括：将如前所述的产朊假丝酵母或如前所述的菌剂接种于木薯清液中。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。除非特殊说明，以下实施例中所用方法为本领域常规方法，所用试剂、原料均可通过商购获得。

以下实施例中：

粗蛋白含量测定按照国标GB/T 6432-1994《饲料中粗蛋白测定方法》测定。

小肽含量测定按照国标GB/T 22492-2008《大豆肽粉》中附录B方法测定。

木薯清液来自于广西中粮生物质能源有限公司，其中木薯清液中的低聚糖(聚合度为2以上的可溶性糖)的含量在18g/L左右，根据木薯清液的成分分析，低聚糖为麦芽低聚糖和纤维低聚糖；木薯清液中的葡萄糖和木糖的总含量在2g/L左右，其中葡萄糖的含量为0.5g/L，木糖的含量为1.5g/L；甘油含量在9g/L左右；有机酸含量在15g/L左右。以上物质均通过液相柱Aminex HPX–87H(购自安捷伦公司，型号为300x 7.8mm)检测。

大豆糖蜜购自益海嘉里；硫酸铵和磷酸二氢钾购自国药生物；抑菌剂为购自山东安茂康生物技术有限公司的菌肽宝产品。

产朊假丝酵母(CGMCC 2.3047)和热带假丝酵母(CGMCC 2.3967)两株菌均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

YPD培养基：20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉。

YPD固体培养基：20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，20g/L琼脂粉。

麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁1L，2wt.％琼脂。

实施例1

本实施例用于说明产朊假丝酵母CUNX-01菌株的获得。

1、产朊假丝酵母CUNX-01的出发菌株的分离与鉴定

取广西制糖厂糖蜜存放处的泥样2g，用无菌水稀释至100mL得到稀释液，取100uL稀释液涂布于麦芽汁琼脂平板(含1wt‰青链霉素)，置于28-30℃恒温培养箱中培养48h,挑取单克隆经过多轮划线培养，最终分离得到纯化菌株。

对该菌株进行微生物形态鉴定。在YPD固体平板上，菌落呈乳白色，平滑，有光泽，边缘整齐。在YPD液体培养基中28℃培养24h后，静置一段时间后管底有菌体沉渣。

随后，将此菌进行18S rDNA和ITS测序，经测序比对分析，结合形态鉴定，最终确定此菌为产朊假丝酵母菌株，也即出发菌株。

2、产朊假丝酵母CUNX-01菌株的诱变获得

对分离鉴定的产朊假丝酵母菌株(即出发菌株)开展诱变工作，以期提高菌株的生长速率和菌体本身蛋白含量。

1)菌悬液的制备

将产朊假丝酵母甘油菌50uL转接至10mL YPD液体培养基中，200rpm、28-30℃进行过夜活化；吸取1mL过夜活化的菌液至100mL YPD培养基中，培养至对数期时离心洗涤2次，取菌体沉淀至生理盐水中，充分混匀，即制成菌悬液，诱变前用血球计数板在显微镜下直接计数，将其稀释至细胞浓度为10

2)等离子体(ARTP)诱变处理条件摸索

在超净台中将金属载片置于无菌平板中，取10μL菌液均匀涂布于载片上；使用无菌镊子将载片放置于对应孔位，载片处于气流端口2mm处，并关闭舱门。仪器功率120W，气流量10SLM，诱变时间分别设置为0s、10s、20s、30s、40s、50s和60s。样品处理完毕，用无菌镊子将载片放置于1mL生理盐水的EP管中；

将离心管充分震荡1min，以保证载体上微生物充分洗脱下来，形成新的菌液(诱变后的菌液)。

3)稀释涂布平板

未诱变的菌液稀释10

4)正式诱变实验

选择致死率为90％的诱变时间周围选择3个诱变时间(30s,35s,40s)进行诱变，并进行稀释涂布平板。

5)高通量筛选

将平板上菌落直径较大的单菌落转接至96深孔板中，于30℃750rpm培养过夜，测定OD

6)诱变菌株的复筛

以未诱变菌株为对照，和经过5轮ARTP诱变筛选出的菌株分别接种至100mL YPD培养基中，30℃200rpm培养24h,测定菌液OD

经过以上的操作，最终获得一株菌体本身蛋白含量55.97wt.％的菌株，与出发菌株的菌体本身蛋白含量(35wt.％)相比，提高了20.97％。将新获得的菌株进行18S rDNA和ITS测序，经测序比对分析，并结合形态鉴定，最终确定此菌仍属于产朊假丝酵母菌株，将其命名为产朊假丝酵母CUNX-01。此菌株在显微镜下放大400倍观察细胞呈椭圆形，大小为3.5-4.5um×7.0-13.0μm(图1)。

该产朊假丝酵母于2021年05月28日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22631，简称CUNX-01。

实施例2

本实施例用于说明产朊假丝酵母CUNX-01对木薯清液的利用降解能力。

将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的两株假丝酵母——产朊假丝酵母CGMCC 2.3047和热带假丝酵母CGMCC 2.3967，以及本发明的产朊假丝酵母CUNX-01作为试验菌株，三株菌共同开展单纯木薯清液的发酵，比较三株菌对于木薯清液的利用能力。

1、菌株活化

将三株假丝酵母菌株在YPD固体平板上进行划线，30℃恒温培养箱中培养48h；挑取平板上的单克隆至30mL的YPD液体培养基中，30℃200rpm培养18h形成一级种子液；以1vol.％接种至新的YPD液体培养基中，同样条件下培养18h形成二级种子液。

2、木薯清液摇瓶发酵

取300mL木薯清液，添加5ppm抑菌剂，分装至3个250mL锥形瓶中(每个锥形瓶中100mL)，然后将活化后的三株假丝酵母均按酵母数为0.4亿/mL的终浓度分别接种，30℃200rpm培养24h。培养结束后对得到的发酵液进行酵母计数和离心后沉淀粗蛋白的测定，结果如表1所示。

从表1可以看出，产朊假丝酵母CUNX-01在单纯木薯清液中培养24h后，生长最快，酵母数能达到2.30亿/mL；相比之下，热带假丝酵母CGMCC2.3967和产朊假丝酵母CGMCC2.3047酵母数偏低，分别为1.46亿/mL和0.98亿/mL。收集发酵液离心后的酵母沉淀，测定酵母沉淀质量、粗蛋白含量及水分含量(通过快速水分测定仪测定)，计算得到酵母沉淀中粗蛋白的绝干含量。同样产朊假丝酵母CUNX-01的粗蛋白绝干含量最高，为33.69wt.％。

酵母沉淀中粗蛋白的绝干含量＝酵母沉淀的粗蛋白含量/[酵母沉淀质量×(1-酵母沉淀水分含量)]×100％

因此，产朊假丝酵母CUNX-01在利用木薯清液上是具有优势的。

表1三种不同假丝酵母发酵离心沉淀的指标检测

实施例3

本实施例用于说明产朊假丝酵母CUNX-01的木薯清液发酵培养基组成的优化。

1、摇瓶发酵氮源筛选

产朊假丝酵母一般对于无机氮源，如尿素、硫酸铵等，具有较好的利用效果，因此首先以甘蔗糖蜜作为碳源，对于尿素和硫酸铵进行筛选。利用minitab软件的响应面设计，在以下范围内设计培养基组成：100mL木薯清液，甘蔗糖蜜含量为0-10g/L，硫酸铵0-10g/L，尿素0-10g/L，抑菌剂的添加量为5ppm，整体调节pH至5-7。具体培养基组成见表1。按照实施例2中的“1、菌株活化”步骤对产朊假丝酵母CUNX-01进行活化。向制得的培养基中按酵母数为0.4亿/mL终浓度接种活化的产朊假丝酵母CUNX-01，30℃、200rpm发酵24h，开展木薯清液培养产朊假丝酵母的发酵实验，发酵结束后计算酵母数。

实验结果具体见表2。根据表2中的数据利用mintab软件，绘制以酵母数为响应值的等值线图，如图2所示。从图2中可以看出，尿素的添加量几乎不影响发酵结束后的酵母数，而硫酸铵添加量在一定范围内酵母数比较高。

因此，硫酸铵在一定范围内的添加，促进了产朊假丝酵母的生长，判断得出硫酸铵更适用于产朊假丝酵母CUNX-01木薯清液发酵时的氮源。

表2

2、摇瓶发酵碳源筛选

产朊假丝酵母一般可利用廉价的糖蜜作为碳源，因此，根据实际所获取的糖蜜，对于甘蔗糖蜜和大豆糖蜜进行碳源的筛选。由于甘蔗糖蜜和大豆糖蜜分别是甘蔗和大豆加工之后的副产物，除含有大量的多糖和单糖外，还含有其他抑制因子，可能会影响产朊假丝酵母的成长，因此我们需要对于糖蜜的种类和添加量进行优化。

利用minitab软件的响应面设计两组实验，第一组的碳源为甘蔗糖蜜，在以下范围内设计培养基组成：100mL木薯清液，甘蔗糖蜜含量2-10g/L，硫酸铵0-10g/L，磷酸二氢钾0-5g/L，抑菌剂的添加量为5ppm，整体调节pH至5-7，具体培养基组成见表3。第二组的碳源为大豆糖蜜，在以下范围内设计培养基组成：100mL木薯清液，大豆糖蜜含量2-10g/L，硫酸铵0-10g/L，磷酸二氢钾0-5g/L，抑菌剂的添加量为5mg/L，整体调节pH至5-7，具体培养基组成见表4。按照实施例2中的“1、菌株活化”步骤对产朊假丝酵母CUNX-01进行活化，得到二级种子液。向制得的培养基中接种活化的产朊假丝酵母CUNX-01按酵母数为0.4亿/mL终浓度接种产朊假丝酵母CUNX-01的，30℃、200rpm发酵24h，开展木薯清液培养产朊假丝酵母的发酵实验，发酵结束后计算酵母数。

实验结果具体见表3和表4。

表3

表4

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利用表3中数据通过mintab软件进行模型拟合分析，以酵母数为目标进行最大值响应器优化，得出当碳源为甘蔗糖蜜时，木薯清液发酵培养基的配方为木薯清液中添加8g/L甘蔗糖蜜、不添加硫酸铵和磷酸二氢钾时，根据软件模型拟合分析结果，酵母数较高，达到4.06亿/mL。

利用表4数据通过mintab软件进行模型拟合分析，同样，以酵母数为目标进行最大值响应器优化，得出当碳源为大豆糖蜜时，木薯清液发酵培养基的配方为木薯清液中添加2g/L大豆糖蜜、10g/L硫酸铵、并且不添加磷酸二氢钾时，根据软件模型拟合分析结果，酵母数较高，在4.36亿/mL。

3、发酵罐最佳发酵配方及参数优化

根据上述木薯清液发酵培养基配方优化结果配制木薯清液发酵培养基，并进行最高转速、溶氧和补料时间点、补料速率四个参数优化。

木薯清液发酵培养基的配方：0.6L木薯清液，2g/L大豆糖蜜、10g/L硫酸铵、5mg/L抑菌剂。

菌株活化的方法：按照实施例2中的“1、菌株活化”步骤对产朊假丝酵母CUNX-01进行活化。

1)转速优化

为了优化产朊假丝酵母CUNX-01培养中的转速范围，进行以下实验：

将活化后的产朊假丝酵母CUNX-01以酵母数为0.4亿/mL的终浓度分别接种于4个并联的1L发酵罐中(装液量0.6L的木薯清液发酵培养基)，通气量控制在1L/min，发酵温度30℃，发酵pH控制在6左右，4个发酵罐的转速分别设置为300rpm、500rpm、700rpm和900rpm，在4h、8h、12h、14h、20h和22h取样测定OD值和酵母数，培养22h后停止发酵。

对于不同时间点的酵母数统计发现，转速控制在500-900rpm时酵母数较高，其中转速控制在700rpm时OD值最高(图3)且酵母数最高(4.68亿/mL)。因此，发酵罐的转速参数范围优化为500-900rpm。

2)溶氧优化

将活化后的产朊假丝酵母CUNX-01以酵母数为0.4亿/mL的终浓度分别接种于4个并联的1L发酵罐中(装液量0.6L的木薯清液发酵培养基)，通气量控制在1L/min，发酵温度30℃，发酵pH控制在6左右，通过转速在500-900rpm范围内的调节将4个发酵罐的溶氧分别控制在10％、20％、30％和40％左右，在不同时间点取样测定酵母数，培养24h后停止发酵。

对于4个发酵罐的酵母生长曲线进行分析，发现溶氧控制在10％左右时，不同时间点的酵母数相比其他三个溶氧度，一直处于较高水平，发酵终点酵母数可达7.9亿/mL左右(图4)；溶氧参数在20％、30％时，发酵终点的酵母数也较高，分别可达5.5亿/mL、6.9亿/mL。因此，发酵罐的溶氧参数优化为10-30％，最优选为10％。

3)补料时间点优化

将产朊假丝酵母CUNX-01菌株活化后，以酵母数为0.4亿/mL的终浓度分别接种于4个并联的1L发酵罐中(装液量0.6L的木薯清液发酵培养基)，通气量控制在1L/min，发酵温度30℃，发酵pH控制在6左右，控制转速在500-900rpm，控制溶氧为10％左右，4个发酵罐中分别进行不补料、发酵第8h开始补料、发酵第10h开始补料和发酵第12h开始补料，补料速率为10g/L

对于4个发酵罐的酵母生长曲线进行分析，发现在发酵第8-10h开始补料时酵母数在不同时间点一直处于较高水平，其中在发酵第10h时，酵母数在发酵终点酵母数可达11.8亿/mL(图5)。

4)补料速率的优化

将产朊假丝酵母CUNX-01菌株活化后，以酵母数为0.4亿/mL的终浓度分别接种于4个并联的1L发酵罐中(装液量0.6L的木薯清液发酵培养基)，通气量控制在1L/min，发酵温度30℃，发酵pH控制在6左右，控制转速在500-900rpm，控制溶氧为10％左右，在发酵第10h，在4个发酵罐中进行补料，补料时长为8h，补料为大豆糖蜜，向4个发酵罐的补料速率分别为2g/L

对于4个发酵罐的酵母生长曲线进行分析，发现在15g/L

通过发酵参数优化，最终确定发酵罐发酵参数为以酵母数为0.4亿/mL的终浓度接种于发酵罐中，通气量控制在1L/min，发酵温度30℃，发酵pH控制在6左右，转速控制在500-900rpm，溶氧控制在10％左右，为提高酵母数在10h开始补料，补料速率为15g/L

实施例4

本实施例用于说明产朊假丝酵母CUNX-01菌株在木薯清液发酵培养基中的发酵，开展7L发酵罐连续补料发酵

本实施例中，木薯清液发酵培养基的配方为：4L木薯清液，2g/L大豆糖蜜、10g/L硫酸铵、5mg/L抑菌剂。

种子活化：将产朊假丝酵母CUNX-01平板单菌落先经5mLYPD培养基30℃、200rpm、培养18h后，按1vol.％比例接种至100mL锥形瓶(含20mL YPD培养基)，30℃200rpm培养18h后形成一级种子液；一级种子液按1vol.％接种至500mL锥形瓶(含100mL YPD培养基)，30℃200rpm培养18h后形成二级种子液。

7L发酵罐发酵：二级种子液以酵母数为0.4亿/mL的终浓度接种于7L发酵罐(装液量为4L木薯清液发酵培养基)，发酵24h，发酵条件为：通气量控制在0.6L/min，发酵温度30℃，发酵pH控制在6左右，转速控制在500-900rpm、溶氧控制在10％左右，在发酵第10h开始补料(大豆糖蜜)，补料速率为15g/L

发酵24h后，测定发酵液中酵母数量，经测定酵母数可达22亿/mL。离心收集固形物即菌体蛋白沉淀，将菌体蛋白沉淀经真空低温烘箱烘干得到的物质为菌体蛋白干粉，测定菌体蛋白干粉的质量、水分含量(通过快速水分测定仪测定)、粗蛋白含量和小肽含量，按照以下公式计算得出菌体蛋白的绝干收率并计算得到菌体蛋白干粉中粗蛋白的绝干含量、菌体蛋白干粉中小肽的绝干含量。

菌体蛋白的绝干收率＝菌体蛋白干粉质量×(1-菌体蛋白干粉水分含量)/发酵液体积

菌体蛋白干粉中粗蛋白的绝干含量＝菌体蛋白干粉的粗蛋白含量/[菌体蛋白干粉质量×(1-菌体蛋白干粉水分含量)]×100％

菌体蛋白干粉中小肽的绝干含量＝菌体蛋白干粉的小肽含量/[菌体蛋白干粉质量×(1-菌体蛋白干粉水分含量)]×100％

实验结果如表5所示。从表5可以看出，发酵结束后，菌体蛋白绝干收率为40.4g/L发酵液，菌体蛋白干粉的粗蛋白绝干含量为53.47wt.％，小肽绝干含量为25.39wt.％，其粗蛋白高于专利ZL 201310327937.5中的指标(专利ZL 201310327937.5中粗蛋白51wt.％)，其小肽含量比ZL 201310327937.5中的酸溶蛋白(小肽+氨基酸)指标要高(6wt.％)。

表5

对于菌体蛋白干粉进行氨基酸分析(参照国标GB/T 22492-2008《大豆肽粉》中附录B记载的“游离氨基酸含量的测定”中的方法测定氨基酸的种类以及各氨基酸的质量)，发现氨基酸种类较丰富，包括17种氨基酸(表6)，以赖氨酸含量为100％折算氨基酸相对比例(表6)，发现菌体蛋白干粉适用于牛、鸡和羊等动物的营养需求。

表6

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以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。