细菌纤维素基羧甲基纤维素钠复合膜及其制备方法和应用

技术领域

本发明一种细菌纤维素复合膜及其制备方法，具体涉及一种细菌纤维素基羧甲基纤维素钠复合膜及其制备方法和应用。

背景技术

细菌纤维素(BC)是由某些微生物在特定前提下产生的，首次提出的是英国人Brown，他在1886年观察到，在木醋杆菌的培养的时候，看到了一层膜呈白色浮在液体表面，经过显微镜的观察与化学方法的分析确定了这个物质与植物纤维素的结构想同都是由β-1,4-糖苷键聚合而成，因为它是微生物发酵形成将其称为BC。

细菌纤维素拥有纯度高、结晶度高、整合度高、吸水性强、抗拉强度好、生物适应性强等特点。因此，它可以在多个方面应用，特别是在医学应用领域。但是研究者发现BC是存在着缺陷的比如：产量低、成本太高、干品加工困难等，这些缺点限制了其的应用发展。因此，对细菌纤维素进行改性复合制备出性能更好的细菌纤维素对于拓展其应用是很重要的。当前对BC改性的方法主要有两个：一是原位复合法，就是将需要复合的化学物质直接加到BC培养基中，改变BC的发酵环境，该方法操作简便，不用额外加入其他溶剂。二是非原位方法指的是在含有BC的溶液中加入待复合的物质，通常包括物理和化学两种方法。与非原位复合法改性方法相比，在微生物发酵的过程中添加复合物制备复合BC，不用使用大量的化学试剂,环保健康,特别适合生物医学范畴的BC材料改性，细菌纤维素作为一种用处广泛的生物材料，具有光明的发展前途，在生物医药材料、食品工业等许多领域都具有重要的利用价值。

BC作为一种很有研究潜力的生物材料，虽然发现很早。但是对其功能特性的研究还处于起步阶段，需要从生物学的角度对其进行深入研究，进一步对其进行改性研究制备细菌纤维素复合，拓展BC在不同领域的应用，当前存在的主要技术障碍是发酵效率低、产量少、成本高、成本比普植物纤维素要高，BC膜形状的控制以及生产工艺问题得不到解决。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的是一种细菌纤维素基羧甲基纤维素钠复合膜及其制备方法和应用，在菌体培养体系中加入不同浓度的CMC-Na，在菌体发酵培养体系中以必要的碳源、氮源、无机盐、木醋杆菌等为原料，制备改性细菌纤维素，原位合成细菌纤维素及羧甲基纤维素钠复合膜，探究羧甲基纤维钠对BC合成的影响并对复合膜的性能进行表征。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种细菌纤维素及羧甲基纤维素钠复合膜的原位制备方法，包括以下步骤：

(1)配制发酵培养基，高压灭菌；

(2)接种木醋杆菌菌种，酵母粉、蛋白胨为培养体系，添加无机盐和葡萄糖，使菌液与培养基充分混匀，静置培养，得到含有木醋杆菌的细菌纤维素膜；

(3)然后向步骤(2)中得到的含有木醋杆菌的细菌纤维素膜中添加羧甲基纤维素钠制备原位复合体系，添加后加热培养基使羧甲基纤维素钠充分溶解，灭菌，静态发酵恒温培养，得到原位细菌纤维素及羧甲基纤维素钠复合膜。

优选的，步骤(1)中发酵培养基成分为：1L蒸馏水中含葡萄糖15-25g，蛋白胨3-7g，酵母粉3-7g，柠檬酸0.5-2.0g，十二水合磷酸氢二钠3.7-9.7g。

优选的，步骤(2)中接种木醋杆菌菌种后恒温培养，得到细菌纤维素膜，然后进行提纯。

优选的，提纯方法为用水冲洗去掉表面的木醋杆菌和培养基，于NaOH溶液中隔水加热，浸泡，再用水冲洗直至膜pH值为中性。

优选的，步骤(2)中木醋杆菌菌种为革兰氏阴性菌，严格好氧细菌，培养温度为27-33℃，pH为5.4-6.3。

优选的，步骤(3)羧甲基纤维素钠与水的质量百分比为0.1％-0.4％。

优选的，步骤(3)中静置培养温度为27-33℃。

本发明的第二个目的是提供上述任一所述制备方法制备得到的细菌纤维素及羧甲基纤维素钠复合膜。

本发明的第三个目的是保护由上述制备方法制备得到的细菌纤维素及羧甲基纤维素钠复合膜在生物医学材料领域的应用。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

1、本发明的细菌纤维素及羧甲基纤维素钠复合膜的原位制备方法，通过添加不同浓度的羧甲基纤维素钠，细菌纤维素的产量明显增加，当羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的浓度为0.4％时产量达到10.15g，为对比例1产量的1.6倍。

2、本发明的细菌纤维素及羧甲基纤维素钠复合膜的原位制备方法，添加的羧甲基纤维素钠是一种水溶性多糖，水解后会作为碳源被木醋杆菌使用从而增加了产量，另一方面，随着CMC-Na的浓度增高，由于CMC-Na具有一定粘度，培养基的粘稠度也会随之上升，粘度会影响培养基中氧气的含量，添加过多的CMC-Na会导致产量的下降。

3、本发明通过在木醋杆菌培养基中添加羧甲基纤维素钠(CMC-Na)来原位合成制备细菌纤维素/羧甲基纤维素钠复合膜(BC-CMC-Na)，FTIR测试说明了CMC-Na成功复合到BC膜里，且复合膜的产量、含水率、热稳定性均有所提升，当CMC-Na添加浓度为0.4％时，产量提高1.6倍，由原来的6.3g增加到10.15g，复合膜表现出更好的稳定性，最大失重温度增加了10℃，CMC-Na的添加制备出的复合膜持水能力得到了大幅度的提高，提高了1.63倍，且CMC-Na的添加影响了BC膜的结晶性能。

附图说明

图1为实施例1、实施例2、实施例3和对比例1CMC-Na添加量对BC产量的影响；

图2为实施例1、实施例2、实施例3和对比例1CMC-Na添加量对产物含水率的影响；

图3为实施例1、实施例2、实施例3和对比例1傅里叶变换红外光谱(FTIR)光谱图；

图4为实施例1、实施例2、实施例3和对比例1XRD衍射图谱；

图5为实施例1、实施例2、实施例3和对比例1TGA热稳定性分析曲线。

具体实施方式

下面结合本发明实施例，用以较佳的实施例及附图配合详细的说明。

实验试剂及仪器

表1试验试剂

表2试验仪器

实施例1

(1)配制发酵培养基

以培养基成分为1L蒸馏水中含葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母粉5g，柠檬酸1.5g，十二水合磷酸氢二钠6.7g配制发酵培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)细菌纤维素膜的制备

将木醋杆菌作为菌种，酵母粉、蛋白胨为培养体系，添加无机盐和葡萄糖，在33℃恒温培养箱中发酵合成细菌纤维素；接种10％的木醋杆菌菌种，置于摇床1h使菌液与培养基充分混匀，放入30℃恒温培养箱静置培养7d后得到在培养基气液界面的BC(含有木醋杆菌)，用清水反复冲洗去掉膜表面的木醋杆菌和培养基，再把细菌纤维素的膜放到0.1mol/L的NaOH溶液中隔水加热，每隔一段时间更换NaOH溶液，去除干净后膜变成乳白色半透明状再用水反复冲洗去除膜上的NaOH，浸泡一段时间，直至膜pH值为中性。

(3)BC-CMC-Na复合膜的原位制备

然后向上述得到的含有木醋杆菌的细菌纤维素膜中添加浓度为0.4％的CMC-Na制备原位复合性体系，添加后加热培养基使CMC-Na充分溶解，然后在121℃条件下灭菌20min，分别在90mm培养皿和100mL锥形瓶中接入10％的菌液，震荡将菌液摇匀然后30℃静态发酵恒温培养，每组实验设置三个平行重复样品。

静态培养一周后，会得到一层BC膜浮在培养液表面，采用与细菌纤维素膜相同的方法进行纯化，纯化完成后将一部分置于60℃干燥箱中烘干至恒重，另外一部分放入蒸馏水保存备用。

实施例2

与实施例1的制备方法相同，不同之处仅在于将CMC-Na的添加浓度由0.4％替换为0.2％。

实施例3

与实施例1的制备方法相同，不同之处仅在于将CMC-Na的添加浓度由0.4％替换为0.1％。

实施例4

(1)配制发酵培养基

以培养基成分为1L蒸馏水中含葡萄糖15g，蛋白胨3g，酵母粉3g，柠檬酸0.5g，十二水合磷酸氢二钠3.7g配制发酵培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)细菌纤维素膜的制备

将木醋杆菌作为菌种，酵母粉、蛋白胨为培养体系，添加无机盐和葡萄糖，在33℃恒温培养箱中发酵合成细菌纤维素；接种10％的木醋杆菌菌种，置于摇床1h使菌液与培养基充分混匀，放入27℃恒温培养箱静置培养7d后得到在培养基气液界面的BC(含有木醋杆菌)，用清水反复冲洗去掉膜表面的木醋杆菌和培养基，再把细菌纤维素的膜放到0.1mol/L的NaOH溶液中隔水加热，每隔一段时间更换NaOH溶液，去除干净后膜变成乳白色半透明状再用水反复冲洗去除膜上的NaOH，浸泡一段时间，直至膜pH值为中性。

(3)BC-CMC-Na复合膜的原位制备

然后向上述得到的含有木醋杆菌的细菌纤维素膜中添加浓度为0.4％的CMC-Na制备原位复合性体系，添加后加热培养基使CMC-Na充分溶解，然后在121℃条件下灭菌20min，分别在90mm培养皿和100mL锥形瓶中接入10％的菌液，震荡将菌液摇匀然后27℃静态发酵恒温培养，每组实验设置三个平行重复样品。

静态培养一周后，会得到一层BC膜浮在培养液表面，采用与细菌纤维素膜相同的方法进行纯化，纯化完成后将一部分置于60℃干燥箱中烘干至恒重，另外一部分放入蒸馏水保存备用。

实施例5

(1)配制发酵培养基

以培养基成分为1L蒸馏水中含葡萄糖25g，蛋白胨7g，酵母粉7g，柠檬酸2.0g，十二水合磷酸氢二钠9.7g配制发酵培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)细菌纤维素膜的制备

将木醋杆菌作为菌种，酵母粉、蛋白胨为培养体系，添加无机盐和葡萄糖，在33℃恒温培养箱中发酵合成细菌纤维素；接种10％的木醋杆菌菌种，置于摇床1h使菌液与培养基充分混匀，放入33℃恒温培养箱静置培养7d后得到在培养基气液界面的BC(含有木醋杆菌)，用清水反复冲洗去掉膜表面的木醋杆菌和培养基，再把细菌纤维素的膜放到0.1mol/L的NaOH溶液中隔水加热，每隔一段时间更换NaOH溶液，去除干净后膜变成乳白色半透明状再用水反复冲洗去除膜上的NaOH，浸泡一段时间，直至膜pH值为中性。

(3)BC-CMC-Na复合膜的原位制备

然后向上述得到的含有木醋杆菌的细菌纤维素膜中添加浓度为0.4％的CMC-Na制备原位复合性体系，添加后加热培养基使CMC-Na充分溶解，然后在121℃条件下灭菌20min，分别在90mm培养皿和100mL锥形瓶中接入10％的菌液，震荡将菌液摇匀然后33℃静态发酵恒温培养，每组实验设置三个平行重复样品。

静态培养一周后，会得到一层BC膜浮在培养液表面，采用与细菌纤维素膜相同的方法进行纯化，纯化完成后将一部分置于60℃干燥箱中烘干至恒重，另外一部分放入蒸馏水保存备用。

对比例1

与实施例1的制备方法相同，不同之处仅在于将CMC-Na的添加浓度由0.4％替换为0％。

本发明的性能测试表征：

1、BC-CMC-Na复合膜的产量和含水量分析

将纯化完成的细菌纤维素浸泡在蒸馏水中直到吸水饱和，吸弃表面水分即为湿膜样品，将其放入干燥箱中60℃烘干至重量不变，得到的膜定义为干膜。含水率(每克纤维素的含水量)的计算公式如下：

2、结晶性能分析(XRD)

采用多晶X-射线衍射仪(德国Bruker公司)，对BC膜的结晶性能进行测试。设定条件为Cu靶，40kV管压，100mA管流，扫描范围为3°-50°通过以下公式，可以计算出复合膜样品的结晶度(C

式中：I

I

3、热稳定性(TGA)测试

热稳定性分析(Thermogravimetry analysis简称TGA)是指在设定的升温速率下，连续测出样品的质量变化与温度之间的关系式的方法。

TGA测试的样品为完全干燥的复合膜，测试环境：N

4、红外光谱(FTIR)测试

采用傅立叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司)，KBr压片，扫描范围为4000cm

结果与分析

1、BC-CMC-Na复合膜的产量分析

图1显示的是不同浓度CMC-Na对BC产量的影响，结果表明CMC-Na的添加提高了BC膜的产量，培养基中CMC-Na的浓度为0、0.1％、0.2％、0.4％产物的产量平均值为6.58g、7.37g、8.65g、9.31g。当CMC-Na的浓度为0.4％时产量达到10.15g是对照组产量的1.6倍，随着CMC-Na的添加产量先升高然后逐渐平稳。产量增加得原因为：CMC-Na是一种水溶性多糖，水解后可能作为碳源被木醋杆菌使用从而增加了产量。另外一方面，随着CMC-Na的浓度增高，由于CMC-Na具有一定粘度，培养基的粘稠度也会随之上升，粘度会影响培养基中氧气的含量，添加过多的CMC-Na可能会导致产量的下降。

2、BC-CMC-Na复合膜的含水量分析

图2显示的是CMC-Na的添加量对细菌纤维素含水率的影响，从数据来看随着CMC-Na添加的浓度增大，产物的含水率(纤维素：水)是逐渐增加的，且含水率从1:38.4提高到1:62.4，说明CMC-Na制备出来的BC具有更高的含水能力，一定程度上提高了BC的含水能力。

3、傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析

FTIR技术可以表征材料的特征化学基团，从而可以判断出BC复合膜中是否成功复合了CMC-Na。如图3所示，BC、BC复合膜的FTIR光谱图显示了材料的特征官能团。约3300cm

4、XRD结晶性能分析

利用XRD表征技术，我们分析了BC膜和不同浓度CMC-Na的BC复合膜的物相结构。如图4所示，BC膜在15°和25°有两个明显结晶峰，BC-CMC-Na复合膜在17°的位置附近开始出现一个较小的峰并且这个峰值的强度随着CMC-Na的浓度增加而增强，表明培养体系中的CMC-Na掺入到了BC膜中从而形成原位复合膜，并且CMC-Na影响了BC的晶体结构。

5、TGA热稳定性分析

通过TGA表征来分析BC膜和不同浓度CMC-Na的BC复合膜的热稳定性，其结果如图5所示。BC膜在300℃到390℃出现了明显的热失重现象，表明BC膜在这个温度范围内发生热分解。BC复合膜在300℃到400℃以上呈现明显的热失重现象，说明BC膜在复合CMC-Na后最大热失重温度上升，热稳定性有所提高。

综上所述，本发明通过在木醋杆菌培养基中添加羧甲基纤维素钠(CMC-Na)来原位合成制备细菌纤维素/羧甲基纤维素钠复合膜(BC-CMC-Na)，研究其对木醋杆菌发酵制备BC的影响,并通过FTIR、XRD、TGA对复合膜进行性能表征。FTIR测试说明了CMC-Na成功复合到BC膜里，且复合膜的产量、含水率、热稳定性均有所提升。

1、当CMC-Na添加浓度为4％，产量提高1.6倍由6.3g增加到10.15g；

2、复合膜表现出了更好的热稳定性，最大失重温度增加了约10℃；

3、CMC的添加制备出的复合膜持水能力得到的大幅度的提高，提高了约1.63倍；

4、CMC的添加影响了BC膜的结晶性能。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。