一种川陈皮素-四面体框架核酸复合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种川陈皮素-四面体框架核酸复合物及其制备方法和用途。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是全身慢性免疫紊乱性疾病，类风湿性关节炎全球发病率较高，特征是关节疼痛、肿胀、僵硬和骨组织和软骨组织破坏，严重者甚至丧失行动能力，造成患者的生活质量严重下降，患者寿命缩短；具体病理特征为对称性的多关节炎，以双手、腕、肘、膝、踝和足关节受累最常见。同时患者可伴有发热、贫血、皮下结节、血管炎、心包炎及淋巴结肿大等关节外表现，血清中可有多种自身抗体，未经正确治疗的类风湿关节炎可反复的发作，迁延多年，最终导致晚期手指、碗、肘、膝、踝等关节变形及功能丧失，手X线片见骨质疏松、关节面破坏及关节腔狭窄。类风湿性关节炎的病理改变主要表现为关节的滑膜炎，随着病情的进展，以后可波及到关节软骨、骨组织、关节韧带、肌腱以及浆膜、心、肺和眼等结缔组织。关节受累表现为滑膜炎症、渗出、细胞增殖、肉芽肿形成，当累及软骨和骨质时造成软骨及骨组织破坏出现关节畸形，最后导致关节强直及功能障碍。

类风湿性关节炎的发病早期由于感染等等原因，T细胞、B细胞激活，产生如类风湿性因子、抗瓜氨酸蛋白抗体等，刺激关节滑膜中的巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β等炎症因子，再刺激激活关节滑膜中的滑膜细胞异常增殖，侵袭性增强，滑膜细胞分泌趋化因子、炎症因子、金属蛋白酶，一方面造成关节损伤，另一方面这些炎症因子又再次刺激免疫系统，引发级联反应，加剧病变。滑膜是位于关节腔和纤维囊之间的膜性组织，可分为两层：滑膜衬里层和滑膜衬里下层。滑膜衬里层是由巨噬样细胞和成纤维细胞样滑膜细胞两种，特征各异的细胞构成；衬里下层是由疏松结缔组织基质构成，类风湿性关节炎的关键病理过程以滑膜细胞增生为特征，细胞层数通常超过5层；滑膜内层增生、肥厚及侵袭性增加。由于异常的成纤维样滑膜细胞在类风湿性关节炎发病进程中特点类似肿瘤细胞，故抑制异常活化的滑膜细胞的增殖迁移非常重要。

川陈皮素(Nobiletin)是一种聚甲氧基黄酮，是一种RORs激动剂、碳水化合物代谢促进剂，已被证明具有抗炎和抗癌特性，包括抗血管生成，抗增殖，抗转移和诱导细胞凋亡、以及增强生物钟振幅的效果。文献《川陈皮素抑制IL--21IL--21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究》公开了川陈皮素可用于治疗类风湿性关节(苏州大学博士学位论文，刘中兵，2020年)。但是，川陈皮素不溶于水和乙醚，生物利用率低，血浆稳定性差，不具备对组织或细胞的靶向能力，穿透细胞膜的能力极差，难以直接应用体内，实验所需有效药物浓度较高，更难以靶向针对滑膜的调控并应用于治疗类风湿性关节炎。如果能解决上述川陈皮素存在的问题，对于临床治疗类风湿性关节炎有望提供一种新的选择。

四面体框架核酸(tetrahedral framework nucleic acids,tFNAs)又称DNA四面体(tetrahedral DNA，TDN)、四面体DNA纳米结构，它由4条单链DNA通过链间碱基互补配对形成，形态类似四面体。这种纳米结构合成效率高，合成步骤简单，具有良好的生物安全性和生物相容性。DNA四面体框架核酸已是一种研究较为深入的纳米材料，结构具有许多优点，包括可忽略的免疫原性，天然生物相容性，结构稳定性和无与伦比的可编程性，这是有效药物载体的先决条件。同时研究表明DNA四面体具有一定的生物活性，如具有抗炎作用等。因此DNA四面体有望成为一种重要的药物载体。

但是由于DNA四面体的结构特殊，且具有一定活性，因此DNA四面体载小分子药物后两者相互作用如何，是发挥协同作用还是拮抗作用，这是未知的，不同小分子药物效果可能会出现较大的不同。目前尚未见DNA四面体载川陈皮素，DNA四面体能否成功载川陈皮素，使其发挥更好的效果需要进一步研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种川陈皮素-四面体框架核酸复合物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种川陈皮素-四面体框架核酸复合物，它是由DNA四面体框架核酸和川陈皮素混合后形成的复合物。

进一步地，所述复合物中DNA四面体框架核酸和川陈皮素的摩尔比为1:10～1:200。

进一步地，所述复合物中DNA四面体框架核酸和川陈皮素的摩尔比为1:80。

进一步地，所述DNA四面体框架核酸由四条DNA单链自组装合成；所述四条DNA单链的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、和SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述DNA四面体框架核酸的合成方法包括以下步骤：将四条DNA单链加入到TM缓冲液中，95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得。

进一步地，所述四条DNA单链为等摩尔比的四条DNA单链。

本发明还提供了一种制备前述的川陈皮素-四面体框架核酸复合物的方法，它包括如下步骤：

将DNA四面体框架核酸和川陈皮素加入溶剂中混合反应后超滤，即得；

优选地，DNA四面体框架核酸和川陈皮素的摩尔比为1:10～1:200；

更优选地，所述DNA四面体框架核酸和川陈皮素的摩尔比为1:80。

进一步地，所述溶剂为TM缓冲液；

和/或，所述反应的温度为4℃；

和/或，所述反应的时间为8～10h；

和/或，所述超滤的条件为4℃，10000r/min；

和/或，所述超滤使用30KDa超滤管超滤。

本发明还提供了前述的川陈皮素-四面体框架核酸复合物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的用途；

优选地，所述药物为抑制滑膜细胞增殖、迁移的药物。

本发明还提供了前述的川陈皮素-四面体框架核酸复合物在制备骨修复材料中的用途；

优选地，所述骨修复材料为缓解骨的缺损破坏，恢复骨质量，促进骨重建的材料。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明川陈皮素-四面体框架核酸复合物可以减少异常滑膜细胞的增殖迁移，促进凋亡，抑制炎症因子的释放，减轻类风湿性关节炎多因素多细胞导致的组织损伤；

2、本发明川陈皮素和四面体框架核酸结合后，水溶性增强，载药体系相比于单纯的单体药物穿膜能力、组织渗透性增强，具有优异的稳定性、生物利用度和药物缓释作用；

3、本发明复合物首次提出针对异常的肿瘤样类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的凋亡抑制特性，提高了川陈皮素对于促进侵袭性异常增加的滑膜细胞的凋亡的效率，同样浓度的川陈皮素经过DNA四面体的搭载和运输后促进滑膜细胞凋亡的作用效果有显著改善。

总之，本发明成功将川陈皮素和四面体框架核酸复合，制备得到川陈皮素-四面体框架核酸复合物，该复合物对川陈皮素的包封率和载药率好，具有良好的药物释放速度，可以实现药物缓释，同时生物相容性好，无溶血现象。此外本发明复合物能够很好的被滑膜细胞摄取，可有效抑制滑膜细胞的增殖和迁移，对治疗类风湿性关节炎效果优异。本发明复合物还可以用于缓解骨的缺损破坏，恢复骨质量，促进骨重建，对于骨修复有良好的效果。本发明复合物与游离药物的使用相比，效果更好，促进了川陈皮素应用和发展。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为川陈皮素-四面体框架核酸复合物tFNA-Nob的合成示意图。

图2为游离川陈皮素和本发明制备的tFNA-Nob的水溶性示意图。

图3为tFNAs的合成结果：a为毛细管电泳模拟胶图成像，从左到右分别表示DNAMarker、S1、S2、S3、S4四条单链和合成的tFNAs在毛细管电泳卡夹中的移动情况；b为20-1000bp Marker、S1、S2、S3、S4和tFNAs在毛细管电泳卡夹中移动后对应峰值出现的相对时间关系。

图4为PAGE凝胶电泳成像结果，从左到右显示DNA marker、合成tFNAs所需四条ssDNA条带S1、S1+2、S1+2+3、tFNA、tFNA-Nob的相对位置关系。

图5为tFNA和tFNA-Nob复合物的TEM图像。

图6为tFNA和tFNA-Nob(图中为tFNA+Nob)复合物的粒径。

图7为tFNA和tFNA-Nob复合物的Zeta电位，左图为tFNA的Zeta电位，右图为tFNA-Nob复合物的Zeta电位。

图8为tFNAs和Nob不同摩尔比制备的tFNA-Nob复合物的包封率和载药率。

图9为tFNA-Nob复合物的药物释放实验结果。

图10为tFNA-Nob复合物的体外溶血实验结果。

图11为tFNAs-Cy5进入两种滑膜细胞RA-HFLS、RSC-364的12小时后的共聚焦显微镜成像结果。

图12为两种滑膜细胞RA-HFLS、RSC-364与tFNAs-Cy5或S1-Cy5孵育12小时后，Cy5被细胞摄取的荧光信号流式细胞术检测结果。

图13为tFNA-Nob调节RA-HFLS和RSC-364的生物学行为：a为tFNA-Nob对RA-HFLS增殖的影响；b为tFNA-Nob对RA-HFLS垂直迁移的影响；c为tFNA-Nob对RA-HFLS水平迁移的影响；d为tFNA-Nob对RSC-364增殖的影响；e为tFNA-Nob对RSC-364垂直迁移的影响；f为tFNA-Nob对RSC-364水平迁移的影响；g为流式细胞术检测tFNA-Nob对RA-HFLS细胞凋亡的影响及统计分析；h为流式细胞术检测tFNA-Nob对RSC-364细胞凋亡的影响及统计分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns：不显著。

图14为tFNA-Nob对滑膜细胞凋亡蛋白表达的影响：a为tFNA-Nob对RA-HFLS中Bax蛋白表达的影响(标尺：30μm)；b为tFNA-Nob对RA-HFLS的Bcl-2蛋白表达的影响(标尺：30μm)；c为tFNA-Nob对RA-HFLS中Bax和Bcl-2蛋白的Western blot分析(n＝3)；d为tFNA-Nob对RA-HFLS的p85和p65蛋白进行蛋白质印迹分析(n＝3)；e为tFNA Nob对RSC-364Bax蛋白表达的影响(标尺：30μm)；f为tFNA-Nob对RSC-364的Bcl-2蛋白表达的影响(标尺：30μm)；g为通过tFNA Nob对RSC-364的Bax和Bcl-2蛋白进行Western blot分析(n＝3)；h为tFNA-Nob对RSC-364的Pi3Kp85和NF-κBp65蛋白的Western blot分析(n＝3)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns：不显著。

图15为CIA大鼠的建模及治疗大体观：a为空白对照组大鼠、CIA大鼠、tFNAs治疗组、Nob治疗组、tFNA-Nob治疗组大鼠踝关节大体关节肿胀情况；b为红外线热成像拍摄空白对照组大鼠、CIA大鼠、tFNAs治疗组、Nob治疗组、tFNA-Nob治疗组踝关节温度及肿胀情况；c为记录空白对照组大鼠、CIA大鼠、tFNAs治疗组、Nob治疗组、tFNA-Nob治疗组从建模成功至治疗结束的关节炎评分平均数。

图16为Micro CT重建踝关节骨：空白对照组大鼠、CIA大鼠、tFNAs治疗组、Nob治疗组、tFNA-Nob治疗组大鼠踝关节横截面破坏情况及骨密度、骨形态的三维重建成像，统计分析踝关节骨体积分数BV/TV，n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图17为tFNA-Nob复合物对于CIA大鼠骨关节破骨细胞的影响：TRAP染色，TRAP阳性细胞为破骨细胞，呈现红色，标尺分别为100μm、50μm；对各组同区域视野中破骨细胞数目进行统计分析，n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图18为tFNA-Nob复合物对于CIA大鼠骨和软骨的影响：番红O染色，红色区域为软骨及软骨膜，蓝绿色区域为骨组织，标尺分别为200μm、100μm。根据OARSI评分系统进行软骨关节病理组织分数统计分析，n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图19为tFNA-Nob复合物对于CIA大鼠骨和软骨的影响：甲苯胺蓝染色，其中软骨、成骨细胞呈紫蓝色，标尺分别为100μm、50μm。

图20为tFNA-Nob复合物对于CIA大鼠关节滑膜组织凋亡的影响：TUNEL染色法，显示凋亡细胞及滑膜组织，绿色荧光代表凋亡细胞，蓝色荧光代表细胞核，标尺为100μm，对应三维重建凋亡细胞总量示意图。

图21为HE染色展现关节骨面和滑膜组织、周围纤维结缔组织的基本结构。

图22为Masson染色结果：其中纤维结构呈红色。

图23为tFNA-Nob复合物对于CIA大鼠滑膜炎症的影响：a为对炎症蛋白IL-1β分泌的影响；b为对炎症蛋白TNF-α分泌的影响。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。川陈皮素(Nob)粉末于MCE购买(HY-N0155)，为淡黄色晶体，按照说明溶解在DMSO中形成10mM储备液，并分装保存在-60℃下，检测波长为330nm。储备液在将单纯Nob做为实验组的时候使用对应的培养基进行稀释，保证了细胞培养体系里的DMSO含量低于1％，不影响常规的体外实验。

实施例1、本发明川陈皮素-四面体框架核酸复合物的制备

川陈皮素-四面体框架核酸复合物tFNA-Nob的合成示意图如图1。

1、DNA四面体框架核酸(tFNAs)的合成及表征

DNA四面体框架核酸(tFNAs)是由独特设计的四条DNA单链(S1，S2，S3，S4)通过一个PCR程序(95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上)自组装合成的。具体制备方法如下：

四条DNA单链S1、S2、S3和S4(具体序列如表1所示)按照等摩尔比溶解于TM缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM MgCl

表1.本发明四条DNA单链的具体序列

2、川陈皮素-四面体框架核酸复合物(tFNA-Nob)的合成

将DNA四面体框架核酸(tFNAs)和川陈皮素(Nob)在4℃条件下振荡8小时得到复合药物体系，具体合成方法如下：

将上述制备得到的tFNAs以及川陈皮素(Nob)溶液加入到TM缓冲液中混合，使得溶液中tFNAs和Nob的摩尔比为1:80，其中tFNAs浓度为200nM，Nob浓度为16μM。将含tFNAs和Nob溶液在4℃条件下超声剧烈振荡8小时，通过使用30KDa超滤管(4℃，10000r/min)超滤10分钟后，游离的分子量较小的Nob透过超滤管聚集于外液，本发明川陈皮素-四面体框架核酸复合物(tFNA-Nob)存在于内液。

如图2所示：在TM buffer中，游离的川陈皮素经过超声振荡8小时仍然不能溶解，可见沉淀物，说明游离川陈皮素水溶性差；而上述制备的tFNA-Nob经过低温超声振荡8小时，沉淀物消失，溶解于水中，说明tFNA-Nob水溶性显著增强。

3、材料表征

使用透射电镜(TEM)和8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来验证药物的成功合成，使用动态光散射法研究tFNA和tFNA-Nob复合物的zeta电位和平均粒径大小。

图3a显示毛细管电泳模拟胶图成像，从左到右分别表示DNA Marker、S1、S2、S3、S4四条单链和合成的tFNAs在毛细管电泳卡夹中的移动情况。图3b从下到上展现20-1000bpMarker、S1、S2、S3、S4、tFNAs在毛细管电泳卡夹中移动后对应峰值出现的相对时间关系。

图4为PAGE凝胶电泳成像结果，从左到右显示DNA marker、合成tFNAs所需四条ssDNA条带S1、S1+2、S1+2+3、tFNA、tFNA-Nob的相对位置关系，表示合成的四面体框架核酸和复合物分子量更大，在电泳中运动更缓慢。

图5为tFNA-Nob复合物的形态：透射电镜对负染后对载体tFNAs和tFNA-Nob的尺寸及形态成像，载体tFNAs表现为边界清晰三角形，而tFNA-Nob复合物体积变大并呈圆形。

图6为tFNA-Nob复合物粒径：粒径仪检测载体tFNAs的粒径约为6.3nm，tFNA-Nob的粒径约为24.9nm。

图7为tFNA-Nob复合物的Zeta电位：Zeta电位结果显示载体tFNAs纳米材料的平均电荷约为-6.6mV±0.5mV，与DNA带负电荷一致。tFNA-Nob复合物的平均电荷约为-0.2mV±0.1mV，Zeta电位绝对值变小，复合物更为稳定。

上述结果说明本发明成功合成tFNA和tFNA-Nob复合物，并且tFNA-Nob复合物稳定性好。

以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。

试验例1、本发明川陈皮素-四面体框架核酸复合物配比的筛选

1、实验方法

采用实施例1所述方法制备川陈皮素-四面体框架核酸复合物，仅改变溶液中tFNAs和Nob的摩尔比，摩尔比分别为1:10、1:20、1:40、1:80、1:120、1:160、1:200，溶液中tFNAs浓度均为200nM。制备陈皮素-四面体框架核酸复合物时，超滤后检测内外液紫外吸光度，可计算包封率和载药率，计算公式如下：

包封率＝(总Nob-游离Nob)/总Nob×100％

载药率＝(总Nob-游离Nob)/总tFNAs×100％

2、实验结果

图8为tFNAs和Nob分别在不同摩尔比下制备得到的tFNAs-Nob的载药率和包封率。由图8可知：在恒定载体tFNAs浓度下，随着Nob的浓度增加，tFNA-Nob载药体系的包封率逐渐缓慢减低，当tFNAs和Nob摩尔比为1:120时达到平衡；载药率则随着Nob的浓度增加而逐渐增加，在tFNAs和Nob摩尔比为1:80后趋近饱和。综合考虑，本发明制备tFNA-Nob载药体系的时，tFNAs和Nob最优摩尔比为1:80，此时tFNA-Nob包封率为57.9％，载药率为63.4％。

试验例2、药物缓释实验和体外溶血实验

1、实验方法

1.1药物缓释实验

分别将定量浓度为16μM的Nob剧烈震荡于PBS中和按照实施例1所述方案以tFNAs和Nob摩尔比为1:80制备tFNA-Nob，各取5mL的游离Nob与PBS混合液和tFNA-Nob放入25KDa的透析袋内，同时将包含两种不同混合液体的透析袋放置并浸泡于50mL离心管内，在离心管和透析袋之间添加含量为1％的吐温80的PBS溶液直至达到50mL的总体积量，从而构成透析体系。然后于37℃恒温培养箱中轻柔摇动模拟体内温度环境共计36小时，每2小时定量取出2mL离心管中的透析液体以测量吸光度，从而计算透过透析袋中的Nob药物量，并使用含1％吐温80的PBS溶液补偿由于测定需要被取出的透析体系。计算药物释放效率公式为各时间点释放的Nob量(浓度×体积)/总Nob量(浓度×体积)×100％)。

1.2体外溶血实验

取无杂质的大鼠眼球血加入到无EDTA的采血管中，低温静置30分钟，高速离心并去除上清液，反复至离心后上清液不再出现红色为止，将完全离心后的血液分别等量加入到各EP管中，再分别分组加入生理盐水组为阴性对照(不溶血)，加入无酶水为阳性对照(溶血)，再分别加入实验样品。观察实验样品的溶血情况，加入样品后血液混合溶液出现红色即样品发生溶血。

2、实验结果

图9为tFNA-Nob系统药物释放实验中紫外分光光度计测定并计算比较透析体系中游离Nob和tFNA-Nob在36小时内的释放情况，由图9可知tFNA-Nob复合物对Nob的释放具有缓释作用，且总时间段内内释放总量更多。tFNA-Nob复合物有利于药物缓释，并提高药物利用率。

图10为体外溶血实验结果，从左往右依次为阳性对照、阴性对照、浓度为10μM的游离Nob(Nob

试验例3、成纤维样滑膜细胞对tFNA纳米载体的摄取

使用Cy5荧光标记后的S1单链(S1-Cy5)，按照本发明实施例1所述方法制备tFNAs-Cy5，将Cy5荧光标记的tFNAs与细胞孵育，通过免疫荧光检测荧光信号与细胞的关系，得到tFNAs位于细胞胞质内的结果，流式细胞术检测入胞的效率。

1、实验方法

(1)滑膜细胞的培养：在本试验例中，大鼠滑膜细胞系RSC-364为一种常见的滑膜细胞系，人类类风湿性关节炎滑膜细胞RA-HFLS为人源提取的原代细胞，两种不同来源但特性相似的滑膜细胞共同做为实验靶细胞，目的在于综合探讨并验证tFNA-Nob复合物优化Nob的药理作用和对关节滑膜病变密切相关的人源原代病理滑膜细胞、鼠源滑膜细胞系的调控。实验所用的完全培养基为高糖的基础培养基(DMEM)、10％胎牛血清(FBS)、1％抗生素溶液混合而成，细胞消化过程均使用EDTA含量为0.02％的0.25％胰蛋白酶溶液处理约30秒-1分钟。培养环境为5％CO

(2)共聚焦显微镜荧光成像：两种滑膜细胞培养及细胞消化方式同上。在无菌无毒的超净台环境下，于12孔板内放入直径为20mm的细胞爬片，在爬片上接种约5×10

(3)流式细胞术检测入胞率：将RSC-364和RA-HFLS细胞用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化1分钟，再加入新培养基液体轻柔吹打使细胞脱落。所得细胞悬液混合计数，接种于六孔板中形成约1.2×10

2、实验结果

图11为tFNAs-Cy5进入两种滑膜细胞RA-HFLS、RSC-364的12小时后的共聚焦显微镜成像结果，共聚焦显微镜成像显示tFNAs-Cy5在细胞内的含量和定位(标尺为30μm，tFNAs-Cy5显示红色荧光，细胞骨架如图显示绿色荧光，细胞核如图显示蓝色荧光)。图12为两种滑膜细胞RA-HFLS、RSC-364与tFNAs-Cy5或S1-Cy5(ssDNA)孵育12小时后，Cy5被细胞摄取的荧光信号流式细胞术检测结果。

由图11和图12结果可知tFNAs能够被滑膜细胞很好的摄取，tFNA可大量进入滑膜细胞。

试验例4、tFNA-Nob复合物对滑膜细胞生物学行为的影响

1、实验方法

成纤维样滑膜细胞异常增殖和侵袭性增强都对类风湿性关节炎有明显影响。对人源类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞RA-HFLS和大鼠RSC-364滑膜细胞系建模后，采用实施例1制备的tFNA-Nob复合物进行给药，然后进行CCK-8、水平划痕实验、垂直迁移transwell实验检测。具体实验方法如下：

(1)CCK-8实验

本实验使用CCK-8初步探究不同浓度的tFNAs做为载体，对人源类风湿性关节炎滑膜细胞RA-HFLS和大鼠滑膜细胞系RSC-364异常增殖活动的生物学行为是否有调控效果。同时还证实与滑膜细胞细胞孵育时tFNAs的生物相容性。首先按照文献方法构建体外模型：①对于RSC-364，通过加入10ng/mL的IL-1β共同培养24小时；②对于RA-HFLS，加入10ng/mL的TNF-α共同培养24小时，两种方法下诱导滑膜细胞被病理环境激活以构建类风湿性关节炎细胞体外模型。通过CCK-8检测判断建模是否成功，建模成功的标志为细胞经统计分析其增殖能力明显强于正常滑膜细胞。

将RA-HFLS和RSC-364分别设置5组进行对照试验，包括空白对照组无处理1组、诱导病理环境建模4组，以5×10

(2)垂直迁移实验

利用滤膜孔径8.0μm、直径为6.5mm的Transwell小室进行对滑膜细胞垂直向迁移的检测，Transwell小室为有聚碳酸酯膜滤膜存在的悬置在24孔板培养孔的特殊结构，Transwell小室接种的细胞可经过室内、室外的培养孔内培养基液体成分不同和诱导因素不同，跨越8.0μm孔径的滤膜到达培养板的培养孔底部并常规贴壁生长，计数在培养孔内的细胞量可反映垂直迁移情况。

本实验中制备两种滑膜细胞细胞悬液，取100μL接种到小室内的滤膜上使得室内细胞密度约为2×10

(3)水平迁移实验

细胞划痕实验可直观展现细胞水平迁移能力。同样对两种滑膜细胞都分为5组：空白对照组无处理1组、诱导病理环境建模4组，均约接种5×10

2、实验结果

实验结果如图13所示，结果表明tFNA-Nob复合物可以有效降低药物浓度的同时促进异常增殖的类肿瘤样类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡，从而抵抗其侵袭性和滑膜增生。实验结果说明同样的川陈皮素药物浓度下，经过tFNA搭载后的载药体系对于两种细胞建模后异常增殖和垂直、水平迁移都有更强的抑制效果。进而说明tFNA-Nob复合物可以治疗类风湿性关节炎，且治疗效果优于游离川陈皮素。

试验例5、tFNA-Nob复合物对凋亡的调控和机制探究实验

1、实验方法

通过免疫荧光和Western blot对实施例1制备的tFNA-Nob复合物调控建模后的人源类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞RA-HFLS和大鼠RSC-364滑膜细胞系的凋亡蛋白表达，在炎症因子建模刺激两种滑膜细胞异常增殖后，与药物组孵育培养。

(1)免疫荧光

使用放置于6孔板的细胞爬片，加入对滑膜细胞悬液共约接种1.2×10

(2)Western Blot

(2.1)细胞裂解：按照试验例4的建模和加药处理两种接种于6孔板的滑膜细胞后，IP细胞裂解液(P0013/P0013J)裂解贴壁细胞，收集的蛋白样品中加入蛋白上样缓冲液，高温100℃加热5分钟致蛋白充分变性，冷却并可于-60℃保存。

(2.2)电泳

采用SDS-PAGE试剂盒以制备对应蛋白的电泳中所需浓度凝胶，按照组别对加样孔加蛋白样本，在电泳缓冲液体系内，恒定电压60-90V跑胶约90-120分钟后取出凝胶。

(2.3)转膜及封闭

甲醇活化PVDF膜(6.6×8.5cm,0.2μm)后，用Western转膜液浸润转膜槽和覆盖凝胶的PVDF膜，恒流180mA 10min进行转膜。转膜后的蛋白膜于Western洗涤液中洗涤去除转膜液，然后用QuickBlock Western封闭液，在常温下封闭约10分钟，用TBST清洗3次。

(2.4)免疫反应

PVDF蛋白膜浸泡在目的蛋白的一抗工作溶液中，4℃下孵育过夜，室温复温1小时，TBST清洗后加入对应二抗，室温孵育1小时并清洗，最后将PVDF膜浸泡在显影液中曝光采图，以获得目的蛋白及内参蛋白的条带，注意此步骤中清洗使用TBST并建议于摇床上轻柔进行。

2、实验结果

结果如图14所示显示，与同等浓度的川陈皮素单独药物组相比，tFNA-Nob复合物促进了两种不同滑膜细胞中Bax蛋白的表达，并抑制了Bcl-2蛋白的表达。通过Westernblot探索机制发现载药体系或可通过抗pi3k p85/AKT轴调节其对下游凋亡蛋白的释放，抑制NF-κB p65信号通路从而抑制炎症相关蛋白的表达。

试验例6、体内实验

1、实验动物

Wister大鼠，雄性，6-8周龄。

2、实验方法

使用匀浆机对于等体积的牛Ⅱ型胶原和弗氏不完全佐剂进行混合匀浆，形成乳化剂，然后对6-8周大小的雄性Wister大鼠尾根部注射乳化剂。注射方法：初次免疫(0day)：在第0天注射200μl乳化剂(胶原+不完全佐剂)/只；加强免疫(7day)：在第7天注射100μl乳化剂(胶原+不完全佐剂)/只。初次免疫后2-3周后发病，3周发病率在80-100％。初次免疫2周后筛选建模成功大鼠开始给药，每隔一天给药一次，一共给药6次，即给药周期为建模成功后12天，然后建模成功后第14天处死大鼠并取样。药物组分别为生理盐水组、tFNA组(实施例1制备)、Nob组(游离Nob)、tFNA-Nob组(实施例1制备)。tFNA组、Nob组、tFNA-Nob组溶剂为生理盐水，tFNA组中tFNA的浓度为500nM，Nob组中Nob的浓度为40μM，tFNA-Nob组中tFNA的浓度为500nM、Nob的浓度为40μM。给药方式为注射给药，注射部位为大鼠双侧踝关节处。给药体体积均为200μl。

建模至给药期拍摄大体图片及热成像记录，药物处理6次后，颈椎脱臼法处死。取踝关节样本处理行Micro CT、病理切片染色。

Micro CT检测踝关节骨破坏及治疗效果。

HE染色、甲苯胺蓝染色、TRAP染色等观察踝关节组织中炎症细胞数量形态、组织治疗情况、滑膜组织厚度。

免疫荧光检测滑膜组织凋亡细胞数目、滑膜厚度、炎症相关蛋白表达。

2、实验结果

实验结果如图15～23。图16可知：相比较同样浓度的Nob治疗组，tFNA-Nob组干预后可以较大程度地缓解骨的缺损破坏、恢复骨质骨量。图17可知tFNA-Nob明显拮抗免疫炎症反应下活化的破骨细胞，促进骨重建的正向调控。图18可知tFNA-Nob明显降低了CIA大鼠异常的OARSI分数，对于软骨病理破坏的恢复效果有显著提升。图19可知tFNA-Nob组在所有治疗组中获得了最佳治疗效果，最大程度恢复关节的骨破坏。图20可知tFNA-Nob组促进滑膜组织凋亡细胞占比增多。图21可知：tFNA-Nob组明显抑制了滑膜的增生和缓解骨表面的破坏。图22可知tFNA-Nob组明显抑制了关节受到胶原诱导免疫后的纤维化程度。图23可知tFNA-Nob组对于关节滑膜的炎症蛋白IL-1β、TNF-α的分泌在所有治疗组中具有最强的抑制作用。

本发明提供了一种tFNA-Nob复合物，首次针对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞这一类肿瘤样的病理细胞异常增殖迁移、凋亡抑制的特性，验证了tFNA-Nob复合物在体外抑制病理细胞增殖和迁移的能力优于相同浓度的单独的Nob药物组，提高了药物水溶性和穿透细胞膜的能力、组织渗透能力，通过抑制pi3K/AKT通路，抑制NF-κB信号轴，促进促凋亡蛋白Bax、caspase-3的表达，抑制抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进滑膜细胞凋亡。

本发明四面体框架核酸(tFNAs)可以与川陈皮素结合形成稳定的复合物。不仅可以避免体内聚集产生细胞毒性，提高川陈皮素水溶性，还可快速高效地转运至滑膜细胞内和动物组织中。体内体外实验均证明tFNAs能提高川陈皮素在体内的生物利用度，并携带更多Nob进入异常的病理滑膜成纤维细胞，发挥药物的抗肿瘤、抗成血管、抗炎、促凋亡的作用，并协同保护关节炎损伤的骨组织和软骨组织、纤维组织。

本发明的tFNA-Nob复合物经验证具有药物缓释作用，即tFNA可以做为载体维持嵌插入碱基中的川陈皮素小分子的缓慢释放。并通过溶血实验证明复合物的生物安全性高。

本发明的tFNA-Nob复合物不仅具有传递药物的功能，还具有在关节炎中协同保护受损关节骨、软骨及软组织的作用。

本发明的tFNA-Nob复合物可以有效降低药物剂量，抗pi3k p85/AKT轴调节其对下游凋亡蛋白的释放，抑制NF-κB p65信号通路，有效促进类肿瘤样异常类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡，抵抗其异常增殖能力、异常侵袭性，对于类风湿性关节炎的防治、肿瘤相关治疗有积极的意义。

总之，本发明成功将川陈皮素和四面体框架核酸复合，制备得到川陈皮素-四面体框架核酸复合物，该复合物对川陈皮素的包封率和载药率好，具有良好的药物释放速度，可以实现药物缓释，同时生物相容性好，无溶血现象。此外本发明复合物能够很好的被滑膜细胞摄取，可有效抑制滑膜细胞的增殖和迁移，对治疗类风湿性关节炎效果优异。本发明复合物还可以用于缓解骨的缺损破坏，恢复骨质量，促进骨重建，对于骨修复有良好的效果。本发明复合物与游离药物的使用相比，效果更好，促进了川陈皮素应用和发展。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一种川陈皮素-四面体框架核酸复合物及其制备方法和用途

<130> GYKH1118-2022P0115216CC

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

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