一种利用米曲霉制备苔色酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物化学技术领域，具体涉及一种利用米曲霉制备苔色酸的方法。

背景技术

苔色酸(2,4-二羟基-6-甲基苯甲酸)为一种二羟基苯甲酸衍生物，以其为结构骨架的化合物具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化和抗糖尿病等生物活性，在临床药物开发方面具有潜在的应用价值。

目前，苔色酸已实现从草本植物、地衣、细菌和真菌中分离鉴定。但目前商业化的苔色酸还仅是通过化学合成的方式进行生产，售价高约1000元/100mg，并且制备方法还存在收率低、不稳定及合成工艺复杂等问题，严重制约了其在医药领域中的应用。因此需要发明一种新的制备方法来克服苔色酸现有制备技术的不足。

发明内容

本发明的目的是为了解决商业化的苔色酸售价高，以及传统的苔色酸制备方法存在纯度低、收率低及合成工艺复杂的问题，而提供一种利用米曲霉制备苔色酸的方法，成功获得可高效生产苔色酸的米曲霉菌株(苔色酸产量约0.34g/1kg)。

一种利用米曲霉制备苔色酸的方法，按以下步骤进行：

步骤S1：表达质粒pRA-herA的构建；

以猴头菇的基因组DNA为模板，以P1F为正向引物、P1R为反向引物，扩增获得苔色酸合酶编码基因herA的片段一，然后以P2F为正向引物、P2R为反向引物，苔色酸合酶编码基因herA的片段一为模板，扩增获得苔色酸合酶编码基因herA的片段二；以pRA质粒经KpnI酶切线性化处理的片段为载体，将苔色酸合酶编码基因herA的片段一和片段二插入到pRA质粒中，获得表达质粒pRA-herA；

引物P1F的序列为ccgGAATTCGAGCTCGGTACCATGTCCTCCATCGCGGATACG，引物P1R的序列为TTTATCGCGATCATGCCGGTCGTCTCCACGGCG；引物P2F的序列为ACCGGCATGATCGCGATAAACCAGGGCTC，引物P2R的序列为tactacaGATCCCCGGGTACCTCAAGCAGCAAGGCTCTCGAGG；

步骤S2：高产苔色酸菌株的获得；

取米曲霉的孢子保存液接入DPY培养基中，振荡培养2～3天，获得米曲霉菌丝体；然后加入细胞壁溶解液，温和振荡2～3小时，获得原生质体；向原生质体内加入缓冲液II和缓冲液III，再加入表达质粒pRA-herA，混匀后冰浴10～20min，向混合体系加入缓冲液III，室温孵育10～20min，然后加入缓冲液II，混匀后离心10～20min，除去上清液后加入缓冲液II，混匀后转移到改良的察氏培养基平板上，然后加入覆盖培养基，倒置培养3～7天；待含有pRA-herA转化子长出菌丝后，利用PCR方法对其验证，对获得的阳性转化子进行2次继代培养后，获得携带有苔色酸合成酶基因的高产菌株；

每200mL缓冲液II由1.2M山梨糖醇、50mM氯化钙溶液、50mM氯化钠溶液和10mM氨基丁三醇组成，且pH调至7.5；每200mL缓冲液III由质量百分含量为40％聚乙二醇-4000、50mM氯化钙溶液和50mM氨基丁三醇组成；所述的改良的察氏培养基按以下步骤制备：每200mL改良的察氏培养基含有7.0g察氏培养基、9.3g NaCl、1.8g(NH

步骤S3：苔色酸的制备；

将高产苔色酸菌株的菌丝接种于灭菌后的大米培养基中，对培养好的菌体进行萃取、浓缩，获得发酵液浸膏；将发酵液浸膏通过硅胶分离、高效液相色谱仪制备，得到苔色酸。

一种利用米曲霉制备苔色酸的方法获得的表达质粒pRA-herA，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

本发明的有益效果：

第一，本发明以米曲霉为宿主，能够提供丰富的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A原料来合成苔色酸；第二，本发明所用的表达质粒pRA-herA上携带pAmyB淀粉酶启动子，以大米为培养基时可以高效驱动苔色酸合酶编码基因herA的高效表达；第三，本发明高产菌株A.oryzae/pRA-herA以大米培为培养基，成本低廉、操作简单、培养周期短、分离纯化简单易行。

本发明非常适合大规模发酵生产，突破传统分离的资源限制，通过采用上述培养基及培养条件进行发酵，对发酵产物的分离，提取以及各种波谱鉴定，米曲霉异源表达株可以大量生产苔色酸，产量超过340mg/1Kg大米，能够有效解决苔色酸的来源问题，可为含有苔色酸骨架结构的天然产物以及相关医药中间体的合成提供充足的原料。

本发明提供一种利用米曲霉为宿主大规模制备苔色酸的方法，每1千克大米发酵可获得超过340mg苔色酸。

本发明可获得一种利用米曲霉制备苔色酸的方法。

附图说明

图1为苔色酸HPLC分析图谱，a表示AO-herA，b表示AO-WT；

图2为苔色酸UV光谱图，a表示207nm，b表示262nm，c表示300nm；

图3为苔色酸LC-MS检测图谱；

图4为苔色酸

图5为苔色酸

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种利用米曲霉制备苔色酸的方法，按以下步骤进行：

步骤S1：表达质粒pRA-herA的构建；

以猴头菇的基因组DNA为模板，以P1F为正向引物、P1R为反向引物，扩增获得苔色酸合酶编码基因herA的片段一，然后以P2F为正向引物、P2R为反向引物，苔色酸合酶编码基因herA的片段一为模板，扩增获得苔色酸合酶编码基因herA的片段二；以pRA质粒经KpnI酶切线性化处理的片段为载体，将苔色酸合酶编码基因herA的片段一和片段二插入到pRA质粒中，获得表达质粒pRA-herA；

引物P1F的序列为ccgGAATTCGAGCTCGGTACCATGTCCTCCATCGCGGATACG，引物P1R的序列为TTTATCGCGATCATGCCGGTCGTCTCCACGGCG；引物P2F的序列为ACCGGCATGATCGCGATAAACCAGGGCTC，引物P2R的序列为tactacaGATCCCCGGGTACCTCAAGCAGCAAGGCTCTCGAGG；

步骤S2：高产苔色酸菌株的获得；

取米曲霉的孢子保存液接入DPY培养基中，振荡培养2～3天，获得米曲霉菌丝体；然后加入细胞壁溶解液，温和振荡2～3小时，获得原生质体；向原生质体内加入缓冲液II和缓冲液III，再加入表达质粒pRA-herA，混匀后冰浴10～20min，向混合体系加入缓冲液III，室温孵育10～20min，然后加入缓冲液II，混匀后离心10～20min，除去上清液后加入缓冲液II，混匀后转移到改良的察氏培养基平板上，然后加入覆盖培养基，倒置培养3～7天；待含有pRA-herA转化子长出菌丝后，利用PCR方法对其验证，对获得的阳性转化子进行2次继代培养后，获得携带有苔色酸合成酶基因的高产菌株；

每200mL缓冲液II由1.2M山梨糖醇、50mM氯化钙溶液、50mM氯化钠溶液和10mM氨基丁三醇组成，且pH调至7.5；每200mL缓冲液III由40％聚乙二醇-4000、50mM氯化钙溶液和50mM氨基丁三醇组成；所述的改良的察氏培养基按以下步骤制备：每200mL改良的察氏培养基含有7.0g察氏培养基、9.3g NaCl、1.8g(NH

步骤S3：苔色酸的制备；

将高产苔色酸菌株的菌丝接种于灭菌后的大米培养基中，对培养好的菌体进行萃取、浓缩，获得发酵液浸膏；将发酵液浸膏通过硅胶分离、高效液相色谱仪制备，得到苔色酸。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：步骤S1中将苔色酸合酶编码的基因herA片段一和片段二及经KpnI酶切线性化处理的pRA质粒片段按照(1～2)：(1～2)：2的摩尔比混合，利用多片段连接试剂盒进行连接，连接完成后将连接体系转化到大肠杆菌DH5α，过夜培养后获得阳性克隆子，最后经过PCR验证和酶切验证后，获得表达质粒pRA-herA。

其他步骤与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同点是：步骤S1中以pRA质粒经KpnI酶切线性化处理的片段为载体，利用非连接酶依赖型的多片段一步克隆试剂盒，将苔色酸编码基因herA的片段一和片段二插入pRA质粒中，获得表达质粒pRA-herA；pRA质粒的质量与KpnI酶的体积的比为1μg：(1～2)μL。

其他步骤与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：步骤S2中基于表达质粒pRA-herA的苔色酸高产菌株的培养步骤如下：取米曲霉的孢子保存液接入到100～200mL的DPY培养基中，在28～30℃、180～200rpm的转速振荡培养2～3天，获得米曲霉菌丝体；将米曲霉菌丝体过滤收集后用无菌水洗涤3～5次，然后加入10～20mL细胞壁溶解液，并在28～30℃的温度条件下，温和振荡2～3小时，获得原生质体；利用灭菌过的0.8MNaCl溶液将原生质体洗涤2～3次，加入缓冲液II和缓冲液III，再加入2～10μg表达质粒pRA-herA，混匀后冰浴10～20min，向混合体系加入1mL缓冲液III，室温孵育10～20min，然后加入10mL缓冲液II，混匀后，在0～4℃下以800～1000rpm的转速离心5～10min，除去上清液后加入1mL缓冲液II，混匀后移取100～200μL混匀液转移到改良的察氏培养基平板上，然后加入5mL、40～50℃的覆盖培养基，待覆盖培养基凝固后封平板，倒置培养3～7天；待含有pRA-herA转化子长出菌丝后，利用PCR方法对其验证，对获得的阳性转化子进行2次继代培养后，获得携带有苔色酸合成酶基因的高产菌株。

其他步骤与具体实施方式一至三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：步骤S2中的DPY培养基按以下步骤制备：2g糊精、1g聚蛋白胨、0.5g酵母粉、10mg腺嘌呤、925mg硫酸铵、150mg甲硫氨酸和60mg精氨酸，加水定量至100mL。

其他步骤与具体实施方式一至四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是：步骤S2中的细胞壁溶解液由1.0％亚糖酶溶于溶液I中制成。

其他步骤与具体实施方式一至五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是：每200mL溶液I由0.8M氯化钠溶液和10mM磷酸二氢钠溶液组成。

其他步骤与具体实施方式一至六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同点是：步骤S2中的覆盖培养基由1.2M山梨糖醇和0.5％琼脂粉组成。

其他步骤与具体实施方式一至七相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同点是：步骤S3中将高产苔色酸菌株的菌丝接种于灭菌后的填装有大米的培养基中，并在28～30℃下静置培养两周；利用乙酸乙酯对培养好的菌体进行萃取3～5次，浓缩获得发酵液浸膏；然后利用反相色谱进行细分，再通过硅胶分离、高效液相色谱仪制备，得到苔色酸。

其他步骤与具体实施方式一至八相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：一种利用米曲霉制备苔色酸的方法，按以下步骤进行：

步骤S1：表达质粒pRA-herA的构建；

猴头菇是一种能够产生具有苔色酸骨架化合物的大型真菌。以该菌的基因组DNA为模板，以P1F为正向引物、P1R为反向引物，扩增获得苔色酸合酶编码基因herA的片段一，然后以P2F为正向引物、P2R为反向引物，苔色酸合酶编码基因herA的片段一为模板，扩增获得苔色酸合酶编码基因herA的片段二；以pRA质粒经KpnI酶切线性化处理的片段为载体，将苔色酸合酶编码的基因herA片段一和片段二及经KpnI酶切线性化处理的pRA质粒片段按照1:1:2的摩尔比混合，利用非连接酶依赖型的多片段一步克隆试剂盒，将苔色酸编码基因herA的片段一和片段二插入到pRA质粒中，pRA质粒的质量与KpnI的体积的比为1μg：1μL；连接完成后将连接体系转化到大肠杆菌DH5α，过夜培养后获得阳性克隆子，最后经过PCR验证和酶切验证后，获得表达质粒pRA-herA。

猴头菇(Hericium erinaceus)属于猴头菌属，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2018年11月20日，保藏编号为CCTCCAF2018025。

引物P1F的序列为ccgGAATTCGAGCTCGGTACCATGTCCTCCATCGCGGATACG，引物P1R的序列为TTTATCGCGATCATGCCGGTCGTCTCCACGGCG；引物P2F的序列为ACCGGCATGATCGCGATAAACCAGGGCTC，引物P2R的序列为tactacaGATCCCCGGGTACCTCAAGCAGCAAGGCTCTCGAGG；

步骤S2：高产苔色酸菌株的获得；

取米曲霉的孢子均匀涂抹在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基，30℃培养一周即可获得大量米曲霉孢子；取米曲霉(Aspergillus oryzae)的孢子保存液接入到100mL的DPY培养基中，在30℃、以200rpm的转速振荡培养2天，获得生长状态良好的米曲霉菌丝体；在无菌环境中，利用已灭菌的滤孔直径5mm的漏斗过滤收集菌体，将米曲霉菌丝体过滤收集后用无菌水洗涤5次，以清除菌体表面残留的培养基，获得干净的菌体，在漏斗中反复挤压除去水分。然后将菌体转移到50mL的灭菌离心管中，加入20mL细胞壁溶解液，并在28℃的温度条件下，温和振荡3小时，酶解过程中可以用显微镜观察原生质体酶解化程度。

利用已灭菌的用Miracloth滤布(Merck Germany)将酶解溶液过滤到50mL的灭菌离心管中，然后在4℃下以800rpm的转速离心10分钟，在超净台中轻轻导出上层液体，底部沉淀为米曲霉的原生质体，利用灭菌过的0.8M NaCl溶液洗涤将原生质体洗涤2次，按4:1比例配置适量的缓冲液II和缓冲液III的混合溶液，借助显微镜用混合溶液将原生质体浓度调成调成2×10

待含有pRA-herA的米曲霉转化子会在改良的察氏培养基平板表面长出菌丝后，并不断长大形成菌落。挑取适量菌丝到50μL TE缓冲液(1M Tris,0.5M EDTA,PH8.0)中，震荡混匀后取1μL为模板，以P1F和P1R为模板进行PCR验证，阳性转化子在相同的改良的察氏培养基平板进行2次继代培养，获得携带有苔色酸合成酶基因的高产菌株(A.oryzae/pRA-herA)。

所述的DPY培养基按以下步骤制备：2g糊精(Dextrin)、1g聚蛋白胨(Polypeptone)、0.5g酵母粉(Yeast Extract)、10mg腺嘌呤(Adenine)、925mg硫酸铵、150mg甲硫氨酸(Methionine)和60mg精氨酸(Arginine)，加水定量至100mL。

所述的细胞壁溶解液由1.0％亚糖酶(Takara Shuzo)溶于溶液I中制成；所述溶液I由0.8M氯化钠溶液和10mM磷酸二氢钠溶液组成。

每200mL缓冲液II由1.2M山梨糖醇(Sorbitol)、50mM氯化钙溶液、50mM氯化钠溶液和10mM氨基丁三醇(Tris)组成，且pH调至7.5。

每200mL缓冲液III由质量百分含量为40％聚乙二醇-4000(PEG-4000)、50mM氯化钙溶液和50mM氨基丁三醇(Tris)组成。

所述的改良的察氏培养基按以下步骤制备：每200mL改良的察氏培养基含有7.0g察氏培养基(Czapek-Dox)、9.3g NaCl、1.8g(NH

所述的覆盖培养基由1.2M山梨糖醇(Sorbitol)和0.5％琼脂粉(Agar)组成。

步骤S3：苔色酸的制备；

将携带有苔色酸合成酶基因的高产菌株(A.oryzae/pRA-herA)的菌丝接种于灭菌后的填装有大米(每个500mL三角瓶含50克大米和30mL水，大米浸泡三个小时后灭菌)的培养基中，并在28℃下静置培养两周；待菌丝覆盖培养基表面并产生大量孢子，菌体合成的苔色酸分泌在培养基中。宿主菌米曲霉与苔色酸的高产菌株(A.s oryzae/pRA-herA)代谢产物的乙酸乙酯粗提物的HPLC分析如图1所示，图1为苔色酸HPLC分析图谱，a表示AO-herA，b表示AO-WT；通过HPLC对转化株代谢产物进行检测。结果显示，与野生型米曲霉菌株相比，A.oryzae/pRA-herA转化株产生一个新的化合物。

图2为苔色酸UV光谱图，a表示207nm，b表示262nm，c表示300nm；苔色酸光谱特征如图2所示，为了进一步验证这个新化合物的结构，我们分析了它的紫外吸收光谱。结果显示：新化合物的吸收波长为207nm、262nm和300nm，与已报道的苔色酸的UV一致。

图3为苔色酸LC-MS检测图谱；苔色酸的质谱特征如图3所示，为了进一步验证这个新化合物的结构，我们对其进行了LC-MS检测。结果显示:[M+H]

图4为苔色酸

图5为苔色酸

利用等量的乙酸乙酯对上述培养好的菌体萃取3次，合并萃取液后低压浓缩获得发酵液浸膏。利用硅胶填料的正相色谱对发酵液浸膏进行粗分划段，利用TLC初步判断苔色酸分布的段，将含有苔色酸的划段合并，然后利用C18填料的反相色谱进行细分，再利用TLC判断苔色酸的所在位置，最后借助安捷伦HPLC1260 Infinity II液相色谱仪，在264nm波长检测下进行制备，获得纯品(纯度>98％)。借助400M核磁仪确认了其结构，其结构数据(溶剂为氘带甲醇)如下：

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上述分离制备过程用到的正相色谱填料为200～300目硅胶，反相色谱填料为C18色谱填料，制备所用的高效液相色谱仪为安捷伦1260Infinity II，色谱柱为安捷伦ZORBAXRX-C18，9.4×250mm，检测波长为254nm。

表达质粒pRA-herA的核苷酸序列如下：

ATGTCCTCCATCGCGGATACGCAGCATTTCAATGTCCCGGTCTTCGCAGGCCACGGTACAACGGCCATCAACACACCCCAGACCCGTGAGCGCGCCCTTCGCGATGCTTCCTCGCCATCAGGCTCTATTCTACTCTCCTCTTGCTTCGATAGTTTCCAAGAAGAGCTCGCTACATTCACTGATGAGGAGCGCAAGGCTGCAGGCGTCGAAGCTGGGGACTTCGATAAGCCTGAGTCTCTCCTCTCTCTATCTCAGGAGCGCTACCTCTCCAATCCAGTCATCTCTGGGATCACGCTCTTCCTCATCCAAACGCTGAGGTACCTCTCCTTCGTCGAGTCCTACTCTTCGCCGTCGTCTCCGCGCTTCGCGGCCATCCTCTCCCAGAACCTCGCACACCAGCTTGGTGTTCTTGGATTTTCTTCTGGTATTCTCCCAGCATCAGTCGTCGGCACCTCAGTTTCGGCATTGGAGTTCATCTCAAACGCTGTCGAGGCATTCCGCCTCGCGTTCTGGATCGGAGTTCGCGCCCAACTTTATCGCGTCGCAGCCTTTGAATCCGCAAATAGTCTCGGAGATGATGCGGCGCTCCCATGGAGCGTTGTGTTCCTGGGGATTGGGCGGCAAGAGGCAGATGAGGCAGTGCGCAAGTACCGTGAATCGAATGAAAATGCAGAGTCTCTGCACGTGACCGCTGTGATGGATGAGACTTGCGTCACCATATCTGGACGTCCTGACGTTCTCGCTGCCTTCGCGTCCCGACTTCCGACTTCTGCGCCTCCGCACAAGACGACCGTAGATACCCTTTATCACTCCCCGATTCACACAGGCACGACACGCGATCTGGTCCTGGAAGATGTGTCCCGCCGTGGGATTCAGTTCCCTTCGTTCTCGGACATCAAGATCCCCGTCCGCTCCATGCACACTGGCGAGCTGCTCGATTCATCTCGCGAGGGATCGTTCGTAGAGGCGGTCGTCGATATGGTCCTCACGCAGCCAGTGAACTGGGATCGCGTCGTCAGCTCGCTTGTGTCAGCCGCGCCAGAGGGCGAAGCCGTGCGCTTGATCAACGTCGGACCTGGTGCTGGGCTTACTCGCAGCATGGAGCGGGCATTCCCCACGCGCAATGCATTGTCTGTAGATCTGACTGCCCCGGAGAAGAATTCCGCCGCGAACAAGATGTCTCCCGTTCAGGAGCCGATTGCTATTGTCGGCATGGCGGTTAACATGCCCGGAGCACCGAGCGTCGAGAAGCTGTGGGAGGTGCTCGAGAAGGGCATCAACACTATTGCGGAGATCCCTGAGCACCGGTTCAAGGTCTCAGACTACAACAACCCCGCCGATGCCAAGAGTGCCCGGTCGATGAAGGCACATACGGGCAACTTCCTCGACGATCCTGATGCATTTGACAACAAGTTCTTCAAGATCTCGCCGCGTGAGGCACGCAGCATGGATCCTCAAGGCCGCGTGCTGCTTCACACCGCGTACGAGGCGCTGGAGGATTCAGGTTATGTACCCAACGCCACGCCGACATTCCAGCCGGACTCGTTCGGGTGCTACATCGGTTGCGCCACGGGCGATTACGTTGAGAATCTCCGAAACGATATTGACGTATATTACAGCACTGGCACTCTGCGCGCCTTCCTCAGTGGTCGGATTTCATACGCTATGAAACTCAGCGGTCCATCTGTGGTCATTGATACTGCGTGCTCGTCTTCGATCATCGCCGTGTACCAGGCGTGTCGTGCACTCATGAACGGGGACTGCACTGCGGCCATGGCAGGTGGTGTCAACGTGATCGCTGCTCCCGACATGTTCATGGGTCTAGATCGTGGTCATTTCCTCAGCCCTACGGGCCAGTGCAAGGCGTTCGATGACTCTGCCGATGGATACTCGCGTAGCGAAGGCTGTGGAATTTTCGTCCTGAAGCGGCTGTCAGATGCCATCGCTGAGGACGACAACATCCTCGGCGTCATCCGCGGTGTTGAGGTTAACCAAAGCGGCCTCGCGAGCTCCATCACTCATCCGCATTCGCCGACGCAACAGATCCTTTTCAAGAAGGCGCTCGAGAAGTCTGGCATTGATGCGCGTCGCATCAACGTTGTCGAAGCTCACGGCACTGGCACGCAGGCTGGCGATCCCAACGAGCTCGATAGTATCCGCGGCGTCTTTGCTGTCGGCCGTACACCCGCGAACCCGCTTCACATCACGTCCGTGAAGGCCAACATCGGGCATCTCGAGGCTGCGTCGGGCTCCGCTGGCCTGGCAAAGCTTCTGCTCATGCTTAAGCACCGCACGATTCCCGCCCAGATCTCGTTGAAGAATCTGAACCCGAAGATCGTGGCTCTCGAGAAGGATCACACGGTCATCGACAGGGAGCACGCGCCTTGGAACCCGTCGGAAGAGGGACTGACGAGAATTGCCATGCTCAACAACTTCGGCGCCGCTGGTTCCAATGGGGCTCTGTTGTTGGAGGAATATGTCCCGGCGGGCTCGAAGGCACCTGAGGTCGAGTCTGCTGCGGCCTTCATCGTTGGTCTGTCAGCGAAGACGGACGAGGCACTCAATGCCCTGCGCATGCGTTACATCGAGTGGCTCGGCGATGCCAGGAATGCATCCATCTCCCTCGCCGATTTCGCATACACTGCTACAGCTCGCAGGCAGCTGTACGGCCAGCGTCTCGCTGTCTCTGCAGGCACCAAGGAGGAGCTTGTCGAGAAGTTGAGAGCCGCGTCGCAGGTCGCTGTGACTGAGCGGCCAGCGAAAGTTGCTTTCGTCTTCTCTGGCCAGGGCAGCCAGTACCTCGGGATGGGATCTGCCCTCTACAAGACCGTGCCTCTCTTCAAGCGTACCGTCGACGAGTGCCACGCTATCTTAACTGCGTCCGGCTTCCCGGGCGTTCTCGCCATCATCAATCCTGCTGGTGAGACCAGTGGTCTTACTCAGCTGGAGGAGTTCGAAGCATATCAGGCGGCGATCTTCTCCCTTGAGTACGCGCTCGCCAAGTTGTGGATGTCATGGGGACTGGTTCCCGAGGTGGTCGTAGGCCACAGTCTGGGCGAGTACGCAGCGCAGGTCATCGCTGGCGTCTTGACGCTCAAGGGCGCGCTCACTCTCATTGCCAACCGCGTCCGCTTCATGGTCAGCAAGTGCGCCGTGGAGACGACCGGCATGATCGCGATAAACCAGGGCTCCGAGGCGGTTGCGAAAATGCTGGCAGCTTCGATGGACTTCCCCGACACTTCTGTTGCATGCTTTAACAGCAACACTGACTGCGTCGTTTCGGGCCCTATTCCTCAGCTCAAGGCACTGAAGGCACACCTCGACAGTGAAGTACGCTGCAAGAACGTCCTCTTGACGGTGCCGTTCGGGTACCATAGCTCCGCCATGCACCCCCTTCTCGACGACCTTTCCACTATTGCTAAGCATGTTACCATCCGCGCGCCCACTATTCCGATTATCTCCAATGTCACCGGTGAGGTCGTTATGCCCGGCGATGAGGGCGTTTTCGACTCGGAGTACTACTCTCGCCACTGCGCGCAGCCAGTACTCTTCGAGAAGGGCCTCACTTCACTCGCGGCTATTCCGGAGCTTGCGAACATCGACGCATGGATCGAGATTGGTCCCCACAGCATCACGCTTCCCATGTTCAAGGTTCACCCGTCGATCTCGAAGAGCACCATGCTCTTGGGCTCCCTGAAGAAGAACCACGACCCGTGGGCAATCGTCTCTTCGACTTTGGCTCAGCTGTACACGTCCCCGATTCAACTCAGGTGGCGTGAGGTCTTTGGCCATGTCTCTTCTCCTTCGACGCTTTCCCTTCCGTCGTACCCCTTCACGAAGTCCAAGTTCTGGGTCTCGTTCAAGGAGGAGGCACCTGGCGCGGTTGTATCGGCGTCCACCTCCGTCCCGCTCGCGAAGCACGTCGATTTAGTCAATAACTTCTCGATGCTATACTCCTGGGCCCAGTTCCCGTCGGCGGCGAACCAGCGCGTCGCAATTTTCGAGACGCCCATCTCGCAGCTCGGGAAGTCCATCATGGGCCATAGCGTTGGAGACCACCCGCTCTGCCCCGCGTCCGTGTACCACGAGCTCGCACTTGCAGGTATCGAGATGGCTAGGTCCCATCTGCACCTTAAGATTGACGACTGCTTCGTCATGCTTCGCGACATCGACTACGCGAAGCCGCTGGTCTACAACGAGCACGTTGCCCGGATGGTCAGGACATCGATCACACTTGACGTTGATGGCTCGGGCTCTTTCAGCGTTGGCTCGCAGGTAGATGGCTCGCCCGAGGAGGTCCATTGCTTCGGGAAGTTCAAGCACCAGTCGACATCGAAGGCCTCAACCAAATTCGCTCGCGTTCTTCCCATCGTAACTCGTCAAATCAGCTCCGTCTCGTCGCCTAACGATGGTTTCGCGGAGACGTTCTCTACTCGCACGGCATACGAGGTCATCTTCCCGCGCGTGGTCGACTACGCAAAGGAGTACCACACGATGAAGACGCTCACCGTCGCCTCGAACGGTATGGAAGCATACGCGATCGTCCAGCTGCCTCGCGATCACGACCGCAGCAAGTTTATCGTCCACCCTGTCTTCATGGACACCATGCTTCACGTTGCCGGCTTCGTCGCGAACATGCAGGGCGGAGTCAACGATGCCTACATCTGCAGCAAGGTCGACACAGTGAAGGCGATCCCGGCTTTGATCGACAACGACGCGGAGTACGGCGTGCTGATCAGCAACGCCTGGGTCGCGGATGAGGGCGTCATGCTTGCGGAGGCCTACGCCGTCCAGTTGAAGTCTCCAGGTAAGATCGTCGCGCACCTCAAGGGCATGCACTTCCGCAAGGTGCGCCTCAATAGCCTGAAGCGTGGTCTCGCGATGGCCGCGGGCACTAGCCCGGCGCATGCTGCGCCGAAGCGGGCGGAGGCGCCTGTGAAGAAGGCTGCGCCTGCTTCCCCGATGTCCTCCAAGGTCGTTTCCTCAATCACCTTCGTCGA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