一种羧基微球偶联氨基的方法

技术领域

本发明涉及一种羧基微球偶联氨基的方法，属于体外诊断试剂盒领域。

背景技术

体外诊断，即IVD(In Vitro Diagnosis)，是指在人体之外，通过对人体样本(血液、体液、组织等)进行检测而获取临床诊断信息，进而判断疾病或机体功能的产品和服务。体外诊断行业与检验医学构成了既相互区别又相互紧密联系的有机整体。体外诊断行业是检验医学的“工具”和“兵器”，同时检验医学是体外诊断行业的“用户”和“市场”，两者的共同目的是实施体外诊断。临床诊断信息的80％左右来自体外诊断，而其费用占医疗费用不到20％。体外诊断已经成为人类疾病预防、诊断、治疗日益重要的组成部分。

体外诊断目前主要的方法有酶联免疫法、胶乳比浊法、化学发光法、流式荧光法及分子诊断等方法。胶乳比浊法、化学发光法、流式荧光法中涉及用到微球标记蛋白。微球标记蛋白(抗原或抗体或亲和素)的方法主要是吸附法和共价偶联法，目的是将待测物质相对应的抗体或抗原包被在微球上，通过待测物质与包被了相应抗原抗体的微球反应后的特性进行检测提高试验的敏感性。共价偶联法中常用的微球表面偶联有功能基团--羧基。目前羧基微球偶联氨基的通用方法有两种：一是以碳二亚胺(EDC)为交联剂的一步法，二是以碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为交联剂的两步法。

一步法的原理是：EDC首先与羧基反应形成中间产物，中间产物与氨基反应，然后脱去中间产物，实现羧基与氨基的偶联。该方法的缺点是EDC试剂对水敏感，要求现用现配，且中间产物在水溶液中极不稳定，易水解，导致偶联效率偏低，整个反应不可控，终产物除了目的产物外，可能还会有大量的多个蛋白自连产物，这样不仅浪费蛋白，还大大降低了反应效率。

两步法的原理是：EDC首先与羧基反应，然后与NHS反应形成中间产物，中间产物与氨基反应，然后脱去中间产物，实现羧基与氨基的偶联。两步法的中间产物相对于一步法的中间产物在水溶液中的稳定性略强，但随着反应的进行，形成的副产物会抑制羧基在偶联蛋白上的定位，导致偶联效率降低。同时EDC对pH值敏感，活化羧基的最适pH值在3.5-4.5，但是活化羧基后形成的中间产物与氨基偶联的最适pH在4.5-7.5，在实际应用过程中，这种操作比较繁琐，影响反应效率。另外EDC可与磷酸基团发生反应，所以在EDC参与的反应过程中不能使用磷酸缓冲液，但是磷酸缓冲液是在本领域内常用的、易配制且价廉的缓冲液。因此，现有技术中的一步法和二步法均由于使用EDC作为交联剂，导致反应条件受到诸多限制，操作条件的苛刻与操作步骤的繁琐进一步导致了目前的羧基微球偶联氨基方法成本高、偶联效率低。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种新的、成本低、操作简便的羧基微球偶联氨基的方法。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的羧基微球偶联氨基的方法的技术方案如下：

本发明使用4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉四氟硼酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉六氟磷酸盐作为交联剂。

4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉四氟硼酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉六氟磷酸盐是一种在溶液或者固相肽合成中活化羧酸的试剂，但至今未见其应用于羧基微球标记蛋白领域。

优选的，所述偶联方法包括如下步骤：

a)将羧基微球与待偶联的蛋白按照质量比1：0.01-50混匀于偶联缓冲液中；所述羧基微球与偶联缓冲液的质量体积比(w/v)为0.1％-1％；按照与微球所含羧基的摩尔比1:1-10加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉四氟硼酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉六氟磷酸盐，振荡混匀；

b)将步骤a)中混匀的混合物离心后弃上清，加入含BSA 0.1％-10％的Tris封闭缓冲溶液重悬浮，再离心，弃上清；前述步骤重复1-2次；

c)加入BSA 0.1％-10％的Tris封闭缓冲液重悬浮，振荡，离心，弃上清，再加入含BSA0.1％-10％的缓冲溶液重悬浮。

优选的，所述偶联缓冲液包括2-吗啉代乙磺酸、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸或N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸，浓度为10-200mM，pH值为4.5-9.0。

进一步的，所述Tris缓冲液的pH值为6.5-9.0。

更优选的，所述步骤a)中，羧基微球与待偶联的蛋白按照质量比为1：0.02-10，所述羧基微球与偶联缓冲液的质量体积比(w/v)为0.2％-0.5％；按照与微球所含羧基的摩尔比1：1-5加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉四氟硼酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉六氟磷酸盐。

更优选的，所述步骤a)中，羧基微球与待偶联的蛋白按照质量比为1：0.05；按照与微球所含羧基的摩尔比1：1加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉四氟硼酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉六氟磷酸盐。

作为一种优选的实施方式，步骤a)和步骤c)所述的振荡，其时间为1-24小时。

作为一种优选的实施方式，步骤a)和步骤c)中震荡时间优选为2-4小时。

步骤a)中时间短于4小时时，时间越短偶联效率越差；当偶联时间大于4小时时，偶联时间对偶联效率影响不大，故一般选择4小时。步骤c)中震荡时间大于4小时封闭会更好一点，但能够在一定程度上降低本底，但效果很有限。

优选的，所述羧基微球为羧基胶乳微球或羧基磁性微球，微球直径为50nm-9000nm。

本发明还公开了一种交联剂的应用，所述交联剂用于羧基偶联微球的方法中。

上述交联剂，即4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉四氟硼酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉六氟磷酸盐在羧基微球偶联氨基中的应用。

与现有技术相比，本发明使用4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉四氟硼酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉六氟磷酸盐为交联剂，使表面偶联有羧基的微球与氨基实现了高效偶联，整个过程操作简便，反应条件温和不苛刻，缓冲液的pH值在4.5-9.0范围内均可，偶联效率高，试剂用量少。

本发明提供了上述交联剂的新应用，首次将其应用于羧基微球偶联氨基技术领域，将本发明偶联氨基后的微球应用于胶乳比浊法、化学发光法、流式荧光法进行蛋白的检测，检测结果表明，不仅主要性能指标达到了要求，而且降低了试剂用量，节省了成本，简化了操作，具有较好的市场应用前景和经济价值。本发明的羧基微球偶联氨基的方法操作简便，即可实现羧基微球与氨基的高效偶联，克服了现有技术的一步法和两步法操作繁琐的缺点；且反应条件温和，可采用磷酸盐缓冲液，且对其pH值要求宽泛，磷酸盐缓冲液pH值4.5-9.0均可实现高效偶联，克服了现有技术中不能使用磷酸盐缓冲液、且对缓冲液的pH值要求范围过窄的不足。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的羧基微球偶联氨基的方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。实施例中所用的羧基胶乳微球购自日本JSR公司，羧基磁性微球购自德国默克公司，磁性分离器购自北京倍爱康公司，实施例中所述的交联剂均为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉四氟硼酸盐购自麦克林公司。生物素标记的TSH抗体购自罗氏公司。

实施例1羧基胶乳微球标记CRP抗体(C-反应蛋白)

在反应管中分别加入MES缓冲液(pH6.0)1mL、145nm羧基胶乳微球(JSR公司，羧基含量为0.104meq/g)5mg、CRP抗体0.25mg，混匀；加入交联剂144μg(0.104μmol)，室温振荡反应2小时；18000rpm/min离心30分钟，弃上清；加入含BSA 0.1％-10％的Tris封闭缓冲溶液(pH值为6.5)重悬浮；离心，弃上清；重复上述离心弃上清步骤；加入含2％BSA的Tris缓冲液(pH值为6.5)重悬浮，室温振荡2小时；离心，弃上清；加入含2％BSA的Tris缓冲液(pH值为6.5)重悬浮。

使用上述制备的试剂测定CRP校准品线性范围：取5个不同浓度的CRP校准品160mg/L、40mg/L、20mg/L、5mg/L、0mg/L，进行定标。以波长570nm为测定波长，检测管中加入CRP测定试剂盒中的试剂R1(10mmol/L Tris缓冲液)，100ul，37℃反应90秒。分别取不同浓度的校准品2ul加入上述检测管中混匀，加入按本发明制备的标记了CRP抗体的羧基微球(R2)，测定反应第50-80秒、第4-5分钟的吸光度值(A1、A2)，计算吸光度的差值ΔA＝A2-A1。将各校准管的吸光度差值ΔA作为纵坐标，对应的浓度作为横坐标，制作“浓度-吸光度差值”校准曲线。线性相关分析表明，在0-160mg/L范围内，相关系数R

重复性评估：采用同一批次试剂R1和R2对靶值为10mg/L的样品进行10次重复测定，代入校准曲线计算CRP浓度，计算变异系数CV(＜6％)，测定结果见表1。

表1重复性评估结果表

批间差评估：对三批试剂R2对靶值为10mg/L的样品进行测定，每批试剂测定3次，批间差小于15％。测定结果见表2。结果说明，将本实施例制备的标记了CRP抗体的羧基微球应用于胶乳比浊法检测CRP，检测结果准确，重复性好，达到了采用一步法或二步法将羧基胶乳微球与CRP抗体偶联后应用于胶乳比浊法检测CRP的效果。然而相对于现有技术，本发明的偶联羧基胶乳微球与氨基的方法操作简便，过程可控，反应条件温和不苛刻，大大降低了操作难度和繁琐程度。

表2批间差评估结果

批间差＝(最大值-最小值)/总平均值*100％

实施例2羧基磁性微球标记链霉亲和素

在反应管中分别加入HEPES缓冲液(pH8.5)1mL、羧基磁性微球(Merck公司，羧基含量为0.0156meq/g)1mg、链霉亲和素50ug，混匀；加入交联剂44μg(0.156μmol)室温振荡反应过夜；磁性分离，去上清；加入含2％BSA的Tris缓冲液(pH值为9.0)重悬浮；磁性分离，去上清；重复上述离心、弃上清、重悬步骤；加入含2％BSA的Tris缓冲液(pH值为9.0)重悬浮，室温振荡2小时；磁性分离，去上清；加入含2％BSA的Tris缓冲液(pH值为9.0)重悬浮，备用。

使用上述方法标记的磁珠(M1)与商品化的磁珠(M2)，应用双抗体夹心法检测TSH标准品的线性范围，试验步骤如下：

在反应管中分别加入生物素标记的TSH抗体50μL、碱性磷酸酶标记的TSH抗体50μL、人血清样本30μL或TSH标准品，混匀；37℃反应20分钟；加入300μL洗液清洗，清洗5次；加入本实施例制得的链霉亲和素标记的磁微粒50μL；37℃反应15分钟；加入300μL洗液清洗，清洗5次；加入化学发光底物液200μL；化学发光检测仪检测发光强度RLU值。TSH标准品的浓度及对应的发光值见下表：

表3TSH标准品线性范围检测结果

对TSH标准品浓度与发光强度RLU值做线性回归图，得TSH标准品浓度与相应发光值间的相关系数，M1的相关系数R2＝0.9983，M2的相关系数R2＝0.9995，两者线性关系良好，无差异。

商品化的磁珠M2与本发明标记的磁珠M1的成本对比见表4。由表4可以看出，M2(Thermo公司)售价约为每毫克160元人民币，其它公司相同产品的售价也基本在160元左右。本发明使用的羧基磁珠购自德国Merck公司，链霉亲和素购自Roche公司，交联剂购自Thermo公司，按本发明的方法得到的M1折合人民币约为每毫克10.51元，每毫克成本上比M2降低约149.49元，成本降幅达93.4％。

表4 M1与M2的每毫克成本对比(元)

实施例3对比盐酸盐和四氟硼酸盐对微球偶联效果的影响

同一个微球使用不同的盐进行活化偶联同一种抗体，除使用的盐不同外其他条件完全相同。并使用PE标记的二抗进行孵育，孵育后使用流式细胞仪检测荧光信号。选择市售的3组微球进行检测。对比检测结果如下表5所示。

表5盐酸盐和四氟硼酸盐对微球偶联效果的影响对比表

由于荧光信号和微球偶联效率成正比。如表5可以看出，通过三种微球(表中三种球为三个厂家购买的羧基微球：微球1为新纵科；微球2为为度；微球3为Bangs。)可以验证出偶联效率提高的普遍性，并且可以看出与盐酸盐偶联的微球相比，四氟硼酸盐偶联效率提高60.2％。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。