鉴定气单胞菌的特异性新分子靶标及其快速检测方法

文献发布时间：2023-06-19 19:30:30

技术领域：

本发明属于微生物技术领域以及医药技术领域，具体涉及鉴定气单胞菌的特异性新分子靶标及其快速检测方法。

背景技术：

气单胞菌是一种革兰氏阴性、兼性厌氧的杆状细菌，气单胞菌普遍存在于空气、水体及鱼类中，是一种常见条件致病菌。以往认为气单胞菌对人类危害小，致病性弱，因此对气单胞菌的治疗与防护研究较为匮乏。但近年来，随诊临床诊疗技术的进步，临床上发现许多不明病原体感染实为气单胞菌感染，其中又以嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌最为常见。这些气单胞菌对临床常用的药物如青霉素、头孢、碳青霉素等多种抗生素均呈天然耐药，因此患者在感染后即使及时接受了抗生素治疗，病情仍难以控制，气单胞菌感染极易转为败血症，预后极差。因此，对于气单胞菌的精准、快速检测对于防控气单胞菌感染具有重要的意义。

目前，气单胞菌属的检测主要依据国家标准化管理委员会制定的传统培养方法(GB/T18652-2002、SNT 2695-2010)，该方法需要进行多次选择性培养、在获得单菌落后进行系列的生化鉴定，实验耗时长、操作繁复、成本高，不利于对病原菌的及时检出与鉴定。另外，2019年首都医科大学周妍妍等研究指出，VITEK II的生化鉴定对于气单胞属的鉴定率仅为89.2％，而在种型鉴定上鉴定率为0％，即常规的生化鉴定无法对气单胞菌种型进行良好的区分。近年来，以PCR为基础的分子生物学检测以其快速、简便、准确、费用低等特点，已逐步取代传统培养及生化检测，成为致病微生物的最具潜力的新型检测技术之一。

分子生物学检测方法的关键是寻找微生物特有的核苷酸序列进行检测设计。既往有研究采用NCBI数据库内的部分气单胞菌基因组数据，与相近物种进行比对查找，获得相近物种中不携带的基因序列，继而设计引物进行气单胞菌的检测。这种设计策略由于分析的菌株数量有限，实际应用中存在难以覆盖全部气单胞菌的检出、难以区分气单胞菌与其他非近源微生物等的问题。

2005年，Tettelin等研究者提出了微生物泛基因组的概念(pangenome)，泛基因组即某一物种全部基因的总称。采用高性能计算机/服务器采集某一物种的所有全基因组信息，通过泛基因组分析手段，可获得该物种的核心基因。核心基因是指控制着该种生命体基本新陈代谢的功能，广泛存在于物种的所有个体中，是该物种不可缺少的基因。近年来，应用泛基因组分析获得物种的核心基因，后用核心基因比对数据库内其他物种，继而根据该物种特异的核心基因设计检测引物，已成为更精准的微生物检测方式。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供用于检测及鉴别气单胞菌属及3种常见气单胞菌嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的特异性新靶标及其相应的检测方案。

本发明根据原核生物泛基因组自动化分析软件(Pan-Genomics AnalysisPipeline，PGAP)中的MP方案获得气单胞菌属及3种常见气单胞菌的核心基因组信息。根据NCBI数据库及发明人分离检测的全部气单胞菌属及3种常见气单胞菌基因组信息，提取气单胞菌属及3种常见气单胞菌特有基因的蛋白序列，后通过Blast分析比对NCBI数据库中非冗余蛋白数据库，去除能比对至其它物种基因的蛋白序列，获得气单胞菌属及3种常见气单胞菌的特异性分子靶标，包括核苷酸序列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4，用于识别样本中是否存在气单胞菌属及3种常见气单胞菌。

本发明提供了一组用于检测气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的分子靶标，所述的气单胞菌属(Aeromonas)的分子靶标核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的分子靶标核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的分子靶标核苷酸序列如SEQ.ID No.3所示，豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的分子靶标核苷酸序列如SEQ.ID No.4所示。

本发明还提供了一组用于检测气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的引物组，所述的引物组包括：检测气单胞菌的引物包括SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的引物；检测嗜水气单胞菌的引物包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物；检测维氏气单胞菌的引物包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的引物；检测豚鼠气单胞菌的引物包括SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物。

本发明还提供了一种检测气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的方法，提取样品的DNA，然后用上述用于检测气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的引物组分别进行PCR扩增，如获得条带大小为127bp，则含有气单胞菌；如获得条带大小为386bp，则含有嗜水气单胞菌；如获得条带大小为333bp，则含有维氏气单胞菌；如获得条带大小为259bp，则含有豚鼠气单胞菌。

优选地，所述的PCR反应体系为2×PrimeSTAR Max Premix 12.5μL，正向引物10μmol/L 1μL，反向引物10μmol/L 1μL，模板DNA 2.5ng/μL 1μL，ddH

优选地，所述PCR反应程序为98℃预变性3min；98℃变性10s、60℃退火5s、72℃延伸5s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

本发明还提供了一种对气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌进行定量的qPCR检测方法，包括如下步骤：

(1)应用上述用于检测气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的引物组分别绘制气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的标准曲线；

(2)应用上述用于检测气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的引物组对样本进行qPCR扩增，获得样本的ct值，根据标准曲线计算该样品中含气单胞菌属、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌或豚鼠气单胞菌的含量。

优选地，所述的qPCR扩增体系为：2×SYBR Green Premix反应液5μL，待测模板DNA1uL，10μmol/L引物各0.5μL，灭菌双蒸水3μL。

优选地，所述的qPCR反应程序两步法PCR反应程序：95℃预热30s；两步法扩增95℃5s、60℃退火30s，共进行40个循环。

本发明还提供了一种检测气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的试剂盒，其包括上述用于检测气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的引物组。

优选地，所述的试剂盒还包括：2×PCR Mix、模板DNA和DEPC水。

本发明还提供上述用于检测气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的分子靶标、用于检测气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的引物组在检测气单胞菌属及嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌中的应用。

本发明的有益效果：

本发明公开了用于鉴别气单胞菌属及3种常见致病性气单胞菌菌种——嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌及豚鼠气单胞菌的特异性检测靶标及相关的检测方法，与现有技术相比，本发明的检测方法具有检测时间短、操作简便、准确度高、费用低廉且无需经过微生物培养等试验即可在样本中检测气单胞菌属以及3种常见致病性气单胞菌菌种的存在，具有高度实用性；本发明的特异检测靶标具有单一的特异性，检测结果特异，结果判断简单；本发明既可定性、又可定量判断样本中气单胞菌属以及3种常见致病性气单胞菌的存在，应用范围广。

本发明采用泛基因组方法获得气单胞菌属及属内3个常见致病菌种的特异性核心基因，设计获得能灵敏检测气单胞菌属及3个常见致病菌种的特征引物，同时该方法能快速、简便地区分气单胞菌及其它微生物菌株。本发明具有操作简便快捷、特异性高、可定量、检测费用低廉的优点。

附图说明：

图1是根据泛基因组学分析获得的气单胞菌属的热图，左侧为根据气单胞菌属内32个种的代表性全基因组序列构建的进化树；右侧热图为个株气单胞菌的基因有(黑色)或无(白色)状态。据分析发现气单胞菌属有845个核心基因。

图2是本发明对气单胞菌属及3种常见气单胞菌的检测情况，A.气单胞菌属特异引物对6株气单胞菌属菌株及18株非气单胞菌属菌株的检出情况：可见应用特异引物检测6株不同种的气单胞菌(G1-G6)，在127bp处均出现明亮条带，而应用特异引物检测18株非气单胞菌属的菌株(G7-G24)，均未在127bp处检出条带；B.嗜水气单胞菌特异引物对3株嗜水气单胞菌菌株及21株非嗜水气单胞菌菌株的检出情况：可见应用特异引物检测3株不同分离来源的嗜水气单胞菌(H1-H3)，在386bp处均出现明亮条带，而应用特异引物检测3株维氏气单胞菌(H4-H6)、3株豚鼠气单胞菌(H7-H9)及15株非气单胞菌属的菌株(H10-H24)，均未在386bp处检出条带；C.维氏气单胞菌特异引物对3株维氏气单胞菌属菌株及21株非维氏气单胞菌属菌株的检出情况：可见应用特异引物检测3株不同分离来源的维氏气单胞菌(V1-V3)，在333bp处均出现明亮条带，而应用特异引物检测3株嗜水气单胞菌(V4-V6)、3株豚鼠气单胞菌(V7-V9)及15株非气单胞菌属的菌株(V10-V24)，均未在333bp处检出条带；D.豚鼠气单胞菌特异引物对3株豚鼠气单胞菌属菌株及21株非豚鼠气单胞菌属菌株的检出情况：可见应用特异引物检测3株不同分离来源的豚鼠气单胞菌(C1-C3)，在259bp处均出现明亮条带，而应用特异引物检测3株嗜水气单胞菌(C4-C6)、3株维氏气单胞菌(C7-C9)及15株非气单胞菌属的菌株(C10-C24)，均未在259bp处检出条带。

图3是本发明对含气单胞菌属及3种不同气单胞菌样品的定量检测，采用本发明提供的qPCR检测方案对含不同气单胞菌属及3种常见气单胞菌菌落数的样品进行定量检测：A(1)结果提示当样本中气单胞菌属菌落浓度≥1×10

具体实施方式：

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1基于泛基因组学的气单胞菌属及3种常见气单胞菌的检测靶标挖掘

下载NCBI中GenBank数据库内及发明人团队前期建立的气单胞菌全基因组数据库，涵盖了气单胞菌属内32个种的基因组序列共989基因组序列。采用Prokka软件(v1.13)注释后，采用泛基因组分析软件Roary将相似度≥85％的功能基因聚类为同一基因簇，并生成所分析的全部基因组的矩阵列表，如附图1所示。认为矩阵列表中所有气单胞菌共有的基因为气单胞菌属的核心基因组；所有嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌或豚鼠气单胞菌共有的基因为该种气单胞菌的核心基因组。提取气单胞菌属或3种常见气单胞菌的核心基因的核苷酸序列，比对NCBI非冗余蛋白数据库，去除在其它物种存在的序列，剩下的则为气单胞菌属及3种常见气单胞菌的潜在特异性分子靶标。应用NCBI数据库Primer-BLAST对潜在的特异性分子靶标进行引物设计，获得相应检测引物及检测目标片段。将检测目标片段再次比对NCBI非冗余基因数据库，去除在其它物种存在相似度>85％的序列，获得适用于分子检测的菌种特异性分子靶标。后续将所筛选靶标应用于实际样品中检测，选取在实际样品中仍具备良好检测特异性及敏感性的靶标作为检测气单胞菌属及3种常见气单胞菌的特异性分子靶标。

根据上述流程，获得气单胞菌属的核心编码基因845个、嗜水气单胞菌的核心编码基因2024个、维氏气单胞菌的核心编码基因1872个、豚鼠气单胞菌的核心编码基因2111个。进行进一步筛选及验证分析，获得具有特异鉴定气单胞菌属及3种常见气单胞菌的特异性分子靶标序列SEQ ID No.1～SEQ ID NO.4，即气单胞菌属(Aeromonas)的特异性识别核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的特异性识别核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的特异性识别核苷酸序列如SEQ.ID No.3所示，豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的特异性识别核苷酸序列如SEQ.IDNo.4所示。

实施例2气单胞菌属及3种常见气单胞菌的新检测靶标快速检测方法的建立

(1)本实施例提供了一种检测气单胞菌属及3种常见气单胞菌的方法，具体操作如下：

根据实施例1获得的气单胞菌属及3种常见气单胞菌特异性检测靶标SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4，采用Primer-BLAST软件设计能特异性扩增目标靶标并获得目标片段的引物SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.12，如表1所示，获得快速检测方法，包括以下步骤：

表1 HP特异性PCR检测引物序列

PCR检测体系及扩增程序：

采用微生物基因组DNA提取试剂盒(环凯，中国)提取待测的微生物基因组DNA，后加入气单胞菌属或3种常见气单胞菌的PCR检测反应体系中。气单胞菌属或3种常见气单胞菌的PCR反应体系配置如下：

以下为PCR反应条件如下：

PCR结束后取5μL PCR产物进行1.5％琼脂糖电泳。若电泳结果显示扩增产物在目标条带处出现单一扩增条带，则说明样本中含有检测对应的菌属或者菌种；若没有出现相应的单一扩增条带，则样本中不含有检测对应的菌属或者菌种。本发明中，检测气单胞属的目标条带大小为127bp，送一代测序可获得如SEQ ID NO.1下划线段序列所示的核苷酸序列；检测嗜水气单胞的目标条带大小为386bp，送一代测序可获得如SEQ ID NO.2下划线段序列所示的核苷酸序列；检测维氏气单胞的目标条带大小为333bp，送一代测序可获得如SEQ ID NO.3下划线段序列所示的核苷酸序列；检测豚鼠气单胞的目标条带大小为259bp，送一代测序可获得如SEQ ID NO.4下划线段序列所示的核苷酸序列。

(2)气单胞菌属特异性新检测靶标快速检测方法的敏感性、特异性评价

采用上述步骤(1)的方案(引物Aer_F和Aer_R)对6株不同分离来源、不同种的气单胞菌分离株及18株其它常见的非气单胞菌属致病菌进行检测，电泳结果如附图2A所示，结果判读如表2所示。

表2气单胞菌属特异性新检测靶标的检测结果

(3)嗜水气单胞菌属特异性新检测靶标快速检测方法的敏感性、特异性评价

采用上述步骤(1)的方案(引物Hydro_F和Hydro_R)对3株不同分离来源的嗜水气单胞菌分离株、3株不同分离来源的维氏气单胞菌分离株、3株不同分离来源的豚鼠气单胞菌分离株及15株其它常见的非气单胞菌属致病菌进行检测，电泳结果如附图2B所示，结果判读如表3所示。

表3嗜水气单胞菌属特异性新检测靶标的检测结果

(4)维氏气单胞菌属特异性新检测靶标快速检测方法的敏感性、特异性评价

采用上述步骤(1)的方案(引物Vero_F和Vero_R)对3株不同分离来源的维氏气单胞菌分离株、3株不同分离来源的嗜水气单胞菌分离株、3株不同分离来源的豚鼠气单胞菌分离株及15株其它常见的非气单胞菌属致病菌进行检测，电泳结果如附图2C所示，结果判读如表四所示。

表四维氏气单胞菌属特异性新检测靶标的检测结果

(5)豚鼠气单胞菌属特异性新检测靶标快速检测方法的敏感性、特异性评价

采用上述步骤(1)的方案(引物是Cavi_F和Cavi_R)对3株不同分离来源的豚鼠气单胞菌分离株、3株不同分离来源的嗜水气单胞菌分离株、3株不同分离来源的维氏气单胞菌分离株及15株其它常见的非气单胞菌属致病菌进行检测，电泳结果如附图2D所示，结果判读如表五所示。

表5豚鼠气单胞菌属特异性新检测靶标的检测结果

实施例3气单胞菌属及3种常见气单胞菌特异性新检测靶标的定量检测方法

(1)本实施例提供了一种对样本中气单胞菌属及3种常见气单胞菌进行定量检测的方法，采用SEQ.ID No.5～SEQ ID NO.12作为qPCR扩增反应的引物，具体操作如下：

气单胞菌属(Aeromonas)识别特异性核苷酸的引物

正向引物序列SEQ.ID No.5

5’-CCCGGACGTTTTCGTTCACT-3’

反向引物序列SEQ.ID No.6

5’-AGCAGTTACGTTCTCAGCCT-3’

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)识别特异性核苷酸的引物

正向引物序列SEQ.ID No.7

5’-CACCTGACCAAGGAGCGAC-3’

反向引物序列SEQ.ID No.8

5’-AAGATGAGGGTGAACGGCAG-3’

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)识别特异性核苷酸的引物

正向引物序列SEQ.ID No.9

5’-ATGGTCAATGCGGTATGGGG-3’

反向引物序列SEQ.ID No.10

5’-TCCCGGATGTAGTGACCAGT-3’

豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)识别特异性核苷酸的引物

正向引物序列SEQ.ID No.11

5’-CCGTGAGTTGCCAGACCC-3’

反向引物序列SEQ.ID No.12

5’-CAGAGGGTGAGGTGCAGTC-3’。

①模板DNA制备：采用微生物DNA提取试剂盒提取含气单胞菌样本中的微生物DNA，作为待检测模板；

②qPCR检测体系及扩增程序：

qPCR检测所需的DNA模板制备方法采用实施例1中的组织微生物DNA提取方案执行。HP的qPCR反应体系配置如下：

以下为qPCR扩增程序：

③qPCR结果读取：

利用Roche Light

(2)新检测方案对气单胞菌属或3种常见气单胞菌检测灵敏度评价

应用生理盐水将浓度为1×10

绘制标准曲线：以样品中气单胞菌属及3种常见气单胞菌浓度的对数为横坐标，以相应的qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为气单胞菌属及3种常见气单胞菌定量检测的标准曲线。标准曲线如附图3A(2)、附图3B(2)、附图3C(2)及附图3D(2)所示，引物对样本中气单胞菌属及3种常见气单胞菌的检测限为1×10

(3)实际样本中气单胞菌属或3种常见气单胞菌qPCR定量检测

采集被气单胞菌污染的鱼肉样品1g，使用样品微生物DNA提取试剂盒提取鱼肉中的微生物DNA，后按实施例3(1)进行qPCR检测。采用气单胞菌属特异引物进行qPCR检测，发现检测样本的Ct值为23.30±0.03，根据标准曲线计算可知该样品中含气单胞属菌量为1×10

1.气单胞菌属(Aeromonas)的特异性识别核苷酸序列

SEQ.ID No.1

ATGTCTAACATGATCACCGGTACCGTTAAGTTTTTCAACGAAACCAAAGGTTTTGGCTTCATCCAGCAAGAAAACGG

2.嗜水气单胞菌属(Aeromonas hydrophila)的特异性识别核苷酸序列

SEQ.ID No.2

ATG

3.维氏气单胞菌属(Aeromonas veronii)的特异性识别核苷酸序列

SEQ.ID No.3

GTGCCACACTCTGACGCCATCCCCGCTTCCCGGCCATTGAACGACCAGCACGCCCGCGCTCGGGCTGCCTTTGTGGCGCGTCTCAAACCCGGGGCTCACCTGCTCA

4.豚鼠气单胞菌属(Aeromonas caviae)的特异性识别核苷酸序列

SEQ.ID No.4

TTGATGAACGGGGCGAGCATGATTTTGCAACAACGCGCGGCGACACGACTCCTGCTGCTGGTCTGCCTGCTGGTGCTCAATTGCGCGGCCCAGCCTCTGGCCCGCCTCGCCCTGCTCGATCACG

5.气单胞菌属(Aeromonas)识别特异性核苷酸的引物