一种木薯MeANR-VIGS系统及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种木薯MeANR-VIGS系统及其应用。

背景技术

木薯(Manihot esculenta Crantz，Cassava)是世界三大薯类、六大粮食作物之一，全球约10亿人口的主要粮食。由于木薯块根收获时受到创伤胁迫，在24-72h便在其周围部位出现褐变或者青褐变，是木薯块根特有的一种生理现象，称为采后腐烂(PPD)，严重影响木薯食用、加工及产品性能，给农民和淀粉及燃料乙醇加工企业造成严重的经济损失，阻碍木薯产业的进一步发展。据统计，每年亚洲、拉丁美洲和加勒比海地区及非洲因木薯PPD所造成的经济损失分别为8％、10％和29％，直接经济损失超过2亿美元以上。木薯PPD已成为制约产业发展的重大瓶颈。

至今尚未有一种行之有效的方法可用于抑制木薯PPD发生。目前普遍采用隔绝外界空气(如蜡封或套袋隔绝氧气)、地下储存、装在有杀菌剂的袋子和冷藏保存(2-4℃)等方法保存木薯块根，但这会导致木薯原材料成本的增加，不适于规模化加工企业，不利于鲜薯消费。因此，解析木薯块根PPD产生的分子机制，选育块根耐PPD的木薯品种，调节和延缓PPD的发生，是木薯块根综合利用的研究热点，也是全球木薯育种家面临的挑战。木薯叶片中含有丰富的抗氧化物质，其中花青素(以矢车菊素计)高达124.0mg/hg。花青素(anthocyanidin)又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，它广泛存在于植物的花、果实、茎、叶、根等器官，花青素使花瓣呈现五彩缤纷的颜色。花青素合成受多个基因及转录因子的调控，但目前在木薯上的研究报道十分少见。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种木薯MeANR-VIGS系统及其应用。

本发明的第一个方面是提供核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的木薯MeANR基因的沉默片段。

本发明的第二个方面是提供含有核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的沉默片段的重组载体。

构建重组载体的原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pCsCMV-NC，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述重组载体为含有核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的沉默片段的pCsCMV-NC重组质粒。

本发明的第三个方面是提供一种木薯MeANR-VIGS系统，其特征在于，其含有本发明第二个方面所述的重组载体。

本发明的第四个方面是提供含有本发明第二个方面所述重组载体的宿主菌。

本发明的第五个方面是提供本发明第一个方面所述的沉默片段、或者第二个方面所述的重组载体、或者第三个方面所述的木薯MeANR-VIGS系统、或者第四个方面所述的宿主菌、或者木薯MeANR基因、或者含有木薯MeANR基因编码区的重组载体或宿主菌在沉默MeANR基因中的应用。

本发明的第六个方面是提供本发明第一个方面所述的沉默片段、或者第二个方面所述的重组载体、或者第三个方面所述的木薯MeANR-VIGS系统、或者第四个方面所述的宿主菌、或者木薯MeANR基因、或者含有木薯MeANR基因编码区的重组载体或宿主菌在提高木薯叶片花青素含量中的应用。

本发明的第七个方面是提供本发明第一个方面所述的沉默片段、或者第二个方面所述的重组载体、或者第三个方面所述的木薯MeANR-VIGS系统、或者第四个方面所述的宿主菌、或者木薯MeANR基因、或者含有木薯MeANR基因编码区的重组载体或宿主菌在提高植物耐腐性中的应用。

本发明的第八个方面是提供本发明第一个方面所述的沉默片段、或者第二个方面所述的重组载体、或者第三个方面所述的木薯MeANR-VIGS系统、或者第四个方面所述的宿主菌、或者木薯MeANR基因、或者含有木薯MeANR基因编码区的重组载体或宿主菌在提高木薯块根耐腐性中的应用。

本发明的第九个方面是提供本发明第一个方面所述的沉默片段、或者第二个方面所述的重组载体、或者第三个方面所述的木薯MeANR-VIGS系统、或者第四个方面所述的宿主菌、或者木薯MeANR基因、或者含有木薯MeANR基因编码区的重组载体或宿主菌在调控植物表型中的应用。

优选地，所述植物为木薯。

将本发明的沉默片段转染木薯后，植株地上部分生物量显著上升，而地下块根中须根数量增多，株高差异不显著。

本发明的第十个方面是提供本发明第一个方面所述的沉默片段、或者第二个方面所述的重组载体、或者第三个方面所述的木薯MeANR-VIGS系统、或者第四个方面所述的宿主菌、或者木薯MeANR基因、或者含有木薯MeANR基因编码区的重组载体或宿主菌在提高植株地上部分生物量、和/或增加地下块根中须根数量中的应用。所述植物优选为木薯。

本发明的有益效果如下所示：

本发明采用木薯MeANR基因的特异性沉默片段构建沉默体系，能够有效沉默目标基因MeANR，而且还能够有效提高植物花青素含量，同时可显著提高植物耐腐性、改善植物表型等，例如将本发明的沉默片段转染木薯后，MeANR基因的表达被抑制，木薯叶片中花青素含量显著上升，同时采后木薯块根的腐烂速度明显降低，提高了木薯块根的耐采后腐烂能力，而地上部分生物量显著上升，而地下块根中须根数量增多。本发明为提高其他植物花青素含量、抗腐烂能力、改善表型等提供了研究思路和技术依据，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为木薯华南9号(SC9)、花叶木薯及紫叶木薯的成熟叶片形态。其中，A-C依次为木薯华南9号、花叶木薯及紫叶木薯。

图2为不同木薯品种中MeANR基因的PCR电泳结果。其中，M：DL5000 marker，1：SC9,2：花叶木薯，3：紫叶木薯。

图3为MeANR基因亚细胞定位结果。

图4为MeANR沉默株系叶片表型。其中，CsCMV-NC为pCsCMV-NC空载质粒转染植株，CsCMV-ANR-1、CsCMV-ANR-2、CsCMV-ANR-3为pCsCMV-ANR重组载体转染植株。

图5为沉默株系中MeANR的相对表达情况。其中，CsCMV-NC为pCsCMV-NC空载质粒转染植株，CsCMV-ANR-1、CsCMV-ANR-2、CsCMV-ANR-3为pCsCMV-ANR重组载体转染植株。

图6为植后3个月木薯整株表型。

图7为沉默株系块根采后腐烂情况观察结果。

图8为本发明扩增的SEQ ID No：1所示木薯MeANR基因序列，与数据库中不一致的碱基以阴影显示。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一、木薯MeANR基因(Manes.16G016400)的获得

分别以三种不同颜色木薯华南9号(SC9)、花叶木薯及紫叶木薯叶片(其成熟叶片形态如图1所示)cDNA为模板，采用表1中的引物，进行PCR扩增反应，PCR反应体系(Mix 25μl)：cDNA 2μl，10μM引物F 0.5μl，10μM引物R 0.5μl，ddH

将PCR产物进行电泳检测(电泳图如图2所示)，切胶回收，参照南京诺唯赞生物科技股份有限公司快速克隆试剂盒(C601)将回收产物连接到T载上，转化检测出阳性克隆后送至北京擎科生物科技有限公司测序，测序正确的菌液提取质粒后备用。通过PCR方法扩增获得的含有碱基序列1041bp的片段，其在不同木薯品种SC9、花叶木薯和紫叶木薯中的序列如SEQ ID No：1所示。SC9、花叶木薯和紫叶木薯叶片中ANR序列一致，均有8个碱基与Phytozome数据库中公布序列不一致，与数据库中不一致的碱基在图8中以阴影显示。

表1木薯MeANR基因的全长扩增引物

二、木薯MeANR的亚细胞定位

根据MeANR基因CDS序列设计引物(表2)，以阳性克隆质粒为模板进行扩增，进行PCR扩增。PCR反应体系为2Mix 25μl，质粒1μl，10μM引物F 0.5μl，10μM引物R 0.5μl，ddH

扩增产物经切胶回收纯化后使用Nimble Cloing Mix试剂将其连接pNC-Green-SubN表达载体中，构建植物表达载体pNC-Green-SubN-MeANR，然后转化大肠杆菌感受态细胞，37℃过夜培养。挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液送至北京擎科生物科技有限公司测序。经测序比对分析后，选取正确的阳性克隆质粒转化农杆菌GV3101-psoup感受态细胞，使用瞬时转化法分别将pNC-Green-SubN-ANR和空载pNC-Green-SubN(对照)转入烟草叶片中。3天后使用激光共聚焦显微镜(TCS SP8，徕卡)观察荧光信号在烟草叶片细胞中的分布情况。结果如图3所示，MeANR定位在叶绿体中，与网站预测结果一致。

表2 MeANR的亚细胞定位引物

注：小写字母为接头序列，大写字母为基因引物。

三、病毒诱导基因沉默(VIGS)及qRT-PCR验证

通过VIGS-Tool在线软件筛选300bp MeANR的特异性片段，300bp MeANR DNA片段如SEQ ID NO：2所示。用PrimerPrimer5.0设计特异性扩增引物，并引物两端加20bp NC载体的通用接头序列。其扩增引物见表3。

采用表3所示引物，以阳性克隆质粒为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为2Mix 25μl，质粒1μl，10μM引物F 0.5μl，10μM引物R 0.5μl，ddH

回收扩增产物。使用Nimble Cloing Mix试剂将其连接到pCsCMV-NC载体中。先将PCR回收产物与pCsCMV-NC空载质粒混合，加入5ul Mix，用移液枪吹打10-20次，充分混匀，50℃反应30-60min后，将2-5ul反应产物转化大肠杆菌感受态DH5α，后挑取单克隆进行培养、菌液PCR鉴定、阳性克隆测序，若最终测序结果比对正确则表示载体构建完成，得到含MeANR基因片段的pCsCMV-MeANR重组载体。

将构建好的重组载体转化到GV3101-pSoup-p19农杆菌感受态中，经PCR检测正确后，将菌液在28℃培养箱中扩大培养，OD600值达到08-1.0后，于5000rpm离心10min收集菌体，用含有10mM MES、10mM MgCl

使用注射器将菌液注入木薯叶片背面，置于室温生长25天后(其表型如图4)，与对照相比，CsCMV-ANR沉默植株(pCsCMV-ANR重组载体转染植株)新生叶片颜色变紫，且每个重复间紫色程度不同。

提取叶片总RNA，经过反转录后获得cDNA，利用测序引物CsCMV-F:TGGGCGCTAATTAGTTTACTGCA，CsCMV-R:GGTCAAGACGGCTCAACTCTTCA检测正确后，以MeActin为内参基因，使用MeANR定量引物(表4)，通过实时荧光定量PCR检测沉默株系中MeANR的表达情况。qRT-PCR采用TaKaRa公司生产的SYBR试剂盒(RR820A)，按说明在Thermo FisherScientific公司生产的Real-time Thermal Cycler上操作。反应程序为：95℃预变性30s；95℃10s，55℃10s，72℃20s，40个循环。每个样品重复3次，相对表达量按ΔΔC

表3 MeANR的VIGS沉默引物

注：小写字母为接头序列，大写字母为基因引物。

表4木薯MeANR的实时荧光定量PCR引物

注：小写字母为接头序列，大写字母为基因引物。

表5木薯MeANR沉默株系中目标基因相对表达情况

注：同一行内标以不同大写字母的值在0.01水平上差异显著。

四、沉默植株叶片花青素含量测定

叶片中总花青素含量测定参照试剂盒分光法(G0126F，格锐思，苏州)，具体操作如下所示：称取新鲜的木薯叶片约0.1g，加入1mL提取液，75℃震荡提取25min，室温12000rpm，离心10min，上清液待测。可见分光光度计预热30min以上，用蒸馏水调零。在EP管中依次加入测定管(上清液200μl，试剂一600μl)，对照管(上清液200μl，试剂二600μl)，室温避光平衡60min，取全部澄清液体至比色皿中，于530nm和700nm处读值。测定管记作A测定＝A

表6木薯MeANR沉默株系叶片总花青素含量测定

注：同一行内标以不同大写字母的值在0.01水平上差异显著。

五、沉默植株块根采后腐烂能力观察

沉默植株于大田种植3个月后收获，其整株表型如下图6所示。从收获后植株可以明显看出，与对照相比，沉默MeANR后，地上部分生物量显著上升，而地下块根中须根数量增多，株高差异不显著。收获其块根用于采后腐烂观察，具体操作如下：将块根中部取约5mm的薄片置于25℃，湿度40％的恒温箱放置，分别于12h，24h，48h,72h观察腐烂状况并拍照，其表型如图7所示。用Image J软件计算块根的腐烂面积，结果如表7所示。由图7可见对照CsCMV-NC在放置12h便出现轻微的采后腐烂，在块根的外围出现黄色斑点，在24h时更明显，且随着放置时间的延长，采后腐烂面积逐渐提高，而沉默MeANR后，块根在放置24h时才出现轻微的采后腐烂，且在48h和72h时腐烂面积均低于对照(表7)。可见沉默MeANR后可显著提高木薯块根的耐采后腐烂能力。

表7木薯MeANR沉默株系块根采后腐烂面积

注：同一行内标以不同大写字母的值在0.01水平上差异显著。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。