一种毕赤酵母表达重组人参蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及重组人参蛋白的结构设计、功效验证以及生产工艺的建立。

背景技术

陆地辐射中的紫外线成分是皮肤老化的主要原因。长波紫外辐射A(UVA)的波长为320～400nm，约占紫外辐射(UVR)的95％。UVA能穿透真皮并对真皮成纤维细胞造成功能损伤，损伤的主要表现是抑制成纤维细胞的增殖能力、降低其细胞活力和收缩能力，并增加胶原降解，导致皮肤光老化。为了有效地保护皮肤免受光老化，需要开发能够抵抗UVA的保护剂。并且随着数字化时代各种光源辐射给皮肤健康造成的危害越来越大，抗衰老、抗光老化功能原料的开发也变得迫在眉睫。

人参中共有人参蛋白(Preparation of Ginseng proteins,GP)300多种，分为皂苷β-葡萄糖苷酶、类RNA酶蛋白、核糖核酸酶等。Seung Il Kim等人发现的人参根RNA样储存蛋白(Characterization of RNase-like major storage protein from the ginsengroot by proteomic approach)，经二维电泳分析显示含量随季节的变化而变化，氨基酸序列(AY496964.)分析显示与植物的RNA酶具有高度同源性。Rui Jiang等人分离了分子量分别为27kDa和13kDa的人参蛋白，发现这些蛋白可以减轻UVA对细胞活力的抑制作用，增加了细胞周期S期NIH-3T3成纤维细胞的百分比，可以防止UVA诱导的成纤维细胞光老化，并可能通过抑制ROS引起的DNA损伤和胶原降解，改善成纤维细胞的增殖、收缩等功能。前期研究表明上述27kDa蛋白与人参根RNA样储存蛋白的覆盖率仅为63.03％。

虽然已经通过植物人参提取，建立了适合于工业生产的人参蛋白制备工艺，并获得了具有提高T-SOD等抗氧化酶活性的人参蛋白。但该工艺的人参蛋白产量较低，提取中大量使用有机化学试剂，且生产成本较高。中国专利CN104829701A利用大肠杆菌表达获得具有抑菌活性的重组人参亲环素蛋白，但表达产物位于菌体内，导致分离纯化工艺复杂，影响产量且增加了成本和污染风险。毕赤酵母表达体系具有成本低、污染小、产量高的优点，与大肠杆菌相比安全性更高。但是目前未见到通过毕赤酵母表达重组人参蛋白的相关工艺报道。人参作为植物，其蛋白的表达与蛋白在酵母中的表达并不相同，另外密码子的选择也影响蛋白的表达，从而导致利用毕赤酵母发酵生产重组人参蛋白的难度较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毕赤酵母表达重组人参蛋白的制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种毕赤酵母表达重组人参蛋白的制备方法，该重组人参蛋白的制备方法包括以下步骤：

将重组人参蛋白的编码序列插入表达盒中去除了信号肽元件的毕赤酵母表达载体，然后转化毕赤酵母，从而利用毕赤酵母完成所述重组人参蛋白的分泌表达，所述重组人参蛋白包括由人参蛋白信号肽与成熟人参蛋白组成的融合蛋白。

优选的，所述毕赤酵母表达载体选自通用9K载体中的任意一种，由所述重组人参蛋白的编码序列与去除了a-factor信号肽元件的通用9K载体骨架构建用于分泌表达重组人参蛋白的重组质粒(所述重组人参蛋白的编码序列包括人参蛋白自身信号肽元件)，将该重组质粒转入毕赤酵母。

优选的，所述重组人参蛋白的制备方法具体包括以下步骤：

1)目的基因克隆

人工设计所述重组人参蛋白的编码序列，比照通用9K载体(例如pPIC9K)的核苷酸序列，并选择该核苷酸序列中位于a-factor信号肽元件两侧的限制性内切酶酶切识别位点及必要的酶切识别位点侧翼序列(例如利用该序列确保编码序列插入后能够与原有表达盒的开放阅读框匹配)、终止密码子与所述重组人参蛋白的编码序列组合拼接，得到两侧带有限制性内切酶酶切识别位点的目的基因序列(例如SEQ.ID.NO.3，其中重组人参蛋白的编码序列为第15至728位核苷酸)，构建或合成包含该目的基因序列的克隆质粒；

2)重组质粒的构建

根据选择的限制性内切酶酶切识别位点，对通用9K载体进行双酶切，得到去除a-factor信号肽元件的载体骨架，将经过同样双酶切的目的基因(即对克隆质粒进行双酶切所得目的片段)与所述载体骨架连接，得到重组质粒；

3)重组质粒转化毕赤酵母

将重组质粒线性化，然后转入毕赤酵母感受态细胞中，然后采用G418筛选高拷贝转化子；

4)重组转化子的鉴定

采用冻融法提取高拷贝转化子基因组DNA，然后通过PCR鉴定重组转化子。

5)发酵种子筛选

将重组转化子于26～32℃下进行摇瓶培养，培养过程中采用甲醇诱导表达，筛得表达菌株；

6)重组人参蛋白发酵

将表达菌株接入发酵培养基后于26～32℃下进行培养，并通过补加甘油的方式使湿菌重增加至≥140g/L，然后利用甲醇诱导表达，直至目标蛋白(所述重组人参蛋白)的表达量不再增加时(此时湿菌重一般大于200g/L)终止培养。

优选的，所述重组人参蛋白的制备方法还包括以下步骤：利用离子交换层析对发酵液上清含有的重组人参蛋白进行纯化，然后依次进行透析(截留分子量5～10kDa)脱盐、冷冻干燥，得到所述重组人参蛋白的纯品。

优选的，所述离子交换层析采用阳离子交换填料的层析柱。

优选的，所述离子交换层析采用的洗杂试剂为体积分数91％～95％的溶液A与体积分数5％～9％的溶液B的混合液，采用的洗脱试剂为体积分数86％～90％的溶液A与体积分数10％～14％的溶液B的混合液；其中溶液A为pH5.8～6.0的10～20mmol/L柠檬酸缓冲液，溶液B为含有1M NaCl的溶液A。

一种化妆品或医疗美容产品，含有上述毕赤酵母表达重组人参蛋白的制备方法制得的重组人参蛋白。

优选的，所述重组人参蛋白作为抗光老化、抗衰老或皮肤修护的功能原料。

优选的，所述重组人参蛋白的浓度≥700μg/mL。

一种促进组织和/或器官再生的药物，含有上述毕赤酵母表达重组人参蛋白的制备方法制得的重组人参蛋白。

优选的，所述重组人参蛋白作为修复皮肤、骨骼、血管的功能原料。

一种核酸分子，该核酸分子包括重组人参蛋白的编码序列，所述重组人参蛋白包括由人参蛋白信号肽与成熟人参蛋白组成的融合蛋白。

优选的，所述核酸分子选自用于表达所述重组人参蛋白的重组质粒，该重组质粒是由所述重组人参蛋白的编码序列与去除了a-factor信号肽元件的通用9K载体骨架构建得到的。

一种重组人参蛋白表达体系，包括毕赤酵母宿主细胞以及转化在该宿主细胞中的重组质粒，该重组质粒是由重组人参蛋白的编码序列与去除了a-factor信号肽元件的通用9K载体骨架构建得到的，所述重组人参蛋白包括由人参蛋白信号肽与成熟人参蛋白组成的融合蛋白。

优选的，所述成熟人参蛋白选自来源于人参的核糖核酸酶中的任意一种。

优选的，所述成熟人参蛋白选自人参根RNA样储存蛋白中的任意一种，人参蛋白信号肽为人参根RNA样储存蛋白前体中的信号肽，即人参蛋白自身信号肽。

优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明的有益效果体现在：

本发明以利用人参蛋白(例如人参根RNA样储存蛋白)自身信号肽并经毕赤酵母融合表达的重组人参蛋白为实验对象，经实验发现，该重组人参蛋白细胞毒性低、生物安全性高，并且可以有效促进成纤维细胞增殖，以及抑制ROS活性，从而能够防止UVA诱导的成纤维细胞光老化，对皮肤有明显的修护及抗光老化作用。

本发明利用毕赤酵母分泌表达重组人参蛋白，实验表明，通过利用去除了信号肽元件的毕赤酵母表达载体与含有人参蛋白自身信号肽元件的目的基因构建重组质粒，使得毕赤酵母表达体系不仅可以利用人参蛋白自身信号肽引导重组人参蛋白分泌，还能够有效的增强该重组人参蛋白的表达(例如减少体系杂蛋白的表达量)。

进一步的，本发明通过重组人参蛋白的密码子优化、与去除了a-factor信号肽的毕赤酵母通用9K载体构建重组质粒并转化毕赤酵母，实现了利用毕赤酵母重组转化子分泌表达重组人参蛋白(表达量>0.8g/L)，可以大量生产获得亲水性好、结构完整、功能优异的人参蛋白，并用作化妆品、医疗美容等产品的原料。

进一步的，本发明针对所构建的毕赤酵母表达体系，主要采用离子交换层析、透析和冷冻干燥的纯化工艺，获得了纯度高达95％的重组人参蛋白(参见中国药典纯度检测方法，电泳法)。

附图说明

图1为重组人参蛋白SWISS-MODEL建模3D结构。

图2为毕赤酵母表达质粒(pPIC9K,9K)酶切位点选择示意图：图中，上侧框内序列为BamH I酶切位点，中间框内序列为Xho I酶切位点，下侧框内序列为EcoR I酶切位点。

图3为GS115/9K-GP重组转化子PCR鉴定结果；图中，1#至12#表示来自于不同菌落的重组转化子，M表示Marker，目标条带的大小约为800bp。

图4为GS115/9K-GP菌种(重组转化子)摇瓶表达鉴定结果。

图5为转入了GS115/9K-GP、GS115/9K-gp的两种毕赤酵母(重组转化子)摇瓶表达产物对比。

图6为经不同浓度重组人参蛋白样品处理的体外培养HFF-1细胞的生长曲线。

图7为重组人参蛋白促HFF-1细胞增殖结果。

图8为经不同浓度重组人参蛋白样品处理的HFF-1细胞划痕实验结果(显微照片)。

图9为经不同浓度重组人参蛋白样品处理的HFF-1细胞划痕实验结果(柱形图)。

图10为重组人参蛋白斑马鱼修护功效实验表型图(虚线部位为定量区域)。

图11为重组人参蛋白斑马鱼光老化功效实验结果(柱形图)。

具体实施方式

为了更充分的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。显然，以下所描述的实施例仅用于解释本发明，而不是对本发明保护范围的限制。

1.重组人参蛋白分子设计

1.1人参蛋白(GP)序列的获得和改造

在NCBI网站上查找人参根RNA样储存蛋白的氨基酸序列(AY496964.)，经过改造后形成所要表达的重组人参蛋白的氨基酸序列(即SEQ.ID.NO.2)，其中第1至23位氨基酸残基为包含于AY496964.中的相应人参蛋白的自身信号肽(即SEQ.ID.NO.1)。

1.2重组人参蛋白理论性质

蛋白分子量为27.34kDa、等电点为6.24；蛋白3D结构参见图1。

1.3重组人参蛋白基因合成

按照毕赤酵母的密码子偏爱性，人工选择和优化设计编码重组人参蛋白的核苷酸序列，在该序列的两端加上限制性内切酶BamH I和EcoR I的酶切位点，同时在BamH I酶切位点之后加入序列“aaacgatg”，以及在EcoR I酶切位点之前加入终止密码子“taa”，最终得到重组人参蛋白基因序列(即SEQ.ID.NO.3)，进行化学合成，得到全基因合成克隆质粒T-GP(交由基因公司合成，仅用于增加重组人参蛋白基因序列拷贝数)。

2.重组质粒的构建

2.1物料

2×Taq PCR Mastermix(天根生化)、T4 DNA Ligase(Thermo)、E.coli DH5α感受态细胞(天根生化)、限制性内切酶EcoR I Fast Digest(Thermo)、限制性内切酶BamH IFast Digest(Thermo)、限制性内切酶Xho I Fast Digest(Thermo)、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化)、LB培养基。

2.2设备

PCR仪(Bio-RAD)、水平电泳装置、离心机、摇床。

2.3方法

2.3.1目的基因、载体的双酶切

如图2所示，为了去除pPIC9K载体(淼灵质粒，P0214)中的a-factor信号肽元件以构建不含a-factor信号肽元件(则另外引入人参蛋白自身信号肽元件)的重组质粒，选择位于a-factor信号肽元件上游和下游的各一个限制性内切酶(即BamH I和EcoR I)酶切位点。同时，在实验室前期为了构建保留a-factor信号肽元件(则不再引入人参蛋白自身信号肽元件)的重组质粒，选择图2中所示限制性内切酶Xho I酶切位点替换以上选取的位于上游的限制性内切酶(即BamH I)酶切位点，下游限制性内切酶(即EcoR I)酶切位点保持不变。

使用限制性内切酶BamH I和EcoR I对全基因合成克隆质粒T-GP和pPIC9K载体分别进行双酶切，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并对电泳条带进行胶回收，得到带有粘性末端目的片段和不含a-factor信号肽的载体骨架。

而同样在实验室前期，使用限制性内切酶XhoI和EcoR I对全基因合成克隆质粒T-gp(与T-GP的不同包括：T-gp不含人参蛋白自身信号肽元件)和pPIC9K载体分别进行双酶切，得到带有粘性末端目的片段和含a-factor信号肽的载体骨架。

2.3.2酶切产物的连接

为构建重组表达载体pPIC9K-GP(不含a-factor信号肽的重组质粒)，选用T4 DNA连接酶，对含有编码重组人参蛋白的核苷酸序列的酶切回收产物(目的片段)以及pPIC9K载体酶切产物(不含a-factor信号肽的载体骨架)进行连接。

而同样在实验室前期，以相同方式将相应的目的片段与pPIC9K载体酶切产物(含a-factor信号肽的载体骨架)连接，构建的重组表达载体记为pPIC9K-gp，pPIC9K-gp在毕赤酵母中分泌表达的蛋白产物是不含a-factor信号肽的，目标蛋白的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2中的第24至238位氨基酸残基。

2.3.3连接产物的转化

以pPIC9K-GP为例，使用E.coli DH5α感受态细胞进行质粒转化，将转化液均匀涂布于含有60μg/mL氨苄抗生素的LB平板上，倒置放于37℃恒温培养箱中，培养过夜。

2.3.4阳性克隆的鉴定

挑选长出的菌落，进行菌液PCR鉴定，并对PCR鉴定正确的菌株，送基因公司测序，测序结果与设计序列比对，将比对正确的菌株进行保存。

3.重组质粒转化GS115酵母菌

3.1物料

质粒小提中量试剂盒(天根生化)、通用型DNA纯化回收试剂盒(天根生化DP214-02)、限制性内切酶SaL I FastDigest(Thermo)、MD平板、YPD平板。

3.2设备

PCR仪(Bio-RAD)、水平电泳装置、离心机、摇床。

3.3方法

3.3.1重组质粒的中量提取

用试剂盒提取保存菌株中的重组质粒，如pPIC9K-GP。最终用300μL灭菌ddH

3.3.2重组质粒线性化

对于中量提取的重组质粒，如pPIC9K-GP，用SaL I进行线性化，线性化反应体系如表3-1：

表3-1.重组质粒线性化反应体系

线性化后，用试剂盒回收线性化质粒。最终通过45℃烘烤干燥浓缩质粒溶液至10～20μL。-20℃保存。

3.3.3GS115毕赤酵母感受态制备

挑取毕赤酵母菌株GS115单菌落，29℃、200rpm摇床培养过夜。

次日，利用分光度计测定OD600，OD600值在1.1～1.7之间时，即可用于感受态制备，具体如下：

4℃、3000rpm离心5min，弃上清；用30mL已灭菌的冰预冷ddH

再用30mL已灭菌的冰预冷1M D-山梨醇，将细胞悬浮，4℃、3000rpm离心5min，弃上清(重复步骤两次)。取1M D-山梨醇重悬细胞，即为感受态细胞。分装感受态细胞，备用。

3.3.4线性化质粒的电转化及筛选

电转化：以pPIC9K-GP为例，将10μL线性化质粒加入到90μL感受态细胞中，混匀，再将100μL混合物转至2mm规格电击杯中，冰上预冷10min。按设置参数电击(参数：电压2000V、电容25uF、电阻200Ω)，电击完毕后立即加入1.5mL 1M冰预冷D-山梨醇，混匀后吸出菌液至1.5mL无菌离心管中。

筛选：以pPIC9K-GP为例，每块MD平板涂200μL菌液，无菌涂布器轻轻涂开后29℃倒置培养3～4天。配制含4mg/mL G418的YPD平板，将MD平板中生长的单菌落用无菌牙签全部挑菌至含4mg/mL G418的YPD平板，29℃倒置培养4～5天。配制YPD平板，将含4mg/mL G418的G418平板中生长的单菌落用无菌牙签全部挑菌至YPD平板，29℃倒置培养1～2天。

4.毕赤酵母重组转化子的鉴定

4.1物料

2×Taq PCR Mastermix(天根生化)。

4.2设备

PCR仪(Bio-RAD)、离心机、微波炉、-80℃冰箱。

4.3方法

4.3.1转化子基因组DNA提取

牙签挑取YPD平板中生长菌落于EP管中，混匀，室温、4000rpm离心1min，弃上清。微波炉中火加热5min后-80℃冰箱冷冻20min；反复操作两次。加入50μL双蒸水，混匀后室温、4000rpm离心1min。吸取离心上清液(基因组DNA)于无菌离心管中，-20℃保存。

4.3.2转化子基因组PCR

以提取的基因组DNA为模板，以插入的目的基因片段引物进行PCR，能够扩增出目的片段的菌株为重组转化子(例如GS115/pPIC9K-GP，或称为GS115/9K-GP)。PCR反应体系如表4-1：

表4-1.GS115/pPIC9K-GP基因组DNA PCR反应体系

引物设计如下：

GP-XF：5'-ATGGATCCAAACGATGATGAGAGCCATT-3'

GP-ER：5'-TAGAATTCTTAAATAATACTATTCGTTCT-3'

PCR具体流程如下：

(1)取灭菌的EP管，按表4-1配制反应体系，混匀，瞬时离心。

(2)在PCR仪中按设置的程序进行反应：

94℃预变性5min后，重复以下步骤30个循环：94℃、30s(解链)，60℃、30s(退火)，72℃、1min(延伸)；

再在72℃延伸5min。4℃保持。

(3)根据PCR结果，初步确定重组转化子，相应平板放至-4℃保存。

4.4结果

最终成功鉴定出多株携带目的载体(例如pPIC9K-GP，图3)的重组转化子，可用于摇瓶表达筛选。

5.重组转化子摇瓶表达

5.1物料

BMGY培养基、BMMY培养基。

5.2设备

摇床、超净台、灭菌锅。

5.3方法

(1)分别挑取GS115/9K-gp(含a-factor信号肽，本实验室前期制备完成)、GS115/9K-GP(不含a-factor信号肽)以及空白菌株(GS115单菌落)，接种于含有30mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，29℃、225rpm摇床培养60小时。

(2)50mL离心管编号，将上一步所得BMGY培养液倒入离心管中，室温、3000rpm离心5min，收集摇瓶菌体。

(3)加入30mL灭菌双蒸水，重悬菌体。室温、3000rpm离心5min，收集菌体。

(4)重复步骤3两次。

(5)加入30mL BMMY培养基重悬菌体，将30mL混匀的BMMY培养液倒入250mL三角瓶中，29℃、225rpm摇床培养。

(6)培养至24、48、72小时时补充终浓度1％(v/v)的甲醇进行诱导。

(7)培养至96小时，收集摇瓶上清，-20℃储存。

(8)SDS-PAGE电泳检测摇瓶上清，确认重组人参蛋白表达结果。

5.4结果

由图4可知，不同编号的重组转化子(例如GS115/9K-GP)的实验结果说明可以获得多株表达菌株，即以上制备重组转化子的流程并不是偶然实验，具有有效性和可重复性。由图5可知，与空白菌株相比较，GS115/9K-GP(不含a-factor信号肽)与GS115/9K-gp(含a-factor信号肽)均有目标蛋白表达，但就构建的两种含有不同重组质粒的转化子而言，GS115/9K-GP的重组人参蛋白表达量明显高于GS115/9K-gp，且GS115/9K-gp表达的杂蛋白较多，致使纯化难度增大，不利于后期应用；并且将二者表达后的目标蛋白分子大小分别与理论值相比较，发现GS115/9K-GP表达的重组人参蛋白略高于理论值，说明其中的人参蛋白自身信号肽未被切除，即表达的重组人参蛋白中保留了人参蛋白自身信号肽。

6.发酵工艺

6.1摇瓶种子的培养

配制好的培养基分装于500mL三角烧瓶中，装量200mL。接种以上摇瓶实验确定的GS115/9K-GP表达菌株，置29±0.5℃条件下，摇床(220±10转/分钟)振荡培养20～28小时。在火焰保护下将摇瓶种子培养液500～800mL合并于无菌的接种瓶中，接入发酵罐(10L)。

6.2发酵

在发酵罐罐压为0.030～0.050MPa、发酵罐空气流量为2～5m

6.3发酵结果

GS115/9K-GP(不含a-factor信号肽)可以经甲醇诱导有效表达重组人参蛋白，表达量大于0.8mg/mL。

7.重组人参蛋白纯化工艺

7.1方法

终止发酵后放出发酵液，将发酵液离心后收集得到含有重组人参蛋白的发酵液上清7L，利用CM-琼脂糖凝胶FF(CM-Sepharose FF)离子交换层析柱对所述发酵液上清进行纯化，纯化时先用3倍柱体积的A相平衡层析柱后上样，然后用95％A相+5％B相(体积分数)冲柱洗杂，再用10倍柱体积的90％A相+10％B相(体积分数)洗脱，收集洗脱液，其中A相为pH6.0的10mmol/L柠檬酸缓冲液，B相为含有1M NaCl的A相；最后将洗脱液透析(透析袋截留分子量10kDa)脱盐、冻干，获得重组人参蛋白纯品。

7.2结果

最终利用GS115/9K-GP(不含a-factor信号肽)制备获得20g重组人参蛋白冻干粉，进行以下的各实验。

8.重组人参蛋白促HFF-1细胞增殖实验

8.1物料

DMEM培养基(含5％胎牛血清)、PBS、75％酒精、细胞培养瓶、96孔板、移液枪、离心管、酒精灯、1mL注射器、0.22μL滤膜、钢尺、marker笔。

8.2设备

液氮罐、超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、酶标仪。

8.3方法

8.3.1铺板和处理

将HFF-1细胞按10

8.3.2检测

使用倒置成像显微镜记录细胞状态，随后去除培养基，每孔加入50μL MTT溶液，37℃、5％CO

8.8.3数据记录与计算

利用prism 8分析重组人参蛋白处理后的吸光度值(计算各浓度OD平均值)，绘制各处理浓度OD值和时间折线统计图。其中OD值越大，则活细胞数越多，即该浓度重组人参蛋白处理下对细胞增殖的促进作用越明显。

8.8.4结果

由图6可知，细胞在第4～5天为对数生长期，培养至第6天达到最大活细胞密度，随着营养物质及生存空间的减少，细胞在第7～8天因营养耗竭而凋亡。检测结果表明，重组人参蛋白对人成纤维细胞生长无毒性，可较好的促进人成纤维细胞的生长和增殖，且不同浓度重组人参蛋白的促增殖效果均优于5％胎牛血清，其在细胞生长过程中可起到正向的作用。

由图7可知，培养6天后含240μg/mL重组人参蛋白的样品组细胞数大于空白对照组，即重组人参蛋白可以明显促进人成纤维细胞贴壁和生长。

9.重组人参蛋白细胞划痕实验

9.1物料

DMEM培养基(含10％胎牛血清)、PBS、75％酒精、低糖DMEM培养基(含1％胎牛血清)、细胞培养瓶、6孔板、移液枪、离心管、酒精灯、1mL注射器、0.22μL滤膜、钢尺、marker笔。

9.2设备

液氮罐、超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、酶标仪。

9.3方法

(1)将HFF-1细胞按2.5×10

(2)待细胞长满后，用记号笔比着钢尺在孔板底部每孔各三等份画线做记号。

(3)用枪头垂直划线，加入PBS清洗细胞3次，去除划掉并悬浮的细胞。

(4)加入浓度分别为50μg/mL、25μg/mL的重组人参蛋白样品各2mL，同时设置空白对照为含1％血清的低糖DMEM培养基。培养0、6、20、28小时在显微镜下拍照。

(5)分析数据：用Image-J软件测量划痕面积并计算每组的细胞迁移速率：

细胞迁移速率＝固定划痕区移行细胞的面积/初始划痕区面积×100％

9.4结果

由图8、图9可知，低浓度(25μg/mL和50μg/mL)重组人参蛋白在0h～28h均具有促进细胞迁移的作用，且两种浓度下在6h～28h内与空白对照相比具有极显著差异(P＜0.01)。其中，50μg/mL促进迁移效果更佳，说明在细胞水平重组人参蛋白有极强的皮肤修复作用。

10.修护功效实验

10.1实验原理

斑马鱼尾鳍结构简单，易于手术操作、术后不影响生存和便于观察，是研究组织再生过程的重要模型来源。斑马鱼尾鳍再生分为创面愈合、芽基形成、再生结局三个过程，以芽基形成最为关键。鳍再生的细胞有多个来源，包括表皮细胞、纤维母细胞、成骨细胞在内的多种类型细胞促进尾鳍的再生，且这些细胞具有高度的谱系限制性。斑马鱼尾鳍的再生与人类皮肤、骨骼、血管等组织器官的修复作用机制相似。

10.2检测

送重组人参蛋白样品至第三方检测机构，按照《斑马鱼修护功效评价实验标准操作规程》，利用野生型AB品系斑马鱼进行功效检测。

检测时，通过手术刀沿与躯干垂直方向切断尾鳍，以斑马鱼再生的尾鳍面积定量结果来评价样品的修护功效。将斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型组、重组人参蛋白组。正常对照组不做处理，模型组和重组人参蛋白组分别进行切断尾鳍处理，随后重组人参蛋白组中加终浓度为0.024％(0.024g/100mL即240μg/mL)、0.048％(0.048g/100mL即480μg/mL)、0.096％(0.096g/100mL即960μg/mL)的重组人参蛋白溶液，孵育一段时间后，三组斑马鱼分别进行尾鳍拍照，分析斑马鱼尾鳍面积，从而评价修复功效。

10.3结果

由图10及表10-1可知，重组人参蛋白检测浓度为0.096％的条件下，功效值为16％，与模型组相比具有极显著差异(P＜0.001)，经重组人参蛋白样品处理后的斑马鱼再生尾鳍面积与模型组相比明显增加，证明重组人参蛋白有良好的修护作用。

表10-1.修护效果评价

11.抗光老化功效实验

11.1实验原理

紫外线辐射是导致皮肤损伤和老化最主要的外源性环境因素，容易诱导诸如炎症反应、氧化应激(当自由基产生量大于机体清除能力时就发生氧化应激反应，可能会对细胞结构造成严重损害)、DNA损伤等生理作用，甚至破坏胶原蛋白、弹性蛋白的活性结构，外观上表现为皮肤的红肿、色素沉着、松弛和细纹等。斑马鱼鱼鳍类似于人类的四肢，皮肤结构与人类相似，紫外线对斑马鱼鱼鳍的损伤将导致一系列的有害生理作用，外观上表现为尾鳍的萎缩、面积减少。护肤产品功效成分在鱼鳍表面对紫外线的有效吸收，将防止紫外线对鱼鳍造成损伤。故通过紫外线辐射后斑马鱼ROS荧光值变化来检测重组人参蛋白样品所具有的抗光老化功效。

11.2检测

送重组人参蛋白样品至第三方检测机构，按照《斑马鱼修护功效评价实验标准操作规程》，利用野生型AB品系斑马鱼进行功效检测。

检测时，将斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型组、重组人参蛋白组。正常对照组不做处理，模型组和重组人参蛋白组分别进行紫外光多次照射，随后重组人参蛋白组中加终浓度0.096％(0.096g/100mL即960μg/mL)的重组人参蛋白溶液，孵育一段时间后，三组斑马鱼分别进行ROS荧光值测定，分析各组ROS荧光值测定结果，从而评价抗光老化功效。

11.3结果

由图11及表11-1可知，重组人参蛋白检测浓度为0.096％的条件下，功效值为85％，与模型组相比具有显著差异(P＜0.05)，经重组人参蛋白样品处理后的ROS荧光值与模型组相比明显降低，揭示重组人参蛋白有良好的抗光老化作用。

表11-1.样品效果评价