一株高溶铁克什米尔小陌生菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体地说，是一株高溶铁克什米尔小陌生菌及其应用。

背景技术

铁是植物生长发育所必须的微量营养元素。我国广泛分布的石灰性土壤中，高浓度的重碳酸盐严重降低了土壤中铁的有效性，导致植物缺铁而引起叶片失绿黄化，严重影响植物生长发育、作物产量和品质。通过外源添加有益微生物来提高土壤铁的有效性是缓解石灰性土壤植物缺铁胁迫的有效途径之一；但现有技术中存在溶铁效果不明显的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一株高溶铁克什米尔小陌生菌及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一株高溶铁克什米尔小陌生菌，所述菌株为克什米尔小陌生菌(Advenella kashmirensis)B1，于2022年12月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0：M20221908，保藏地址：中国武汉。

本发明还提供如下技术方案：一种克什米尔小陌生菌(Advenella kashmirensis)B1在促进石灰性土壤种植的番茄生长和铁吸收中的应用。

本申请再进一步的技术方案：所述克什米尔小陌生菌(Advenella kashmirensis)B1提高石灰性土壤种植番茄的干重、全铁积累量和叶片活性铁含量。

本申请再进一步的技术方案：所述克什米尔小陌生菌(Advenella kashmirensis)B1的接种浓度为1×10

本发明还提供如下技术方案：一种AMF菌剂与克什米尔小陌生菌(Advenellakashmirensis)B1协同作用在促进番茄生长和铁吸收中的应用。

本申请再进一步的技术方案：所述AMF菌剂与克什米尔小陌生菌(Advenellakashmirensis)B1协同作用提高番茄的干重、全铁积累量和新叶活性铁含量，所述克什米尔小陌生菌(Advenella kashmirensis)B1的接种浓度为1×10

本发明还提供如下技术方案：一种木霉孢子悬液与克什米尔小陌生菌(Advenellakashmirensis)B1协同作用在促进番茄生长和铁吸收中的应用。

本申请再进一步的技术方案：所述克什米尔小陌生菌(Advenella kashmirensis)B1的接种浓度为1×10

本发明还提供如下技术方案：一种木霉孢子悬液与克什米尔小陌生菌(Advenellakashmirensis)B1协同作用在促进花生的生长和铁吸收中的应用。

本申请再进一步的技术方案：所述克什米尔小陌生菌(Advenella kashmirensis)B1的接种浓度为1×10

采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明通过本发明提供的克什米尔小陌生菌接种到在限铁的无菌培养基中生长的番茄根系上时，能够促进番茄的生长和铁吸收，解决了现有技术溶铁效果不明显的问题。此外，克什米尔小陌生菌还能够与AMF协同作用提高番茄的生长和铁吸收、克什米尔小陌生菌与木霉协同作用能够促进番茄生长和铁吸收；克什米尔小陌生菌与木霉协同作用能够促进花生的生长和铁吸收。

附图说明

图1为不同根际细菌对番茄地上部总干重的影响；

图2为不同根际细菌对番茄根干重的影响；

图3为不同根际细菌对番茄全铁累积量的影响；

图4为不同根际细菌对番茄叶片活性铁含量的影响；

图5为实施例2中溶铁细菌对番茄的生长影响；

图6为实施例4中溶铁细菌与AMF协同作用对番茄生长的影响；

图7为实施例4中溶铁细菌与AMF协同作用对番茄单株干重、新叶活性铁含量和单株全铁累积量的影响；

图8为实施例5中溶铁细菌与木霉协同作用对番茄生长的影响；

图9为实施例6中溶铁细菌与木霉协同作用对花生地上部生长的影响；

图10为实施例6中溶铁细菌与木霉协同作用对花生根系生长的影响；

图11为实施例3中B1、B2、B4和B5对番茄生长的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围，下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

在本实施例中，通过测定117株番茄根际细菌的生长曲线、限铁和富铁条件下的生长能力和产铁载体能力，初步筛选得到30株生长能力强、具有高效产铁载体能力的根际细菌(如表1)。

TSB液体培养基的制备：蛋白胨15g L

限铁MKB培养基的制备：磷酸氢二钾2.5g L

富铁MKB培养基的制备：限铁MKB培养基中加50μmol L

CAS检测液(Schwyn and Neilands,1987)的制备：

溶液A：1mM氯化铁储备液：0.2703g六水合氯化铁溶于1L 10mM盐酸中。溶液B：CAS储备液：0.2421g CAS(铬天青，Chrome azurol sulphonate)溶于200mL去离子水中。溶液C：HTDMA溶液(十六烷基三甲基溴化铵)：称取0.0219g HTDMA溶于50mL水中。溶液D：哌嗪缓冲液：称取4.3079g无水哌嗪溶于30mL水中，用盐酸调pH至5.6。

制备方法包括：取1.5mL溶液A加入7.5mL溶液B混匀，边搅拌边加入50mL溶液C，再加入30mL溶液D，最后加入去离子水11mL，最终配成100mL CAS检测液。

表1筛选得到的29株根际细菌

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实施例2

请参阅图1－图5，在本实施例中，通过番茄半封闭系统对限铁条件下对促进番茄生长和铁吸收的溶铁细菌进行筛选。筛选的步骤包括：

S1半封闭系统建立：配制限铁MSR培养基，3g/L植物凝胶，调pH至7.5，定量50mL倒入90mm厚培养皿中，培养基凝固后表面涂过量Fe(OH)

S2番茄种子的表面消毒：将提前用去离子水浸泡12h的红矮生番茄种子用75％酒精浸泡1min，无菌水漂洗3次，2％次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗5遍。

S3催芽：将消毒好的无菌番茄种子均匀地平铺在1/2MS培养基中(含蔗糖)，于暗处培养3—5d。

S4移苗：待种子萌发后转移至含1/2MS(不含蔗糖)培养基的组培瓶中，待番茄2片子叶完全长开后转移至半封闭系统。番茄地上部于光照下培养，根系在暗处生长。

S5接菌：番茄生长一周左右出现明显缺铁黄化现象后分别接种30株筛选出的根际细菌(终浓度为10

S6收苗：生长10—15d后收获。

在S1半封闭系统建立中，配制限铁MSR培养基包括以下步骤：

溶液1中大量元素a包括MgSO

溶液2硝酸钙为Ca(NO

溶液3维生素包括泛酸钙0.18g/500mL、维生素B1 0.01g/500mL、维生素B60.01g/500mL、烟酸0.20g/L以及内消旋肌醇5.00g/500mL。

溶液4微量元素中，先将MnSO

上述溶液1－溶液4中，除溶液3维生素(每管5或10mL溶液)冷冻保存(-20℃)外，其余的全部保存在4℃冰箱内。

MSR培养基制备方法包括：每升培养基中加入10mL溶液1、10mL溶液2、1mL溶液4，5mL溶液3、10g蔗糖以及植物凝胶3g/L，pH为5.5，经高压121℃灭菌15分钟后得到MSR培养基。

在S3催芽中，1/2MS培养基中各原料的分量如表2所示：

表2 1/2MS培养基原料表

结论：对收获的番茄植株干重、全铁和活性铁含量指标进行测量对比，由图1-4中的数据可筛选到2株能够促进番茄生长和铁吸收的溶铁细菌，分别是Advenellakashmirensis(B1)和Arthrobacter cupressi(B2)。图5可知添加有B1和B2的培养基中番茄植株的根系和叶片均比CK组的要茂盛。

实施例3

在本实施例中，对实施例2筛选出的两株细菌在番茄盆栽试验中进行验证。

供试土壤：兰州石灰性土壤：石英砂(3:1)混合，辐照灭菌。

供试菌株：前期通过半封闭系统筛选得到的2株根际细菌Advenellakashmirensis(B1)和Arthrobacter cupressi(B2)，以及参与半封闭系统筛选的2株根际细菌Variovorax guangxiensis(B4)和Enterobacter ludwigii(B5)。

番茄育苗：番茄种子提前浸泡12h后经表面消毒后于灭菌滤纸上催芽，挑选萌发的幼芽点播于灭菌基质的育苗盘中，待番茄幼苗长至3片真叶，挑选长势一致的幼苗移栽到装有石灰性土壤和石英砂的花盆中。

接菌：一周后分别接种2株根际细菌(终浓度为10

表3B1、B2、B4和B5对番茄植株生物量和铁含量的影响

结论：由表3和图11可知，在石灰性土壤的生长环境中，接菌有B1和B2的番茄植株，能够提升番茄植株的生物量和铁含量，且进一步验证了有B1和B2具有稳定的溶铁效果。

实施例4

将实施例3验证的溶铁细菌B1和B2分别与AMF协同作用提高番茄生长和铁吸收。

供试土壤和番茄育苗同实施例3；

供试AMF菌剂为Ri(Rhizoshagu irregularis)，菌剂来源及孢子纯化方法：柠檬酸钠缓冲液溶解离体根纯培养的Ri孢子凝胶，真空抽滤，无菌水将孢子冲洗下来后血球计数器计数并稀释得到纯净的Ri孢子悬液。

接菌处理：Ri处理：移栽时以500个孢子/mL的接种量接1mL Ri孢子液到番茄根系。Ri+细菌处理：待Ri定殖20d后，接种细菌悬液(终浓度为1×10

结论：由图7中的数据可得，B1与AMF协同作用以及B2与AMF协同作用能够分别促进番茄生长和铁吸收。

实施例5

将实施例3验证的溶铁细菌B1和B2分别与木霉协同作用提高番茄生长和铁吸收。

供试土壤和番茄育苗同实施例3；

接菌处理：番茄移栽一周后接种细菌悬液(终浓度为1×10

表4B1和B2分别与木霉协同作用对番茄生长和铁吸收的影响

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结论：由表4和图8可知同时接种细菌悬液与木霉孢子悬液能够促进番茄生长和铁吸收。

实施例6

将实施例3验证的溶铁细菌B1和B2与木霉协同作用提高花生生长和铁吸收

供试土壤和番茄育苗同实施例3；

接菌处理：花生移栽一周后接种细菌悬液(终浓度为1×10

表5B1和B2分别与木霉协同作用对花生生长和铁吸收的影响

结论：由表5和图9－图10可知分别同时接种B1或B2与木霉孢子悬液能够促进花生的生长和铁吸收。

以上示意性地对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性地设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。